烟草K326叶片愈伤组织诱导及继代的初步研究.doc

烟草K326叶片愈伤组织诱导及继代的初步研究安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2006.34(2):263.266责任编辑曹淑华责任校对曹淑华烟草K326叶片愈伤组织诱导及继代的初步研究刘卫群,刘巧真,石永春,王永亮(河南农业大学农学院,河南郑州450oo2)摘要以烟草K326叶片为外植体,采用MS基本培养基,研究了不同激素组合时愈伤组织的诱导效果,以度继代培养过程中不同浓度的NAA和6一BA时愈伤组织生长的影响.研究结果表明:2.4一D2.0mL,6-BA0.5mg/L组合诱导效果最好,7d后叶块边缘长出愈伤组织.诱导率为100%.不同浓度NAA和6-BA组合的愈伤组织生长速度,结构,质地和颜色有显着差异.以NAA0.1mg/+6一BA3.0mg门L,NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L和NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L3种培养基组合的愈伤组织生长较快.其中前一组合愈伤组织为绿黄色,结构致密,质地硬;后两种组合愈伤组织为黄白色,结构疏松.质地脆.关键词烟草叶片;愈伤组织;诱导;继代培养中图分类号$572文献标识码A文章编号05176611(2006)020263一OlStudyonCallusInductionandSubcultureofLeafCultureofTobaccoVariety黝6LIUWei-qunetaI【AgronomyCollegeofHenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002)AbstractTheleafoftobaccovariety-K326wasusedastheexplantsontheMSbasalmediumandtheinfluenceoncallusinductionbydifferenthormones.aswellastheinfluenceonitssubculturewiththecombinationofNAAand6-BAwerestudied.Theresultsshowedthat2.4-D2.0mg/L+6_BAO.5mg/Lwasthemosteffectivecombinationforcallusinduction.Duringthesubculture.thedifferentconcentrationofNAA+6一BAcombinationhaddifferenteffectoncallusgrowth,structure,texture,colorandluster,andthecombinationsofNAA0.1mg/L+6一BA3.0mL.NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/LandNAA1.5mg/L+6-BA0.5m辱/Lwerepreferable.CallusonthemediumwithNAA0.1me4L+6-BA3.0me,/Lwerethegreencolorwithyellow,tightnessandhard.CallusonNAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/LandNAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/Lweretheyellowcolorwithwhite,looseandsoft.KeywordsTobaccoleaf;Callus;Induction;Subculture愈伤组织是没有分化的无组织细胞团,其自身的特点细胞全能性,生长速度快,体积小,细胞壁薄.少角质层和蜡质层等,使其成为很好的研究材料.