第十六章 分子流行病学

,分子流行病学,Molecular Epidemiology,第十六章,第一节 概 述第二节 研究内容第三节 研究方法第四节 发展与应用前景,目 录,第一节 概 述,产生与发展历程分子流行病学定义与传统流行病学关系,第一节 概 述,分子流行病学(molecular epidemiology)是近十几年才迅速发展起来的一门流行病学新分支，它是由传统流行病学学科发展的强烈需求和分子生物学理论和技术取得的巨大成就相结合的产物。,一、产生背景疾病预防控制中的需求 传染性疾病 病原体变异与疾病预防控制 抗生素与耐药 新发现传染病,第一节 概 述,慢性非传染病 多病因、多阶段、多基因、长潜隐期 暴露发病（死亡）关系 干预效果评价需要 人群易感性 遗传和环境不同导致易感性差异 传统流行病学无法有效测量 实验医学病因假设和防治措施的人群检验,第一节 概 述,分子生物学的发展 理论突破 DNA双螺旋结构、遗传中心法则、RNA逆转录等 技术创新 凝胶电泳技术、分子杂交、基因克隆等,第一节 概 述,二 分子流行病学的产生与发展,概念的演变定义分子流行病学的发展,(一)概念的演变,国外：1972年提出“流感分子流行病学”的名词。1977年英国的定义：分子流行病学是应用精细技术进行生物材料的流行病学研究。1986年定义：分子流行病学的核心在于把先进的实验室方法和分析流行病学结合起来，从而查明环境和宿主病因。,1993年定义：分子流行病学是在流行病学中应用生物标志或生物学测量。1996年定义：分子流行病学狭义上讲是测量作为暴露和效应的生物标志信息大分子：DNA、RNA和蛋白质。,国内：1988年：分子生物学理论和技术应用于流行病学的边缘学科，主要是通过对造成某一疾病流行的病原体，在基因水平上分析其特征，从而更准确地解决传染源和传播途径等有关流行病学问题。1992年：利用分子生物学原理和技术，从分子乃至基因水平上研究医学事件在人群和环境生物群众的分布及其决定因素和调控手段的学科。,(二)定义,分子流行病学 是阐明人群和医学相关生物群体中生物标志的分布及其与疾病/健康的关系和影响因素，并研究防治疾病、促进健康的策略与措施的科学。 生物标志（biological marker，biomarker，简称M） 指能代表生物结构和功能的可识别物质。分子事件（molecular event）或分子生物标志（molecular biomarker）主要指代表生物结构和功能的生物大分子特征。如DNA、RNA、蛋白质等。,将分子生物学理论和方法应用于流行病学研究的学问。(上世纪80年代）阐明疾病和健康状态相关生物标志(或分子事件)在人群和生物群体中的分布及其影响因素,并研究防治疾病、促进健康的策略和措施的科学。（第四版）阐明人群和医学相关生物群体中生物标志的分布及其与疾病/健康的关系和影响因素，并研究防治疾病、促进健康的策略与措施的科学。（第五版）,血清流行病学,应用血清学方法对血清中各种成分（包括抗原、抗体、代谢产物、生化物质、营养成分及遗传因子等）的出现和分布进行研究。1950年Paul等首先提出“血清流行病学” 。 1960年WHO建立了三个血清参考库，分别设在美国耶鲁大学、原捷克斯洛伐克布拉格流行病学和微生物学研究所和南非约翰内斯堡医学中心。,人类基因组流行病学,1998年由Khoury和Dorman提出人类基因组流行病学(human genome epidemiology, HuGE)的概念，定义：应用流行病学与基因组信息相结合的研究方法，开展以人群为基础的研究，评价基因组信息（基因或基因变异及其相应编码的产物）对人群健康和疾病的流行病学意义。,(三)分子流行病学的发展,研究内容更加丰富 传染病、慢性非传染病、健康状态。研究手段越来越多 主要是分子生物学方法和技术。应用范围不断扩大 流行病学、预防医学、基础医学、生物学、遗传学、环境科学和人类学等。