生物化学讲稿.doc

绪论一、生物化学的研究对象和目的：生命体的有机部分基本是上由三大类巨分子蛋白质、糖类、核酸及脂类、维生素、激素等少量小分子组成生物化学就是研究这些化学分子（主要是巨分子）的性质、生物功能及在细胞内转化规律的科学；生物化学是研究生命现象的化学本质的科学，它主要是运用化学、物理学和生物学的理论和方法研究生物体的化学组成和生命过程中化学变化的规律。生物化学即是生命的化学。全书内容结构二、 生物化学与普通化学的区别三、应用生物化学的最终目的是控制生命过程为人类的健康与工农业生产服务。A.战胜生理疾病疾病的诊断与病理分析、新药物的开发设计、各类保健品开发、基因疗法、器官克隆等B. 农业丰产转基因技术进行育种、生物病虫害防止、利用代谢调控技术保证产品储存等、高级动植物品种的克隆技术C.生物工程技术与产品生物化学中酶、代谢调控等手段被广泛用于食品加工、酿造、新材料、新能源的开发与研制等工业领域，同时应用生化技术进行工业污染的治理也以其成本低、效率高、无毒害等优势越来越得到大家的重视。D .其他如DNA指纹技术控制生命过程为人类的健康与工农业生产服务。(用之不慎后患无穷)第一章 蛋白质化学教学目的要求：蛋白质是生命现象的物质基础。本章要求学生1、掌握氨基酸结构、分类和主要性质，掌握蛋白质的结构（包括一级结构和高级结构）的主要特点。掌握蛋白质的部分重要性质。2、掌握蛋白质的分子结构与功能的关系，了解蛋白质一级结构的测定。3、了解蛋白质分离纯化方法及含量测定方法教学重点：氨基酸结构、分类和主要性质、蛋白质的结构（包括一级结构和高级结构）的主要特点。以及蛋白质的部分重要性质。教学难点：氨基酸的两性解离及等电点、二面角的概念、血红蛋白与氧结合时构象的变化前面我们提到，恩格斯曾指出“生命是蛋白体的存在方式”。由此可见，蛋白质是生命的物质基础，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式，其本质就是蛋白质与其存在其中的外部自然界不断地进行新陈代谢。近代生物化学和分子生物学研究充分阐明了生物高分子蛋白质和核酸是生命活动中最重要的物质基础。按总量计，人体干重的45%是蛋白质；从种类上看，自然界的蛋白质数量也是极多的。在最简单的细胞生物，如大肠杆菌体内，估计含有3000种不同的蛋白质。正由于蛋白质如此多种多样，生物体才能表现出千差万别的功能活动。另外，新陈代谢的全部化学反应，几乎都是在酶这种蛋白质的催化下进行的，已知的酶有千余种；对代谢起调节作用的很多激素也是蛋白质或其衍生物；又如肌肉的收缩与松驰是因肌肉中存在能收缩或松驰的蛋白质（肌球蛋白和肌动蛋白的相对滑动而实现的）；还有，抵抗外来微生物或病毒侵害而起保护作用的免疫反应，也是由抗体这种蛋白质来实现的。那么如此之多的蛋白质，各自是怎样起作用和怎样产生，又是怎样进行代谢的呢？恩格斯又提出“只要把蛋白质的化学成分弄清楚，化学就能着手制造活的蛋白质”。也就是说，弄清楚蛋白质的化学成分，才能揭开生命的奥秘。1965年我国在世界上首先合成了具有生物活性的蛋白质结晶胰岛素，在揭开生命奥秘的历程中迈进了一大步。第一节、蛋白质的功能与分布蛋白质-英文为“Protein”第一重要.蛋白质分布广泛、功能多样l 1. 催化功能-酶l 2. 结构功能-皮、毛、骨、牙、细胞骨架l 3. 载运功能-膜蛋白l 4. 调控功能-激素l 5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白l 6. 防御功能-免疫球蛋白l 7. 神经传导第二节 蛋白质的分子组成一、蛋白质的元素组成：大多数蛋白质含有碳(C)5056%,氢(H)68%，氧(O)1924%，氮（N）1319%，此外还有硫(S)04%，有些蛋白质含有磷，少数含铁、铜、锰、锌、钴、钼等金属，个别还含有碘。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的氮含量，就可以按下式推算出蛋白质的大约含量，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏(Kjedahl)定氮法测定蛋白质含量的计算基础。每克样品含氮的克数6.25100=100克样品中蛋白质的含量(克%)。二、组成蛋白质分子的基本单位氨基酸一百多年前就开始了关于蛋白质的化学研究。在早期的研究中，水解作用提供了关于蛋白质组成和结构的极有价值的资料。蛋白质可以受酸、碱或酶的作用而水解。在水解过程中，逐渐降解成分子量越来越小的肽段，直到最后成为氨基酸的混合物。1酸水解：常用硫酸或盐酸进行水解，使用盐酸浓度为6mol/L，硫酸浓度为4mol/L。回流煮沸20小时左右，可使蛋白质完全水解。酸水解的优点是不引起消旋作用，得到L-氨基酸；缺点是色氨酸完全被沸酸所破坏，羟基氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）有一小部分被水解，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。2碱水解：一般与5mol/L氢氧化钠共煮1020h，即可使蛋白质完全水解。水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象。所得为D型和L型混合氨基酸。此外，碱水解引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。然而在碱性条件下色氨酸是稳定的。3酶水解：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。但是使用一种酶往往水解不彻底，需要几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解。