这方面研究报道很多,如通过给愈伤组织施加不同的选择压,获得烟草抗性材料_】,-41,利用烟草细胞培养生产有用的次生代谢产物51,制造人工种子161等.烟草K326是目前生产中应用广泛的品种,以其叶片诱导愈伤组织有现实意义.笔者对用不同激素组合诱导烟草K326叶片愈伤组织和继代的效应进行了研究.1材料与方法1.1无菌苗的获得将烟草K326种子在浓度75%乙醇溶液中浸泡30s,无菌水冲洗3次;然后在浓度0.05%HgC1溶液中消毒5min;无菌水冲洗5次;播种于MS培养基,(281)oc,16h/d光照条件下进行发芽培养.1.2愈伤组织的诱导及继代取室生烟叶片消毒处理后.切成0.5cmxO.5cm大小叶块儿,同时取30d苗龄的无菌苗叶片切块.将室生烟叶块和无菌苗叶块都接种至以MS为基本培养基,含不同激素组合的愈伤组织诱导培养基(表1o待愈伤组织长到黄豆粒大小,切取愈伤组织块转接至不同浓度NAA和6-BA组合的继代培养基(表2).愈伤组织诱导和继代培养条件同无菌苗培养条件.表1不同愈伤组织诱导培养基mL2结果与分析2.1愈伤组织的诱导2.1.1HgC1灭菌对愈伤组织诱导的影响.室生烟叶片用浓基金项目作者简介收稿日期河南大学创新基金(0500489o刘卫群(1956一),士,河北临城人,博士研究生,教授,从事生物化学与分子生物学研究.2o05-09_20表2继代培养基上愈伤组织生长状况组合6-B,ANA,A颜色结构质地口JTJT匕.:刚叫J黄绿色致密硬黄绿色致密较硬绿黄色致密硬黄绿色致密较硬黄绿色致密较硬黄白色疏松脆黄白色疏松脆乳白色疏松脆白褐色疏松松软白褐色疏松松软白褐色疏松松软度0.05%HgCI溶液处理5min,7d后可见叶块边缘变褐,14d后,叶块变白,边缘只有少量愈伤组织产生.而用无菌苗叶片诱导愈伤组织因未用HgC1溶液处理,避免了HgC1的影响,叶块边缘仅有轻微褐化,可以正常产生愈伤组织.2.1.2激素对愈伤组织诱导的影响.试验结果表明,D2组合较D1和DNB组合容易诱导出愈伤组织.D2诱导愈伤组织时间短,生长快,约7d后,叶块边缘有白色愈伤组织长出,叶块出愈率达100%(出愈率=出愈叶块数/总叶块数100%).DI需要10d左右才能诱导出愈伤组织,且愈伤组织量小,DNB则需要更长时间.2.2愈伤组织继代的培养取D2诱导培养基上愈伤组织接种至不同浓度NAA和6-BA组合的继代培养基,21d后记录愈伤组织生长状况(表2).2.2.1激素对愈伤组织生长速度的影响.愈伤组织接种至继代培养基上,第一周增殖量很小,且会出现轻度的褐化;一周后愈伤组织色泽好转,生长加快,愈伤组织明显增大.其中H1,Ll和L2组合愈伤组织生长较快,H4次之,L4组合生长最慢.2.2.2激素对愈伤组织颜色的影响(表2).接种至继代培(下转第266页)12512505O0500000002121l555333222000000眦邯啪u安徽农业科学2006点静燃速率呈负相关,其相关系数为一0.3822,而直接通径分析的结果为0.9784.糖碱比对静燃速率直接作用值大于相关系数,说明糖碱比对静燃速率的影响还通过还原糖(),烟碱(),总氮(),钾(),氯(),两糖tL(x)的间接负效应来实现.3结果与讨论(1)由简单相关分析可知:与静燃速率呈正相关的化学成分有烟碱,总氮,钾,两糖比和钾氯比,并且钾,钾氯比与静燃速率关系均达到了极显着水平.与静燃速率呈负相关的化学成分有总糖,还原糖,氯,氮碱比,糖氮比和糖碱比,并且氯与静燃速率的关系均达到极显着水平.由多元回归方程可知:对静燃速率有较大影响的化学成分有还原糖,烟碱,总氮,钾,氯,两糖比和糖碱比,并得出预测方程:静燃速率一1.7365-0.1508rs+1.2418nt+0.6377*tn+2.0389*k一3.3712+1.6218*rs/ts+O.1496*nt/ts(r-O.977l4).理论上可以通过增减任何变量来修正方程,进行预测,来调节配方单元烟草原料的燃烧性,用于计算机辅助配方设计;当然用同样的方法,还可以得出关于烟气焦油量,一氧化碳和PAHs等有害物质释放量与化学指标的预测方程.