,二、分子流行病学定义 研究人群中疾病/健康状态相关生物标志的分布及其影响因素、医学相关生物群体特征及其与人类疾病/健康的关系，制定防治疾病、促进健康的策略与措施的科学,第一节 概 述,定义注释 解决疾病或健康状态生物标志分布等 流行病学分支学科 研究对象 人群、医学相关生物群体等,第一节 概 述,研究内容 疾病和健康状态相关生物标志的分布规律，生物 标志与疾病和健康关系，以及其影响生物标志分 布的因素 医学相关生物的群体特征、与人类疾病和健康的 关系 制定和评价防治疾病、促进健康的策略和措施 特征: 生物标志和群体分布,第一节 概 述,三、与传统流行病学关系,健 康 者,“海平面”,图16-1 疾病的“冰山现象”,亚临床者,患者,第一节 概 述,任何生命现象都具有生物分子基础，疾病的发生、发展过程也表现为一系列相关分子事件（molecular events）的相互作用及分布变迁。,A 暴露 疾病 易感性,分子流行病学,B 暴露内暴露早期生物学效应结构和功能变异临床疾病 易感性 暴露内暴露早期生物学效应续发生物学效应健康状态 易感性 图16-3 传统流行病学与分子流行病学的关系,传统流行病学,第一节 概 述,第二节 研究内容,生物标志暴露测量效应测量易感性测量 疾病防治效果评价,一、生物标志种类暴露生物标志(exposure biomarker)定义与疾病/健康状态有关的暴露因素的生物标志 外暴露标志(external exposure marker , EEM ) 内暴露标志(internal exposure marker , IEM) 生物作用标志(biologically active marker, BAM),第二节 研究内容,EEM:暴露因素进入机体之前的标志和剂量，如病毒、细菌、生物毒素、吸烟烟雾、环境物质等。IEM:暴露因素进入机体之后的标志。生物性病原因子:生物病原因子、其代谢产物或与宿主体内生物大分子结合产物，如病毒整合基因、生物毒素-DNA加合物等；非生物性病原因子:体内转运分子、代谢产物或与宿主靶体结合物等。BAM:暴露因素进入机体以后，经过一系列转运、转化而最终起生物活性作用的暴露标志。,易感性生物标志(susceptibility biomarker)定义指在暴露因素作用下，宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志易感性 与宿主的遗传特征、生长发育、营养等有关。宿主在不同疾病阶段，可以具有不同的易感性标志。,第二节 研究内容,效应生物标志(effect biomarker)定义指宿主暴露后产生功能或结构性改变的生物标志 早期生物效应标志(early biological effect marker, EBEM) 结构和功能改变标志 (altered structure and function marker, ASFM) 病理标志(pathological marker, PM) 临床疾病标志(clinical disease marker, CDM) 健康状态标志(health condition marker, HCM),第二节 研究内容,生物标志选定 生物标志的筛选 研究目的 候选生物标志特征的意义 检测方法的有效性,第二节 研究内容,生物标志特性 分子特性 时相特性 个体内变异 个体间变异 群体间变异 储存变异,第二节 研究内容,检测方法 实用性 可信性 有效性 灵敏度、特异度,第二节 研究内容,成熟稳定、操作简便、标本容易采集。,常用的生物标志传染病生物标志,表16-1 传染病研究常用的生物标志,第二节 研究内容,慢性非传染病的生物标志,表16-2 慢性非传染性疾病常用的生物标志,第二节 研究内容,二、暴露测量 外暴露研究,第二节 研究内容,检测鉴定生物性病原因子 流感嗜血杆菌 研究病原生物进化变异规律 o157大肠杆菌确定传播途径 S.munchen菌感染 测量非生物性因素暴露 吸烟烟雾,内暴露研究传染性疾病 人体感染状况 追踪传染源慢性非传染病 内暴露水平 生物作用水平,第二节 研究内容,三、效应测量,第二节 研究内容,传染病 慢性非传染病 健康状态,免疫效应病理性效应,基因表达和代谢异常 基因突变或染色体畸变,第二节 研究内容,四、易感性测量,遗传性疾病 Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志 慢性非传染病 载脂蛋白E(apoE)不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中易感性不同传染病 不同基因特征的人群对HIV的易感性差异很大,传染病 预防接种效果评价 预防接种相关疾病研究慢性非传染病,第二节 研究内容,五、疾病防治效果评价,潜隐期长多影响因素,第三节 研究方法,测量指标与标本采集现场调查研究方法实验室检测技术研究设计,一、测量指标与标本采集 测量指标的选择 生物标本选择的一般原则 生物标志应特异、稳定； 标本采集、储存方便； 检测方法比较简单、实用，而且操作规范，便于与同类研究结果比较。 