此外，酶水解所需时间较长，因此酶法主要用于部分水解。常用的蛋白酶有：胰蛋白酶（主要作用于赖氨酸和精氨酸）、糜蛋白酶（主要作用于苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和亮氨酸）、胃蛋白酶（主要作用于苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和亮氨酸）。一般的氨基酸分析，均用6mol/L、HCl、在真空条件下、110水解，成为基本单位氨基酸。蛋白质是由20种氨基酸以不同组合方式组成的复杂高分子化合物。有些蛋白质完全由氨基酸组成，称为简单蛋白质。如卵清蛋白，胰岛素等。有些蛋白质除了蛋白质部分外，还有非蛋白质的辅基或其它分子与之结合在一起，称为结合蛋白质。如血红蛋白和核蛋白。组成蛋白质的氨基酸顾名思义，其结构上有氨基和羧基，而它们皆连结在碳原子上，故名氨基酸氨基酸的结构通式组成蛋白质的氨基酸大都属于L-系的。生物界中也发现一些D-系的氨基酸。如存在于某些抗菌素以及个别植物的生物碱中的某些氨基酸。氨基酸属于L-系还是D-系，是以含有手性碳原子（不对称碳原子）的最小糖甘油醛作相互比较得来的。L和D表示围绕手性碳原子的4个基团的构型，而不是偏振光平面转动的方向。除甘氨酸无不对称碳原子外，其余均有L-型、D-型之分。（一）氨基酸的分类1根据其化学结构分为：（1）脂肪族氨基酸：一氨基羧基酸、一氨基二羧基酸、二氨基一羧基酸、羟基及含硫基氨基酸；（2）芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸（带有芳香环的）；（3）杂环氨基酸：组氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨基酸。2根据酸碱性质：（1）酸性氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸；（2）碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；（3）中性氨基酸：含一氨基一羧基的氨基酸，包括两种酸性氨基酸产生的酰胺（谷氨酰胺和天冬酰胺）。3根据R基因的极性：（1）非极性R基氨基酸：甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、甲硫、脯、色氨酸。甘氨酸按理属于极性的，但因其-碳上的氢受到易解离的-氨基和-羧基的影响，因此不体现极性；（2）极性R基氨基酸：A不带电荷的：丝、苏、天冬酰氨、谷氨酰氨、酪、半胱氨酸；B带正电荷的：赖、组（碱性氨基酸）；C带负电荷的：天冬氨酸、谷氨酸（酸性氨基酸）。（二）不常见的氨基酸： 除了参与蛋白质组成的20多种氨基酸之外，还在各种组织和细胞中找到180多种其他氨基酸，这些氨基酸大多为L-型氨基酸的衍生物，它们有、氨基酸，也有D-型氨基酸。（三）氨基酸的一般理化性质：1物理性质：无色结晶物；熔点高，一般在200以上；通常能溶于极性溶剂（如水、乙醇等），而不溶于非极性溶剂（如苯、已烷、乙醚等），各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中。2两性解离和等电点：无机盐一般为离子化合物，具有高熔点，能溶解于水而不溶于有机溶剂的特点。因为氨基酸也具有这个特点，所以可推断氨基酸也为离子化合物。实验证明，氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在。与无机盐不同的是它以两性离子的形式存在。即氨基酸在溶液中主要以-NH3+、-COOH形式存在。氨基酸的游离主要决定于溶液的pH值。在较强的酸性溶液中，羧基的游离被抑制，而使氨基酸带正电荷。在某种pH下，某一氨基酸可呈电中性，即带着相等的正负电荷，这时的pH值被称为该氨基酸的等电点，通常以pI表示。pI = (pK1 + pK2 )/2此式只适用于侧链上没有解离基团的氨基酸，而侧链上有解离基团的氨基酸，其pI如何计算呢？举例计算：l 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 l 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 通过上述实例可知，由于羧基解离度大于氨基的解离度，所以含有一个氨基和一个羧基的中性氨基酸的等电点都在pH=6.0左右。如甘、丝、缬等。至于碱性氨基酸（二氨基一羧基）的等电点就较大，而酸性氨基酸（一氨基二羧基）的等电点点就小。由于静电作用，等电点时氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。利用这一性质，可以分离制备某些氨基酸。如谷氨酸的生产，就是将微生物发酵液的pH值调节到3.22，而使谷氨酸沉淀析出。利用各种氨基酸的等电点不同，可通过电泳法、离子交换法等在实验室或工业生产上进行混合氨基酸的分离或制备。3芳香族氨基酸的紫外吸收光谱：蛋白质对紫外线光的最大吸收峰是它所含有的色氨酸（杂环化合物）和酪氨酸所决定的。色氨酸吸收紫外光的能力最强，我们常利用此性质来测定样品中的蛋白质的含量，一般常用紫外分光光度计在280nm的波长处测量最大吸光值来定量蛋白质。（四）氨基酸的化学反应： 由氨基酸的化学结构可将其化学反应分为： -氨基参加的反应：亚硝酸反应、2，4-二硝基氟苯反应等；-羧基参加的反应：叠氮、脱羧、成盐、成酯反应；-氨基和-羧基共同参加的反应：茚三酮反应及成肽反应；侧链R基参加的反应：简讲-氨基参加的反应1. 甲醛反应（-氨基反应）：氨基酸虽然是一种两性电解质，既是酸又是碱，但是它却不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱滴定的等当点pH过高（1213）或过低（12），没有适当的指示剂可被选用。