(2)由通径分析可知:对静燃速率有较大影响的化学成分有还原糖,烟碱,总氮,钾,氯,两糖比和糖碱比;并且对静燃速率起正面效应的化学成分有两糖比,烟碱,钾,两糖比和总氮:而对静燃速率起负面影响的化学成分为氯和还原糖.(3)综上所述,影响静燃速率的化学成分有钾,氯,总氮,烟碱,总糖和还原糖.因此要提高烟叶静燃速率,应适当提高钾,炯碱和总氮的含量,降低氯,总糖和还原糖的含量,并力争使糖碱比保持在合适的比值.由于各化学成分之间影响比较大,一个化学成分同时通过多个化学成分对静燃速率产生影响,所以,要提高烟叶静燃速率,应全面考虑烟叶所含的各种化学成分(甚至酸,碱和中性致香物质成分)的作用,以充分挖掘烟叶燃烧潜力.参考文献1王瑞新,韩富根,卢红,等.烟草化学M】.北京:中国农业出版社,2o03.159174.2LaytenDavisD,MarkTNielsen编.烟草生产,化学和技术【M】.北京:化学工业出版社,2002.380414.3闫克玉,王建民,等.河南烤烟评吸质量与主要理化指标的相关分析lJ1l烟草科技,2001,(10):5-9.4黄元炯,傅瑜.河南烟叶营养元素和还原糖,烟碱含量及其与评吸质量的相关性fJ1中国烟草科学,1999,(1):3-7.5李国栋,于建军.河南烤烟化学成分与烟气成分的相关分析J】_烟草科技,2001,169(8):2830.6于建军,李国栋.烤烟矿质元素含量,静燃速率与烟气成分的相关分析fJ1.河南农业大学,2000,34(4):355357.7曹志洪,胡国松.土壤供钾特征和烤烟的钾肥有效施用fJ1.烟草科技,1993,(2):3337.8李淑玲,罗战勇.烤烟的钾素营养与烟叶含钾量研究进展fJ】_广东农业科学,2004,2022.9曾洪玉,张国志烟草钾素营养与提高烤烟烟叶含钾量的研究现状和展望fJ1_云南农业大学,2005,20(2):219223.1O王瑞新,韩富根.烟草化学品质分析法【M】.郑州:河南科技出版社,l990.50一l83.11唐启义,冯明光.实用统计分析及其DPS数据处理系统【M】一E京:科学出版社.2002.294327.?十一+n+*+-+*+-+一+-+-I-I-+n+n+*+*+n+*十+?十一十-+-+-+-+一一一-十+一.一*一*一一(上接第263页)养基7d后,愈伤组织颜色逐渐加深;21d后Hl和H4组合愈伤组织为绿黄色,H2,H3,H5和H6组合愈伤组织为黄绿色.L组合较H组合愈伤组织颜色浅,Ll,L2和L3组合愈伤组织为黄白色和乳白色,色泽鲜亮;L4,L5和L6组合愈伤组织全部是白色,色泽暗,有褐化,含水量很高.2.2.3激素对愈伤组织结构和质地的影响(表2).H和L组合愈伤组织结构和质地差异显着.H组合愈伤组织结构致密,质地硬和较硬;L组合愈伤组织结构疏松.但Ll,L2和L3组合愈伤组织质地脆,而L4,L5和L6组合愈伤组织质地松软.可以明显看出,愈伤组织的结构和质地和6-BA/NAA比值相关.比值高,结构致密,质地硬;比值低,结构疏松.3结论用浓度0.05%Hgcl溶液处理叶片,影响愈伤组织诱导,采用无菌苗叶片可以避免这种影响.2.4-D2.0mg/L+6一BA0.5mCL组合愈伤组织诱导效果最好,7d后出现愈伤组织,两周后可以继代培养.Hl,L1和L2组合继代培养愈伤组织生长最快,H4组合次之.其中H1和H4组合愈伤组织为绿黄色,结构致密,质地硬;L1和L2组合愈伤组织为黄【=l色,结构疏松,质地脆;L4组合最不适合愈伤组织继代培养.参考文献1彭剑涛,向结.利用组织培养技术获得烟草抗性材料的研究们.种子,2002,3:2628.2王荔,杨艳琼,杨德,等.运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体抗毒素愈伤组织的再生植株及其后代的抗病性鉴定J】.云南农业大学,1999,14(3):273278.3王荔,罗文富,杨艳琼,等.运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体I抗毒素愈伤组织的有效筛选J】.云南农业大学.I999.14(1):1621.4王仑山,王鸣刚,王亚馥.U用组织和细胞培养筛选作物耐盐突变体的研