土壤微生物量碳测定方法.doc

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5molL-1K2SO4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5molL-1K2SO4提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数KEC(取值0.38)来计算土壤微生物碳。Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数KEC的取值，有很多研究进行了大量的研究。测定KEC值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数KEC取值也不同，如采用氧化法和一起法KEC值分别为0.38（Vance等，1987）和0.45（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的KEC值有较大不同，其值变化为0.20-0.50（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数KEC有较大的差异，从表层0-20cm土壤的KEC为0.41，逐步降低到180-220cm土壤的KEC为0.31。一、 基本原理熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K2SO4溶液可提取成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数KEC来估计土壤微生物碳。二、 试剂配制（1） 硫酸钾提取剂（0.5molL-1）：取871.25g分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100revmin-1）12小时即可完全溶解。（2） 0.2 molL-1（1/6K2Cr2O7）标准溶液：称取130烘2-3小时的K2Cr2O7（分析纯）9.806g于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K2Cr2O7较难溶解，可加热加快其溶解。（3） 0.1000 molL-1（1/6K2Cr2O7）标准溶液：取经130烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g，用蒸馏水溶解并定溶至1L。（4） 邻啡罗啉指示剂：取邻啡罗啉指1.490g溶于含有0.700g分析纯硫酸亚铁（FeSO47H2O）的100ml蒸馏水中，此溶液易变质，应密闭保存于棕色瓶中。（5） 硫酸亚铁标准溶液（0.05 molL-1）：称取13.9g分析纯硫酸亚铁（FeSO47H2O），溶于800ml蒸馏水中，慢慢加浓硫酸5ml（防止水解），定溶至1L，保存于棕色瓶中。此溶液易被空气氧化，每次使用时必须标定其准确浓度：硫酸亚铁溶液标定方法：吸取0.1000 molL-1（1/6K2Cr2O7）标准溶液5.0ml（浓度为0.05 molL-1，1/6K2Cr2O7），放入150ml的三角瓶中，加浓硫酸5ml和邻啡罗啉指示剂2滴，用硫酸亚铁溶液滴定，滴至溶液由蓝绿色变为棕红色即为终点。根据滴到终点消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度，即C2=(C1*V1)/V2。式中：C1重铬酸钾标准溶液浓度（0.1000 molL-1） C2硫酸亚铁标准溶液浓度（molL-1） V1吸取的重铬酸钾标准溶液体积（5ml） V2滴到终点时消耗硫酸亚铁溶液体积（ml）（6）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1：2（V:V）加入分液漏斗中，充分摇动1分钟，慢慢放出底层氯仿于烧杯中。如此洗3次。得到的纯氯仿用无水氯化钙出去氯仿中的水分，于试剂瓶中在低温（4）黑暗状态可保存几周（Williamss等，1995）三、 仪器设备：Phoenix8000碳-自动分析仪，50ml可调移液器，往复式振荡器（300 revmin-1），50ml烧杯，50ml聚乙烯瓶，125 ml聚乙烯瓶，150ml消化管（24*295mm），250ml三角瓶，50ml酸式滴定管。土壤筛（孔径2mm），22cm真空干燥器，水泵抽真空装置，pH-自动滴定仪。四、 操作方法：（1） 土样前处理：新鲜土壤应立即处理或保存于4冰箱中，测定前仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（蚯蚓等），过筛（孔径2mm），彻底混匀。