而向氨基酸中加入甲醛，由于可形成羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对增加了-NH3+的酸性解离，使pK2，减少23个pH单位，每释出的一个H+就相当一个氨基酸，所以甲醛滴定可以测定蛋白水解程度。甲醛与氨基结合后，使氨基酸不再可能成为兼性离子，因此可以用碱溶液来滴定，叫甲醛滴定法。用此法测定，从而得到氨基酸的含量。2.亚硝酸反应（-氨基反应）：自由氨基能与亚硝酸反应释放出氮气。每克分子的自由氨基可生成一克分子氮气。据此原理，可测定自由氨基氮。在生产上还常用此法来测定蛋白质的水解程度。因蛋白质在水解过程中，肽键逐步断裂，每切断一个肽键就释放出一个游离的氨基和一个游离的羧基。随着蛋白质水解的进行，游离氨基随之释放。水解愈完全，被切断的肽键愈多，释放的游离氨基也愈多，与亚硝酸反应所释放出的氮量也愈多。在水解过程中，蛋白质总氮量是不变的，而氨基氮却不断上升，因此可用氨基氮与总蛋白氮的比例来表示蛋白质的水解程度。3.2，4-二硝基氟苯的反应（-氨基反应）：在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与DNFB作用，生成稳定的黄色DNP-氨基酸（2，4一二硝基苯氨基酸）。多肽或蛋白质N-末端氨基酸的-氨基也能与DNFB反应。DNP氨基酸在有机溶剂中的溶解度与其他氨基酸不同，可以用乙醚把它提出来，从而与其它氨基酸分开。近年来，用5二甲氨基萘磺酰氯（丹磺酰氯）来代替DNFB。因为前者具有强烈的荧光，可用荧光光度计快速提出，灵敏度高。4.异硫氰酸苯脂反应（-氨基反应）：在弱碱性条件下，氨基酸中的-氨基还可以与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（简称PTC-氨基酸）。在无水酸中，PTC-氨基酸即环化变为苯硫乙酰脲（PTH），后者在酸中极稳定。蛋白质多肽链的N末端-氨基也可以与PITC起上述反应。所得的PTH经乙酸乙酯抽提后，用层析法进行鉴定，确定肽链的N末端氨基酸种类。重复应用此法就可测定出多肽链N端的氨基酸排列顺序。目前，根据此原理设计出“多肽顺序自动分析仪”可进行自动测定。-羧基参加的反应1. 成酰氯反应用途：可活化羧基，常用于人工合成肽过程2.叠氮反应（羧基参加反应）: 氨基酸可以通过酰基化和酯化先将自由氨基酸变为酰化氨基酸甲酯，然后与联氨和亚硝酸（HNO2）作用使变成叠氮化合物。这个反应有使氨基酸的羧基活化的作用，在人工合成肽的工作中也是常用的。-氨基和-羧基共同参加的反应1、茚三酮反应：茚三酮能使-氨基酸氧化脱羧产生CO2、NH3及醛，而其本身受到还原。还原型茚三酮、茚三酮与NH3形成兰紫色化合物，在570nm波长处有最大的吸收峰，这个呈色反应可用于氨基酸的定性鉴定。CO2的产量或兰紫色的深浅可以用于-氨基酸的定量。但两个亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放氨，而直接生成黄色化合物。（多肽和蛋白质与茚三酮也有反应，但肽越大，灵敏度越差）。2、成肽反应用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应第三节 蛋白质分子的结构实验证明蛋白质是各种氨基酸通过肽键连接而成的多肽链。而各种氨基酸按一定的排列顺序构成的蛋白质肽链骨架是蛋白质的基本结构，称为蛋白质分子的一级结构，肽键为基本的结构键。一个完整的生物活性分子则由几条肽链盘曲成的，它具有一定的空间结构，称之为次级结构（二级、三级和四级）。其盘曲和折叠主要依靠一些较弱的非共价键形式。一、蛋白质分子的一级结构：以各种氨基酸按一定的排列顺序构成的蛋白质肽链骨架。包括以下含义： 组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序 多肽链内或链间二硫键的数目和位置 最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础，即一级结构是氨基酸按一定的排列顺序构成的蛋白质肽链骨架胰岛素的一级结构：肽键与肽： 蛋白质分子中氨基酸之间以肽键相连。肽键就是由氨基酸的-羧基与相邻的氨基酸的-氨基脱水缩合起来的键。也是-氨基与-羧基共同参与的化学反应。 肽(peptide):氨基酸通过肽键连结起来的化合物 二肽(dipeptide):两个氨基酸形成的肽 三肽(tripeptide):三个氨基酸形成的肽 寡肽（oligopeptide)小于个氨基酸组成的肽 多肽(polypeptide):许多氨基酸形成的肽 蛋白质:多是组成氨基酸超过100个的多肽 氨基酸残基(residue):氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整 末端氨基和末端羧基(terminal)：缩合后的氨基酸，只在肽的两端有自由的-氨基和-羧基，简称N-端和C-端肽链的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定的，规定从肽链的N-端残基开始，称为某氨基酰、氨基酰某氨基酸。如：为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸。通常把N-端氨基酸残基放在左边，C-端氨基酸残基放在右边。除特别指明者外，上面丝氨酸残基侧为N-端，亮氨酸为C-端。如反过来写则成为另一条不同的五肽链。肽链中除肽键外，还存在一种特殊的二硫键（二硫桥）。它是由二个半胱氨酸残基的侧链之间形成的。即胱氨酸的残基中的二硫键。二硫键可以使两条单独的肽链共价交联起来（链间二硫键），也可以使一条链的某一部分形成环（链内二硫键）。