检测方法灵敏度和特异度高。测量指标：暴露指标、效应指标、易感性指标,第三节 研究方法,生物标本采集和储存 分子流行病学研究成功的关键要求在采集和储存过程中不能受到“污染” 储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识,标本采集,生物标本 一般包括病原的和人体的生物标本。常用的有：微生物标本、血液（血清）标本、组织标本、其他生物标本（如唾液、胃液、尿液、精液、头发、媒介生物等） 生物标本库 通常将储存有一种类型或多种类型生物标本，并能保持它们的生物活性以供研究之用的系统称为生物标本库(biological specimen bank, BSB)，如血清库、组织库、病原生物库等。,描述性研究病例对照研究病例病例研究队列研究巢式病例对照研究实验性研究,第三节 研究方法,二、现场调查研究方法,三、实验室检测技术核酸技术核酸凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 脉冲电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)核酸杂交(nuclear acid hybridization)核酸测序(DNA sequencing),第三节 研究方法,蛋白质技术 凝胶电泳 、蛋白转印杂交 酶学技术 免疫组化、多位点酶电泳技术 生物芯片技术 基因芯片 其他检测技术 实验中的质量控制,第三节 研究方法,（一）生物标本中核酸的提取 核酸携带有生物体的遗传物质，是生物体细胞的重要组成成分。 基因分型、变异分析、多态性分析、基因序列分析等是分子流行病学研究中非常重要的手段之一。但在进行这些分析之前，首先要提取和纯化核酸。,1. DNA的提取(Extraction of DNA) 通过破坏细胞质和细胞核膜后，再除去蛋白质可获得基因组DNA。 基本过程： （1）在EDTA和变性剂存在下加入蛋白酶K消化除去蛋白质； （2）用 RNA 酶除去 RNA； （3）用酚和氯仿抽提 DNA； （4）用乙醇和异丙醇把 DNA从溶液中离心沉淀出来。,2. RNA的提取 (Extraction of RNA) RNA提取的基本过程： 裂解细胞； 除去蛋白质； 提取核酸混合物； 将RNA与DNA分离。,（三）DNA的凝胶电泳 电泳技术是分子生物学领域中常用的实验技术。常用琼脂糖凝胶电泳和PAGE或SDS-PAGE分离、鉴定、纯化DNA或RNA。 此法具有简便、快速、分辨率高等优点，并可将分离片段（电泳带）从凝胶中回收用于 DNA 重组或克隆。,1.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖加热至90-100即可熔化成透明液体，浇到电泳槽内，冷却后即可形成凝胶，用于电泳，常用TAE作为电泳缓冲液。 电泳时根据DNA片段大小确定凝胶浓度，一般用0.8-1.0%。一般检测鉴定时，用常规琼脂糖凝胶电泳，要想从凝胶中回收DNA，需要低熔点琼脂糖凝胶电泳，若要分析单链DNA，需要碱性琼脂糖凝胶电泳。,图 3 pBSK+-NDV HN DNA琼脂糖凝胶电泳 1：Marker；2,3,5,6,9,10,12：突变株；4,7,8,11：野毒株,（四）聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR PCR 技术在分子流行病学研究中具有非常重要的地位。已被广泛地应用于体外基因扩增、基因诊断、基因克隆、基因序列分析、基因定点突变分析等。 优点是简便、快速、灵敏等。 缺点是实验室污染问题，易出现假阳性。,基本原理是： 根据待测基因两端设计一对引物，即上游引物和下游引物，在标本中模板存在的情况下，耐热DNA聚合酶可利用四种dNTP使引物沿着模板延伸。整个过程可分为三个步骤： 变性94-97 30-50S； 退火25-65 60-90S； 延伸70-74 60-120S。 