处理过程应尽量避免破坏土壤结构，土壤含水量过高应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。土壤湿度不够可以用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。次样品即可用于土壤实时测定。开展其他研究（如培养试验）可将土壤置于密闭的大塑料桶内培养7-15天，桶内应有适量水以保持湿度，内放一小杯1 molL-1NaOH溶液吸收土壤呼吸产生的CO2，培养温度为25.经过前培养的土壤应立即分析。如果需要保留，应放置于4的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24小时。这些过程为消除土壤水分限制对微生物的影响，及植物残体组织对测定的干扰。土壤饱和持水量测定可按Shaw（1958）的方法：在圆形漏斗茎上装一带夹子的橡皮管，漏斗内塞上玻璃纤维塞，取50g土壤于漏斗中，夹紧橡皮塞，加入50ml水保持30分钟，然后打开夹子并测定30分钟内滴下的水的体积，加入的水量减以滴下的水量再加原来土壤中含的水量即为该土壤的饱和含水量。（2） 土壤熏蒸称取经前处理的新鲜土壤（含水量为饱和持水量的40%）3份25.0g（烘干基重）土样于50ml烧杯中，用去乙醇氯仿熏蒸，方法是将其置于底部有少量水（约200ml）和去乙醇氯仿（40ml）的真空干燥器中，氯仿加入烧杯中，并在其中放入经浓硫酸处理的碎瓷片（0.5cm大小，防爆）。在-0.07MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3-5分钟后，关闭真空干燥器阀门，移置在25黑暗条件下熏蒸土壤24小时；然后将土壤转入另一干净真空干燥器中，反复抽真空（-0.07MPa）6次，每次3分钟，彻底出去土壤中氯仿（残留在土壤中的氯仿对提取碳的测定有较大的影响）。在熏蒸同时，另取3份25.O(烘干基重)土壤于125ml提取瓶中（为不熏蒸对照）。由于熏蒸过程需要24小时，因此通常在熏蒸时，将不熏蒸土壤可置于4条件下保存。（3） 土壤提取将除去氯仿后的熏蒸土壤转移到125ml提取瓶中，与不熏蒸土壤同时采用50ml可调加液器加入100ml0.5molL-1K2SO4提取液，水土比为1：4，并设3个试剂空白。如果采用重铬酸钾氧化法测定提取液中有机碳，也可采用2：；1的水土比，即加入50ml0.5molL-1K2SO4提取液。在往复式振荡器中振荡（300 revmin-1）提取30分钟，再用定量中速滤纸过滤于50ml塑料瓶中，贮藏于-18冷冻柜中，待测。经贮藏的土壤提取液解冻后会有一些白色沉淀，据推测为CaSO4和4K2SO4，对提取液中有机碳的测定没有影响，可以不必除去这些白色沉淀（Brookes等，1985）。（4） 提取液中有机碳含量测定和土壤微生物碳计算：方法：重铬酸钾氧化法（林启美等1999；Vance等1987）吸取10ml上述土壤提取液于经过仔细检查的150ml消化管（24*295mm）中，加入5.0ml0.2 molL-1 K2Cr2O7，5.0ml浓H2SO4溶液，再加入少量经浓硫酸处理的碎瓷片（3mm大小，防爆），混匀，置于1751磷酸浴中煮沸10分钟，应注意消煮的时间应保证准确一致。冷却后将溶液转移到150ml三角瓶中，使总体积约为80ml，加入1滴邻啡罗啉指示剂，用0.05 molL-1硫酸亚铁标准溶液滴定消煮液中剩余的重铬酸钾，滴定过程为先由橙黄色变为蓝绿色，再变为棕红色，即到达终点。结果计算：提取的土壤有机碳（mgCkg-1土）=0.012/4*106*M*(V0-V)*f/W式中：M为FeSO4溶液浓度（molL-1）； V0、V分别为滴定空白和样品消耗的FeSO4溶液体积（ml）； f为稀释倍数； W为烘干土重（g）； 0.012为碳毫摩尔质量（g）； 106为换算系数。土壤微生物碳：Bc=Ec/Kc式中：Bc代表土壤微生物碳（mgCkg-1）； Ec=熏蒸土壤提取的有机碳-不熏蒸土壤提取的有机碳，单位mgCkg-1； Kc为转换系数，采用重铬酸钾氧化法取值0.38（Vance等，1987）。方法：碳-自动分析仪器法（Wu等，1990） 取10ml土壤提取液于40ml样品瓶中。加入10ml，5%六偏磷酸钠溶液（pH2.0），使提取液中的沉淀（CaSO4和4K2SO4）全部溶解。再用直径为2mm的细管向样液中通过高纯度氮气（5-10分钟），以除去溶解在样液中的CO2，然后用Phoenix8000碳-自动分析仪测定，待测提取液中的有机碳在硫酸钾溶液作用下于紫外氧化室中氧化为CO2，该仪器可自动测定有机碳氧化放出的CO2量，通过工作曲线即可计算出提取液中的碳含量。工作曲线制备：分别吸取0、0.5、1、2、3、4ml浓度为1000mgCL-1邻苯二甲酸钾标准溶液溶于50ml容量瓶中，用高纯度去离子水定容，即为0、10、20、40、60、80 mgCL-1系列标准碳溶