肽链中除肽键外，还存在一种特殊的二硫键（二硫桥）。它是由二个半胱氨酸残基的侧链之间形成的。即胱氨酸的残基中的二硫键。二硫键可以使两条单独的肽链共价交联起来（链间二硫键），也可以使一条链的某一部分形成环（链内二硫键）。二、一级结构的研究方法： 测定蛋白质分子的氨基酸的顺序，要求分析的样品必须是均一的、已知分子量的蛋白质。（一）测定氨基酸的组成：肽链水解：用6NHCl于100120下在真空的安瓿瓶内进行。水解1024h。水解后除去过量的HCl，所得的氨基酸不消旋，但色氨酸遭到破坏，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来，生成相应的游离氨基酸及铵离子。蛋白质也可与碱共热而水解，但碱水解引起半胱氨酸、胱氨酸、丝氨酸以及苏氨酸的破坏，同时引起所有氨基酸的消旋，因此此法只用来测定色氨酸。水解后的氨基酸混合物，可用氨基酸自动分析仪来分析。（二）蛋白质的N-末端和C-末端的测定：1N-末端残基的分析：（1）二硝基氟苯（DNFB）法（-氨基反应）：在氨基酸的化学反应中已提到，2，4二硝基氟苯与氨基酸反应生成相应的DNP-氨基酸，此物质为黄色，可以用于鉴定。（2）二甲基氨基萘磺酰氯（称丹磺酰氯）法：此反应与上相同，只是以丹磺酰氯代替DNFB。由于丹磺酰基具有强烈的荧光，所以可用荧光光度计快速地检测，此法较上法灵敏100倍。（3）异硫氰酸苯酯（PITC）法：此法最大优点是除去N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。因此，可以用来一步步地测定多肽链N末端的氨基酸顺序。前述的氨基酸分析仪就是根据此原理制成的。（4）氨肽酶法：此酶从胰腺中提取，它能从多肽链的氨基端逐个向内切。2C-末端残基的分析：（1）硼氢化锂还原法： 可以用层析法加以鉴定。（2）肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C-端氨基酸外，其它氨基酸都转变为相应的酰肼化合物，肼解下来的C-端氨基酸可用层析法鉴定。（3）羧肽酶法：pH8.0、 30与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样分析，用滤纸层析测定释放出来的氨基酸，根据所测得的各氨基酸的量与时间的关系，就可知C-端氨基酸的排列顺序。羧肽酶是一类肽链外切酶，它专一地从肽链的C端开始逐个降解，释放出游离氨基酸。被释放的氨基酸数目与种类随反应时间而变化。但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结果不好分析。（三）二硫键的拆开和肽链的分离： 如果蛋白质分子中多肽链仅以肽键相连，则可用酸、碱、高浓度盐或其它的变性剂处理蛋白质，把肽链分开。如果肽链之间是以二硫键交连的，或者虽然蛋白质分子由一条肽链构成，有链内的二硫键，则必须采取一些方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的硫基乙醇处理，然后用碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸巯基，以防它重新被氧化。二硫键拆开后形成的个别肽链，可能用纸层析、离子交换柱层析、逆流分溶、区带电泳等方法进行分离。 （四）肽链的部分水解和肽段的分离： 肽链的部分水解是测定氨基酸顺序工作中的一个关键步骤。这一步通常是选择了专一性很强的蛋白酶来完成的，最理想的酶是胰蛋白酶。它很容易得到结晶纯品。胰蛋白酶专门水解由碱性氨基酸（赖氨酸或精氨酸）的羧基参加形成的肽键。所以水解后的产物C端为赖氨酸或精氨酸。经常使用的还有糜蛋白酶、胃蛋白酶及专一性较差的嗜热菌蛋白酶、溴化氰等。各种酶的作用位点参见北大P173。多肽链经部分水解后，即降解成长短不一的较小肽段，这些肽段可以应用层析和电泳加以分离和提纯。（五）肽段的氨基酸顺序的测定多肽链中分离出来的各个小肽段，可以应用化学方法或酶学方法测定出其中的氨基酸顺序。然后比较用不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此有重叠的部分，确定每个肽段的适当位置。拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。（六）二硫键位置的确定一般可用蛋白酶或酸直接水解原来的蛋白质，从部分水解产物中分离出含有二硫键的肽段，所得到肽段，混合物可使用Brown及Harltay的对角线电泳技术进行分离，确定二硫键位置。确定二硫键位置一般用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。因为胃蛋白酶专一性较低，切点多，这样生成的肽段（包括含有二硫桥的肽段）都比较小，后面的分离、鉴定工作均比较容易进行。其次是胃蛋白酶的pH在酸性范围（2），有利于防止二硫键发生交换反应而造成麻烦。对角线电泳：图南大P28通过以上的6方面，即可基本搞清蛋白质的一级结构。四、蛋白质的三维构象： 蛋白质分子的三维构象也称空间结构或高级结构。指的是蛋白质分子中原子基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。构型与构象 1.构型（configuration）：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。 COOH COOHH2N C H H C NH2 R R 2.构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。(一)研究构象的方法： 1X-射线衍射法：其原理与光学显微镜或电子显微镜的原理基本相似，但光源波长很短 =0.154nm，为一衍射波，得到一张衍射图。