铁皮石斛质量标准.doc

【石斛质量标准正文】石斛Shi hu Caulis Dendrobi本品为兰科植物金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.铁皮石斛Dendrobium candidum Wall.ex Lindl. 或马鞭石斛Dendrobium fimbriatum Hook.var.oculatum Hook.的新鲜或干燥茎。全年均可采收，鲜用者除去根及泥沙；干用者采收后，除去杂质，用开水略烫或烘软，再边搓边烘晒，至叶稍搓净，干燥。铁皮石斛剪去部分须根后，边炒边扭成螺旋形或弹簧状，烘干，习称“铁皮枫斗（耳环石斛）”。 【性状】 鲜石斛 呈圆柱形或扁圆柱形，长约30cm，直径0. 41. 2cm。表面黄绿色， 光滑或有纵纹，节明显，色较深，节上有膜质叶稍。肉质，多汗，易折断。气微，味微苦而回甜，嚼之有黏性。 金钗石斛 呈扁圆柱形，长2040cm，直径0. 40. 6cm，节间长2. 5 3cm。表面金黄色或黄中带绿色，有深纵沟。质硬而脆，断面较平坦。味苦。铁皮枫斗 呈螺旋形或弹簧状，一般为24个旋纹，茎拉直后长3. 58cm ，直径0. 20. 3cm。表面黄绿色，有细纵皱纹，一端可见茎基部留下的短须根。质坚实，易折断，断面平坦。嚼之有黏性。 马鞭石斛 呈长圆锥形，长40120cm ，直径0. 50. 8cm，节间长3 4.5cm。表面黄色至暗黄色，有深纵槽。质疏松，断面呈纤维性。味微苦。【鉴别】横切面： 金钗石斛 表皮细胞1列，扁平，外被鲜黄色角质层。基本组织细胞大小较悬殊，有壁孔，散在多数外韧型维管束，排成78圈。维管束外侧纤维束新月形或半圆形，其外侧薄壁细胞有的含类圆形硅质块，木质部有13个导管直径较大。含草酸钙针晶细胞多见于维管束旁。铁皮枫斗 表皮细胞外壁及侧壁稍增厚、微木化。维管束略排成45圈，外侧小型薄壁细胞种有的含硅质块。含草酸钙针晶束细胞多见于近表皮处。马鞭石斛 表皮细胞扁圆形，外壁及侧壁增厚，木化，有层纹。基本组织细胞大小相近，有壁孔，维管束略排成34圈。【检查】 水分 照水分测定法测定，不超过6.0%总灰分 不超过6.0%灰屑 不超过3.0%败片率 不超过1.0%破碎率 不超过3.0%【含量测定】按照高效液相色谱法测定。色谱条件：色谱柱为Kromasil RKR100-5C18(250 mm4.6 mm,5m);流动相为乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)进行线性梯度洗脱,05 min3%A10%A,512 min 10%A15%A,1225min 15%A22%A,2540 min 22%A35%A,4050 min 35%A55%A,5060 min 55%A60%A;体积流量:1.0 mL/min;检测波长270 nm;柱温30;运行时间为60 min对照品溶液的制备 精密称取石斛碱对照品15.45 mg，置5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得石斛碱对照品母液。精密量取1mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液，备用（对照品溶液质量浓度：123.6mgL-1）。对照液的制备 对照品溶液的制备 取DextranT系列标准分子量葡聚糖用蒸馏水配成适当浓度的溶液，过微孔滤膜，即得标准溶液。供试品溶液的制备 取铁皮石斛药材,50干燥4 h,粉碎,过60目筛。取药材粉末1 g,精密称定,置于索氏提取器中,加甲醇50 mL水浴回流4 h,提取液挥去部分溶剂,冷却,加甲醇定容至10 mL,用0.45m微孔滤膜滤过,滤液作为供试品溶液测定法 取标准溶液通过HPLC进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲。 本品按干燥品计算，含多糖的量不得少于11.48%。【炮制】干品除去残根，洗净，切段，干燥。鲜品细净，切断。酒炒。 【性味与归经】甘，微寒。归胃、肾经。 【功能与主治】益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。 【用法与用量】612g，鲜品1530g。入复方宜先煎，单用可久煎。【贮藏】干品置通风干燥处，防潮；鲜品置阴凉潮湿处，防冻。【石斛质量标准起草说明】（一） 概述石斛收载于中国药典（05年版），原标准中无定量方法，对铁皮石斛药材的质量控制仍停留在简单的性状鉴别1,这远远不能实现对铁皮石斛药材进行全面的质量控制根据药典会有关文件的要求，对该品种质量标准进行提高。据文献报道，国际上传统药用石斛以金钗石斛为主，但近年来研究结果发现铁皮石斛的总多糖、水溶性多糖含量在三种石斛属植物中是最高的。铁皮石斛主要有效成份是石斛多糖和石斛碱，铁皮石解多糖由D一木糖、L一阿拉伯糖和-D葡萄糖组成。研究表明，多糖成分与铁皮石斛的药效，如增强肌体免疫机能、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降血糖等方面，有着密切的联系。故采用石斛多糖作为铁皮石斛含量测定的指标。（二）质量标准起草说明 1、来源石斛属植物是我国重要的传统中药材，药用价值历代为人们所推崇。而铁皮石斛为石斛之上品，因其特殊的生存环境和卓著的滋补功效而名列“中华九大仙草”之首。铁皮石斛是多年野生植物，生是在岩石峭壁上，分布在我国的西南部，广西、云南、贵州等山区;中南地区的湖南、江西、广东以及福建浙江等省。