实验二 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及

实验二血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及定量测定 一 目的要求 1 掌握722型分光光度计的使用 2 了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定 3 掌握血红蛋白标准曲线的绘制 二 实验原理 血红蛋白 Hb 与O2结合生成氧合血红蛋白 HbO2 与CO结合生成一氧化碳血红蛋白 HbCO 因其血红蛋白分子结构不同 当光线分别透过各种Hb溶液时 所吸收的光波也各异 可显出特有的吸收光谱 这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础 如HbO2在可见光波长400 600nm范围内有三个特征的吸收峰 其峰值分别在415 541和576nm处 当氧合血红蛋白转为一氧化碳血红蛋白 HbCO 此时光谱发生改变 在波长419 540和569nm处出现三个特征的吸收峰 其中在500 600nm范围内三个特征的吸收峰如下图 本实验先制备Hb及其衍生物 然后在不同波长下测其光吸收度 以吸光度 A 又称光密度 为纵坐标 波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线 由此可以确定它们最大的吸收波长 三 仪器和试剂 1 仪器 试管及试管架 吸量管 滴管和量筒 722型分光光度计 CO发生器 2 试剂 1 浓H2SO4 2 甲酸 3 蒸馏水 4 血红蛋白溶液 722型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定量的分析 该仪器广泛应用于医药卫生 临床检验 生物化学 石油化工 环境保护 质量控制等部门 是生物化学实验室常用分析仪器之一 1 722型分光光度计的使用 基本原理 溶液中的物质在光的照射激发下 产生了对光吸收的效应 物质对光的吸收是具有选择性的 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 因此当某单色光通过溶液时 其能量就会被吸收而减弱 光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系 也即符合于比色原理 朗伯 比耳定律 朗伯比尔定律 A lc 摩尔吸光系数 c 溶液的浓度 l 液层的厚度 A 物质的吸光度 操作方法 预热仪器 选定波长 调节T 100 固定灵敏度档 调节 0 点 测定 关机 注意事项 该仪器应放在干燥房间内 使用温度为5 35 远离强电场 磁场 每次做完实验时 应立即洗净比色皿 为了防止光电管疲劳 不测定时必须将比色皿暗箱盖打开 使光路切断 以延长光电管使用寿命 当仪器停止工作时 切断电源 电源开关同时切断 并且用套子盖住仪器 做好使用登记 比色皿的使用方法 拿比色皿时 手指只能捏住比色皿的毛玻璃面 不要碰比色皿的透光面 以免沾污 洗比色皿时 一般先用水冲洗 再用蒸馏水洗净 比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸蘸干 以保护透光面 四 实验步骤 1 样品的制备 用草酸钾抗凝 取静脉血 边取边轻轻摇动 即制得全血 1 氧合血红蛋白 HbO2 液 加蒸馏水20ml 取全血0 1ml 3滴 盛于小烧杯中 混匀 此即HbO2液 呈鲜红色 2 碳氧血红蛋白 HbCO 液 取上述HbO2液约5ml于试管中 通CO气体 浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生 约10秒钟 HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液 2 吸光度测定及吸光光谱曲线的绘制 1 将如上制备的2种血红蛋白液分别盛于比色杯内 在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和100 每一次读数均应用空白管调节零点和100 2 先从波长500 600nm分别测定HbO2 碳氧血红蛋白的吸光度 在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度读数 其余均每隔10nm记录一次吸光度读数 3 然后以吸光度为纵坐标 波长为横坐标描点 并将各点连接成曲线 即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱 但由于使用仪器不同 绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异 对722型分光光度计来说 峰值误差在 3nm 5nm波长内是允许的 思考题 1 什么叫吸