经数学方法重组，绘出电子密度图，从中构建出三维分子图象分子结构模型。X-射线与蛋白质相互作用时，只有一小部分射线被散射，大部分穿过蛋白质，相当一部分破坏性地与蛋白质相互作用，结果在尚无足够的X射线被散射以形成有用的图象之前，蛋白质分子已被破坏。X射线衍射法是测定晶体结构物质的方法，而蛋白质在溶液中的构象与晶体状态多少有些差别，并且在表现功能过程中，经常发生构象变化，因此确定蛋白质在溶液中的构象是一项重要的工作。2重氢交换法和旋光色散法：测定蛋白质分子中-螺旋体的含量。3核磁共振光谱法：测定蛋白质分子中哪个氨基酸残基发生构象变化；4园二色法（测定-螺旋和-折叠片的含量）、荧光、荧光偏振法等。（二）蛋白质分子的二级结构： 蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链（一级结构）本身的折叠和盘绕的方式。1、肽单位：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现肽单位的构象具有三个显著的特征：（）是一个刚性的平面结构。 1）肽键具有部分双键性质：C-N单键键长0.14nmC=N双键键长0.12nm 肽键键长0.132nm 2）肽键不能自由旋转 3）组成肽键的四个原子和与之相连的两个a碳原子（Ca）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane）。（）肽平面中羰基的氧原子与亚氨基的氢原子以反式排列（） Ca和亚氨基的及羰基之间的键都是单键，可自由旋转肽平面为肽链盘绕折叠的基本单位。也是蛋白质会形成各种立体构象的基本原因。Ca原子的二面角蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链本身在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键是稳定二级结构的主要作用力。天然蛋白质一般均含有-螺旋、-折叠和-转角的结构。2二级结构的类型:（1）- 螺旋： 特点：每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈。上升一圈相当于向上平移0.54nm，即每个氨基酸残基上升0.15nm，每个残基沿轴旋转1000；氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻螺圈之间形成链内氢键； 氢键是由每个氨基酸残基的N-H与前面隔三个氨基酸残基的C=0形成的；一般为右手螺旋；链中如有脯氨酸，则螺旋被中断，产生一个“结节”，这是因为脯氨酸的亚氨基上的氢参与肽键形成后没有多余的氢原子形成氢键，这样肽链拐弯不再形成-螺旋；另外，甘氨酸由于没有侧链的约束，难以形成-螺旋所需的二面角。其次，如肽链中连续存在带相同电荷的氨基酸，由于同性电荷相斥也会影响-螺旋的稳定性。（2）-折叠结构： 当将- 角蛋白（- 螺旋）用热水和稀碱等方法处理或用力拉直，-角蛋白就变成-角蛋白，此时-螺旋被伸展，氢键被破坏，而形成-折叠。（3）-转解结构：是近年来发现在球状蛋白质中广泛存在的一种结构，多肽链常出现1800的回折，而成为转角。（4）无规卷曲或自由回转（nonregular coil）指无一定规律的松散盘曲的肽链结构。酶的功能部位常包含此构象，灵活易变。3、纤维状蛋白 纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外表保护成分， 占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴)大于1()(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。1）纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白):有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等；可溶性:肌球蛋白和纤维蛋白原等角蛋白 Keratin角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是a-角蛋白还有b-角蛋白。（1）a-角蛋白主要由a-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手a-螺旋肽链形成一个原纤维（向左缠绕），原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。卷发(烫发)的生物化学基础永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),a角蛋白在湿热条件下破坏氢键可以伸展转变为b构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。这是因为a角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在b构象状态，此外a角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(a螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。（2）b-角蛋白丝心蛋白(fibroin)：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式b-折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。