2、性状中国药典（2005版）规定为嚼之有黏性，经实样比较，本品改为气微，味淡，嚼之有粘，汁多无渣 较合适。3、鉴别 （1）铁皮石斛的显微鉴别：表皮细胞外壁及侧壁稍增厚、微木化。维管束略排成45圈，外侧小型薄壁细胞种有的含硅质块。含草酸钙针晶束细胞多见于近表皮处。显微特征图如下：（2）薄层色谱法鉴别：原标准中无此鉴别方法。在此添加此方法鉴别，方法如下：供试品溶液制备:取以上各样粗粉0. 5g，分别置25mL带塞三角瓶中，各加浓氨水6滴，使粉末润湿，密塞放置15min，各加氯仿5mL冷浸过夜，再于50温浸6h，放冷滤过，滤液浓缩至干，加氯仿0. 1mL溶解，做为供试品溶液。取以上各样供试品溶液各10uL，点于0. 5%CMC-Na硅胶G板上，置于氨蒸气饱和的氯仿-甲醇(10: 8)展开剂中展开，展距为10cm，取出，冷干，先置紫外光灯 ( 365mm)下观察，各供试品在不同位置上均呈蓝色荧光斑点(见下图2);然后喷改良碘化钛钾试液，各供试品在不同位置上均呈橙红色斑点(见下图2)。 （3）红外光谱鉴别：将样品剪成粗粒混匀,于60下干燥至恒重,取2g,除去叶鞘,粉碎过200目筛,粉末放入洁净称量瓶并放入干燥器中备用。精取样品4mg(使其最强吸收峰的透光率在10%以下)KBr200mg,在红外灯下混合研磨均匀,放入模具内,压强为9.8108Pa,作用时间3min,取出,可得直径13mm,厚度0.5mm左右的供试片,立即放入样品架进行测量。测定区域4000400cm1中速扫描。为确保图谱的可比性,每次取样量必须相同。实验结果重复3次,如其图谱稳定的情况下,将结果输入计算机检索红外光谱库。铁皮石斛在1600cm-11480cm-1处有一强吸收峰并带有两个肩峰; 1450cm-11100cm-1处有四重峰,中间二峰吸收强度较接近; 1000cm-1700cm-1处有一高笔架峰,两侧有肩峰。铁皮石斛红外光谱图如下图所示4、检查水分 照水分测定法测定，不超过6.0%总灰分 不超过6.0%灰屑 不超过3.0%败片率 不超过1.0%破碎率 不超过3.0%5、含量测定 (1) 仪器与试药 Agilent 1100液相色谱仪(美国惠普公司),电子天平(Mettler Toledo AG285),乙腈(Tedia公司,色谱纯),甲醇、磷酸(上海化学试剂有限公司,分析纯)。10批铁皮石斛药材采集于云南思茅石膏井镇,经南京中医药大学药学院陆兔林教授鉴定为兰科植物色谱条件 色谱柱为Kromasil KR100-5C18(250 mm4.6 mm,5m);流动相为乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)进行线性梯度洗脱,05 min3%A10%A,512 min 10%A15%A,1225min 15%A22%A,2540 min 22%A35%A,4050 min 35%A55%A,5060 min 55%A60%A;体积流量:1.0 mL/min;检测波长270 nm;柱温30;运行时间为60 min。(2)条件的优化 空白试验 精密吸取空白溶液(甲醇)10L,注入高效液相色谱仪,按规定的梯度条件进行洗脱。结果表明空白不干扰测定。最佳检测波长 首先对铁皮石斛药材的供试品溶液在200400 nm进行了DAD全波长扫描,发现其在270 nm处能体现较多的吸收峰且强度较大,故选择270 nm作为检测波长。（3）提取条件的优化 提取溶剂的优化 在实验过程,考察了不同提取溶剂,包括石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、70%甲醇、50%甲醇等对样品提取效果的影响,色谱图表明甲醇对铁皮石斛药材的提取效率较优。提取方法的选择 对加热回流、索氏提取、超声提取等提取方法进行了比较,结果表明索氏提取法能较好地将成分富集,因此确定索氏提取为样品的提取方法。并进一步考察了提取时间,分别对药材索氏提取2、3、4、5 h进行了考察,结果表明对大多数色谱峰而言,以4 h提取效率最高,4、5 h提取效率无明显差异,因此确定样品的索氏提取时间为4 h。提取时间的优化 取铁皮石斛供试品溶液按要求进样,在洗脱60 min后,再保持60%乙腈60min,经分析,铁皮石斛药材2 h梯度洗脱图谱显示,保留时间60 min后已无成分残留。确定铁皮石斛指纹图谱的提取时间为60 min。 （4）不同色谱柱的考察 比较YWG-C18柱(250 mm4.6 mm,5m)、Kromasil-5 C18(250 mm4.6 mm,5m)、Lichrospher C18(250 mm4.6 mm,5m)3种色谱柱,相同色谱条件下,以Kromasil-5 C18柱色谱行为较好,因此,选用Kromasil-5 C18柱为指纹图谱分析用色谱柱。 (5) 供试品溶液的制备 取铁皮石斛药材,50干燥4 h,粉碎,过60目筛。取药材粉末1 g,精密称定,置于索氏提取器中,加甲醇50 mL水浴回流4 h,提取液挥去部分溶剂,冷却,加甲醇定容至10 mL,用0.45m微孔滤膜滤过,滤液作为供试品溶液（6）精密度试验 取同一供试品溶液,连续进样5次,考察各色谱峰相似度的一致性,利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版进行相似度评价,相似度平均值为0.999,RSD为0.0%。结果表明仪器精密度良好。（7）重现性试验 取同一批铁皮石斛药材分别提取制备