一般重复25-30个循环，即可进行琼脂糖凝胶电泳。用杂交、PCR-SSCP、序列分析等对扩增产物进行分析。 PCR技术不断发展和完善，并产生了一些改良的PCR方法，如定量PCR、原位PCR、RT-PCR、免疫PCR等等。,（六）实验中的质量控制,一般实验质量控制 标本采集和储存试剂和材料仪器实验方法统一操作规范,2、设立多重对照,(1) 标准对照 (2) 空白对照 (3) 重复对照,3、重复试验,实验室内重复试验 实验室间重复试验,四、研究设计,设计研究目的和路线,第三节 研究方法,表16-3 生物标志的研究路线及意义,第三节 研究方法,设计要点 研究目的 创新性、实用性、可行性 测量指标 结局指标、暴露指标、易感性指标 测量方法 用成熟的方法 调查方法与样本 样本有代表性，适量 结果与分析 质量控制 注意事项,第三节 研究方法,常见偏倚选择偏倚 样本选择偏倚、标本采集偏倚信息偏倚 检测偏倚、标本储存偏倚混杂偏倚,第三节 研究方法,研究实例 1研究题目 波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究测量指标 DNA加合物/淋巴细胞DNA（介质）测量方法 荧光检测竞争ELISA法、DNA加合物32P后标记技术研究设计 横断面分析研究 暴露组 煤焦油作业工人 对照组 当地城市居民、近郊农民 排除年龄、吸烟、其他职业暴露等因素影响 比较3组DNA加合物水平,第三节 研究方法,结果分析 当地城市居民（19例）与煤焦沥青作业工人（63例）的DNA加合物水平和谱型相似 近郊农民（15例）的DNA加合物水平仅为煤焦油作业工人的1/2或1/3 结论 环境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可导致体内DNA加合物水平质量控制 每份标本同时在不同实验室检测 结果一致性好(r=0.66, p0.01),第三节 研究方法,研究题目 应用HBV-DNA序列多态性研究HBV的传播测量标志 HBV 2551-2650位点核酸序列/血清HBV-DNA 测量方法 ELISA法和PCR法 研究设计 类病例对照研究（病例病例研究） 96名HBeAg阳性儿童和用ELISA检测HBV血清阳性的97名父母 假设该位点核酸序列在儿童与父母之间分配是随机的结果分析 该序列在儿童和父母之间是非随机分配的（P0.00005) 结论 HBV具有家庭内传播质量控制 关于家庭成员之间1%的序列差异的解释 排除了PCR错配可能,第三节 研究方法,研究实例 2,研究目的 应用PCR测序追踪HIV传染源 测量指标 HIV/外周血单核细胞（介质） 测量方法 PCR和核酸测序 研究设计 横断面调查：1名牙科医生（HIV携带者，可疑传染源），7名HIV感染者（都曾接受该牙医的治疗）；35名当地与牙医无关的HIV感染者。比较这些HIV毒株之间的关系。 结果分析 牙医的HIV株与其曾治疗的5名病人的HIV株具有克隆关系，而与其他毒株遗传关系较远。结论：牙医是其曾治疗的5名病人的HIV的传染源。,实例三,第四节 发展与应用前景,第四节 发展与应用前景,传染病预防控制慢性非传染病预防控制健康状态研究,一、传染病预防控制,第四节 发展与应用前景,病原体研究人群感染和传染源研究传播途径研究人群易感性研究疫苗及免疫预防制剂研究防治对策和措施研究及其效果评价,二、慢性非传染病预防控制,第四节 发展与应用前景,暴露测量更加准确细微效应可以测量易感性研究深入到基因和分子水平 防治措施效果的评价更加有效,三、健康状态研究,第四节 发展与应用前景,重视以生物标志为基础的健康状态分布及其影响因素研究 健康相关生物标志精确测量，使健康促进从模糊走向科学更深入、细致了解健康和疾病发生、发展过程,小 结,分子流行病学产生的原因？ （流行病学)实践的需求是学科发展的根本动力。分子流行病学怎样产生？ 学科分化、交叉和融合产生新的学科或学科分支。 分子生物学提供了条件。,分子流行病学是什么? 阐明人群和医学相关生物群体中生物标志的分布及其与疾病/健康的关系和影响因素，并研究防治疾病、促进健康的策略与措施的科学。,分子流行病学做什么？ 暴露测量及其与疾病的关系 效应测量及其与疾病的关系 易感性测