4、超二级结构supper secondary structure超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（a-螺旋或b-折叠或b-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。超二级结构的基本类型：aa、 bab、bbb 图见南大P375、结构域（domain)结构域：多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域（domain)l 较小的球状蛋白分子或亚基，结构域与三级结构往往是一个意思，即这些蛋白质是单结构域l 较大的球状蛋白质或亚基，三级结构往往有两个或多个结构域缔合而成，即为多结构域。l 结构域在空间上彼此分隔，各自具有部分生物功能。图见南大P388（三）蛋白质的三级结构： 蛋白质在各种二级结构单元的基础上，还能进一步盘曲而成特定格式的三级结构。决定多肽链盘曲方式的因素，首先是氨基酸残基的序列。 残基上有的氨基酸带正电（赖、精），有的带负电（谷、天冬）这样它们便可以成盐键而相互吸引；而基团之间紧密靠近又产生范德华力；侧链可形成氢键等。这些次级键在前面已经详细讲过。此外，肽链中还有二硫键，可把两条肽段连起来，这对蛋白质的三级结构起着重要作用。多肽链经过如此盘曲后，在分子表面形成了某些发挥生物学功能的特定区域（微环境），如酶的活性中心等。维系三级结构稳定的作用力有氢键、二硫键、离子键、疏水作用力和范德华力，其中认为硫水作用起主要作用。肌红蛋白图P39（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。（2）肌红蛋白的结构特点： a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17800。 b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段较直的a-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。 c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。（四）蛋白质分子的四级结构：很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级结构的多肽链组成的。这些多肽链之间并没有共价键的联系，只是借次级键缔合在一起，这就形成了四级结构。一般分子量超过几十一百万的蛋白质均有四级结构。在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子才有生物活性。血红蛋白图南大P41（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH.（2）血红蛋白的结构特点：a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000b.成人的血红蛋白为a2b2（HbA-96%）、a2d2（ HbA2-2%）胎儿的血红蛋白为a2g2（HbF）c. a 链由141AA残基组成， b d g 链由146AA残基组成。 四种肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。五、蛋白质的结构与功能1、蛋白质的一级结构决定其高级结构Anfisen 以核糖核酸酶为研究对象124个残基4个二硫键加入的尿素和巯基乙醇（变性）透析氧化（恢复）2、蛋白质的一级结构与功能() 物种之间蛋白质的同源性同源蛋白质：在不同物种中执行相同功能的蛋白质胰岛素细胞色素保守残基：可变残基：保守取代细胞色素（个物种中只有个保守残基不同物种的同源蛋白质之间不同氨基酸残基数量的信息可用于构建进化树1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。 不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 442）尽管不同不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。(）蛋白质的一级结构即氨基酸序列与生物功能的关系分子病：auling提出来的，由于基因的突变导致了蛋白质结构的改变或某种蛋白质的缺陷所引起的。血友病、胰岛素分子病、膀胱癌镰刀型红细胞贫血病（等电点的变化见书）l 血红蛋白A和S胰蛋白酶消化液的指纹图谱l 谷A（极性） 缬A（非极性）l (了解)由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧失， 导致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲疟疾。目前已经有10万种蛋白质的氨基酸序列已经测定建立数据库。如：国家分析中心蛋白组学网/index_chi.htm3、蛋白质的三维结构与功能 别构效应：蛋白质与配基结合后改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。别构蛋白：蛋白质分子中不止有一个配基的结合部位（活性部位），还有别的配基的结合部位（别构部位）。别构蛋白都有别构效应。例如：血红蛋白表现其输氧功能时的别构现象A氧合引起的血红蛋白的构象变化与氧结合时血红蛋白的变构过程B、血红蛋白的氧合曲线血红蛋白S形氧合曲线的生理意义：C、H+、CO2和BPG 对血红蛋白D、BPG的影响：BPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义：BPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的BPG可促进氧合血红蛋白释放氧，以满足组织对O2需要。 BPG浓度越大， O2的释放量越多。红细胞中BPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。第四节 蛋白质的理化性质（南大P55）一、蛋白质的分子量：一般在1万100万道尔顿。由于是生物大分子，因此在溶液中极不稳定，不能用测定小分子物质的方法（如冰点降低、沸点升高）。而以渗透压法、凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶电泳及超离心法来测定其分子量。一般超离心法较准确，但实验条件要求很高。二、两性游离和等电点由于蛋白质是由氨基酸组成，因此氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也具有。图南大P55肽与氨基酸都有 COOH，NH2，但肽还含有侧链R基上的可解离基团，且其为主要解离基因。肽链中的COOH与NH2相距较远，因此它们之间的静电引力较弱，可离子化程度较低。大的肽比小肽的离子化程度低，即大肽完全质子化所需pH比小肽低，N端NH2的pK，值要比游离氨基酸的小一些，C端的COOH的pK，值比游离氨基酸的大一些，侧链R基的pK，值在两者之间。在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的性质和数量以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，可以利用这种性质来分离和分析蛋白质，称为蛋白质电泳分析法（纸上电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯纤维的凝胶电泳）。三、蛋白质的胶体性质由于蛋白质分子大，且球状蛋白质分子中亲水的氨基酸残基多位于颗粒表面，故在水溶液中能与水起水合作用。因此，蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两个稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外力条件作用，不致互相凝集。如除掉这两个稳定因素，蛋白质便容易凝集析出。因此，可用此原理提取蛋白质，如常用中性盐硫酸胺来竞争水而使水化膜破裂，产生沉淀。蛋白质具有许多高分子溶液的性质。如扩散、粘度大、不能透过半透膜。四、蛋白质的沉淀反应： 使蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀。一般沉淀出的蛋白质是变性的。如果控制实验条件（如低温、温和沉淀剂），便可得到不变性的蛋白质。稳定蛋白质的因素为水化层和带电层。水化层是蛋白质分子表面的许多亲水基团与水分子结合形成的一层水膜，它使蛋白质颗粒不能相互接触聚集成大颗粒；带电层是蛋白质分子表面的可解离基团在一定pH环境下解离产生的。由于带同性电荷的蛋白质颗粒相互排斥，也使蛋白质颗粒不能聚集，当改变这些稳定因素，蛋白质分子相聚集而从溶液中析出。1盐析：加入大量中性盐(硫酸胺)以破坏蛋白质的胶体性而使蛋白质从水溶液沉淀析出，称为盐析。盐析时若溶液pH在蛋白质的等电点(溶解度最小，易沉淀)则效果最好。各种蛋白质分子的颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节混合蛋白质的溶液中的中性盐的浓度，可使各种蛋白质分段沉淀。2重金属盐沉淀蛋白质：pH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。通常这种盐为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。3生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质：某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。沉淀条件应当是pH小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。4有机溶剂沉淀蛋白质：可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于象盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。5加热凝固：将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。如鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。这是蛋白质凝固作用应用于食品加工的典型例子。五、蛋白质的变性和复性蛋白质的严密结构决定了蛋白质的功能和性质。若以某些物理或化学因素的作用，使蛋白质严格的空间构象破坏（不包括肽键的断裂），而引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用。影响蛋白质变性的因素很多，如紫外线照射、加热煮沸、强酸、强碱、重金属盐和有机溶剂处理等。随着蛋白质空间结构的阐明，现在更加清楚地知道，原来维持蛋白质二级、三级和四级结构的严格构象的力只是一些弱的次级键，它们很容易被破坏，结果肽链便松散开来，此时肽链之间又可再借次级键相互缔合形成较大的聚合物而易于沉淀。同时，随着天然构象的破坏，也就失去了生物学活性，但是蛋白质变性并不包括一级结构的破坏。某些变性蛋白质再除去变性因素后，可以“复性”。如有一些球蛋白被热或极端pH变性后，若缓慢冷却或缓慢恢复到正常pH时，将重新获得其天然结构和生物活性。有人说生物工程的最终成就是使煮沸3分钟后的鸡蛋能孵化出小鸡来，就是说，蛋白质变性并不破坏蛋白质的共价键，即一级结构没有被破坏，当变性因素去除后，又可自动恢复到其天然状态和性质，也就是蛋白质的复性。这种复性现象，即蛋白质折叠研究中的所谓“折叠”。图六、蛋白质的颜色反应： 1双缩脲反应：蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色混合物。因此，可以用此反应来定性测定蛋白质；也可在540nm处比色，定量测定蛋白质。2酚试剂（福林试剂）反应：蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。常用此反应来定量测定蛋白质含量。最近普遍使用的Brodford法，（考马思亮兰G-250法）实验将会接触。图酪氨酸3蛋白质的黄色反应：含有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加盐则白色沉淀变成黄色，再加碱呈橙黄色。这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。4米伦化反应：米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硫酸的混合液。当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故有此反应。5乙醛酸反应：在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环。凡含有吲哚基的化合物都有此反应，由于色氨酸含有类似结构，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白质都有此反应。6坂口反应：精氨酸分子中的胍基，能与次氯酸钠（或次溴酸钠及萘酚）在氢氧化钠溶液中产生红色产物。此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来测定精氨酸的含量。第五节 蛋白质分离纯化和测定无论是对蛋白质结构与功能的研究，或是生产人们所需要的蛋白质产品，都涉及蛋白质的分离纯化。目前对蛋白质的制备，主要是从生物组织中提取分离。一般的程序为：(一) 前处理：组织、细胞破碎等（二）粗分级：盐析、沉淀等（三）细分级：层析、电泳等（二）、蛋白质混合物的分离方法 （粗分级）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1）蛋白质的盐析盐析：一般盐浓度增大时，蛋白质的溶解度趋于减低，当盐浓度足够大时，蛋白质可从溶液中完全沉淀出来，称为盐析。以硫酸铵（中性盐）最常应用。因其溶解度大，且不易伤害蛋白质，另外还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等2）等电点沉淀法蛋白质在等电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小3）低温有机溶剂沉淀法加入与水可混溶的中性有机溶剂，特别是甲醇、乙醇、丙酮可降低多数蛋白质的溶解度并使之沉淀（三）、蛋白质混合物的分离方法 （细分级）1根据分子大小不同的分离方法2根据蛋白质带电性的分离方法3根据配体特异性的分离方法亲和层析法 1根据分子大小不同的分离方法1）透析和超滤2）密度梯度（区带）离心3）凝胶过滤（分子筛层析）2）密度梯度（区带）离心1蛋白质颗粒和沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度，常用的密度梯度有蔗糖梯度蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带 3）凝胶过滤（分子筛层析）这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶珠是多孔的网状结构，凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的分子量范围主要原理：当不同分子的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠外，随着溶液在凝胶珠之间的孔隙向下移动，并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外，这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来常用的凝胶:葡聚糖凝胶（sephadex）、琼脂糖凝胶(sepharose)聚丙烯酰胺凝胶（Biogel）2根据蛋白质带电性的分离方法1）电泳法原理：由于各种蛋白质在同一pH条件下因分子量及荷电量不同而其电泳迁移率不同常用的是区带电泳。所用支持物有滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂、淀粉、聚丙烯酰胺凝胶等目前常用的有SDS聚丙烯酰胺平板电泳、盘状电泳电泳有三个物理效应：样品的浓缩效应；胶对分子的筛选效应；一般电泳分离的电荷效应。因此使样品分离效果好，分辨率高2）离子交换层析法阴离子交换剂或阳离子交换剂均可用于分离蛋白质当被分离的蛋白质溶液流经离子交换剂柱时，带有相反电荷的蛋白质可被离子交换而吸附于柱上，随后又可被带同样性质电荷的离子所置换而被洗脱常用的阳离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维（CM纤维素）常用的阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE纤维素） 3根据配体特异性的分离方法1原理：利