第四章目的基因的制备

目的基因 决定生物的优良性状 具有应用价值或应用前景 并被用于构建物种新特性的基因 结构基因 包括从5 端mRNA转录位点开始到3 端mRNA转录终止信号结束的全部功能单位 这些功能单位包括 转录启动区 核糖体识别和结合区 编码区 起始密码 开读框 终止密码 转录终止区 1 原核生物的基因组成 操纵子 Operon 功能密切相关的基因聚集在一起 处于同一个转录启动区的调控之下 并具有相同的转录终止区 启动区 RNA聚合酶识别 结合和开始转录的一段DNA序列 SD序列 核糖体识别和结合的序列 通常位于起译密码子上游4 9bp处 序列特征为 AGGAGG 它与核糖体核糖体16SrRNA的3 序列3 UCCUCC5 互补配对 从而使核糖体与mRNA结合 启动翻译过程 编码区 翻译起始密码 ATG 位于SD序列后4 9bp多肽链编码区 翻译终止密码 TAG TGA TAA 某些基因后面只有一个终止密码 某些基因后面有两个终止密码 转录终止区 终止子 原核生物基因在转录终止前的一段提供转录终止信号的DNA序列 Terminator 特点 回文结构 转录后可形成发夹状的结构 从而使聚合酶减慢或停止前进 a 不依赖于终止因子的终止子 简单终止子 含有寡聚T序列和一段富含GC的序列b 依赖于终止因子 的终止子 不含寡聚T序列 回文结构不含富GC的序列终止因子 帮助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子 Terminationfactor 终止子发夹结构 2 真核生物基因组成 真核生物基因组的一般特点a 基因位于染色体上 基因之间存在较长的非编码区b 一个结构基因内有一个或多个非编码的间隔序列 转录启动区 真核生物的三类RNA rRNA mRNA tRNA 分别由RNA聚合酶I II和III进行转录 它们启动子的结构也不相同 编码蛋白质的启动子由RNA聚合酶II识别 基因区 特点 a 无类似于原核基因中的核糖体识别区b 含有不编码的间隔序列 转录终止区 含有高度保守序列AATAAA 该序列与mRNA转录后3 端加poly dA 尾有关 3 其它基因组的特点 病毒 噬菌体 基因组的特点a 编码的基因位于DNA或RNA上b 以多顺反子进行转录 SV40 c 部分基因重叠并含有内含子线粒体基因组的特点a DNA编码的蛋白与能量代谢有关b 以多顺反子进行转录c 无S D序列d 动物线粒体基因无内含子 某些植物线粒体基因有内含子叶绿体基因组的特点a DNA编码与光合作用有关的蛋白或酶b 以多顺反子进行转录c 含有类似于原核基因组的启动子和S D序列 2 基因的特殊排列 对于大多数基因来说 基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上 在基因之间存在长度不等的间隔区 但某些生物基因组中的基因存在重叠 重复 加倍和重排等现象 1 基因重叠 一个基因内包含另一个基因的现象a 部分重叠 两个基因的序列部分重叠b 完全重叠 一个基因完全包含在另一个基因内 2 重复基因 在某些生物基因组中 某些基因存在多个拷贝的现象 真核生物基因组中组蛋白基因 3 加倍基因 同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因 高等生物含有两倍以上的染色体 细菌质粒DNA 蓝藻染色体 4 基因重排 在生物的发育过程中 同一基因簇中的基因在不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象 它与细胞功能的分化及表达有关 蓝藻细胞中的营养细胞和异形胞中的nif基因存在重排现象 第二节目的基因的制备 1 目的基因的直接分离1 限制性核酸内切酶酶切分离 对于已知序列的DNA分子 根据DNA分子上的酶切位点进行切割 然后分离所需片断 2 物理化学分离法 根据不同DNA或RNA分子特性的差异 采用密度梯度离心 分子杂交等方法将目的基因分离出来 3 免疫法分离编码特异性蛋白基因 核糖体沿mRNA进行转译时产生多肽链 通过特异性抗体与核糖体 mRNA 多肽链复合体结合 然后分离纯化抗体 核糖体 mRNA 多肽链复合体 获得特定基因的mRNA 4 酶促反转录分离特定基因 在反转录酶的作用下 合成双链DNA 获得一定大小的基因片断 2 原核生物基因组文库的构建 基因组文库 Genomiclibrary 某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中 这个群体就称为该生物基因组的文库 目的 a 分离有用的目的基因b 保存某种生物的全部基因 1 原核生物基因组DNA的提取染色体DNA质粒DNApUC载体系统 制备的基因组片段 100kb 采用常规的基因组DNA的制备方法 载体系统 制备的基因组片段 200kbp 采用常规的基因组DNA的制备方法要求 制备的DNA的长度为100 200kb 防止在制备过程中的机械断裂 2 基因组DNA的不完全酶切 根据实验需要选择合适的限制性内切酶a 四个识别位点限制酶出现的几率 1 256b 六个识别位点限制酶出现的几率 1 1024分离目的酶切片段大小的确定a 克隆单个基因 10kbb 克隆基因族 20kb 不完全酶切条件的确定a 确定限制酶用量 改变酶切时间b 固定酶切时间 改变限制酶的用量 DNA的不完全酶切 克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系 要求 构建的基因组文库含目的 片段 基因 的几率 99 文库理论克隆子数 基因组 总长 片段平均长度 文库实际克隆子数 片段平均长度基因组 的总长 基因组大小 酶切片段大小 文库克隆子数的关系 3 酶切片段与克隆载体连接 酶切片段的分离与纯化a 低熔点琼脂糖回收目的片段b 试剂盒回收目的片段 酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择a 质粒载体可承载 10kb 片段b 载体可承载 20kbDNA片段c Cosmid载体可承载 40kbDNA片段 4 重组 转化受体细胞 根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞 DH5 用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株 可与pUC编码的 半乳糖苷酶氨基端实现 互补 HB101 用于大规模制备质粒的抑制型菌株 转化效率高JM101 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ 1 温度敏感的溶源性菌株 用于含有噬菌体 启动子质粒载体的宿主菌 重组质粒转化受体细胞1 转化法 transformation 2 转导法 transduction 3 转染法 transfection 5 基因组文库克隆子的保存与筛选 a 基因文库的保存影印膜滤保存法 文库在液体培养基中扩增保存 方法 从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中 混合的细菌生长数代后 其培养物于 70oC储存 加终浓度为25 的甘油 缺点 因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法 从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中 菌体生长到一定浓度后 加入终浓度为25 的甘油 于 70oC或 25oC下保存 缺点 需保存的克隆子数过多 工作量大 b 基因文库的筛选 表型筛选法 表达性状易于鉴别 如互补筛选 抗性筛选法 如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解 而该化学物可抑制大肠杆菌生长 分子杂交法 利用分子探针对文库进行筛选 免疫筛选法 利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选 PCR筛选法 根据保守序列合成引物 扩增特异性片段 3 真核生物基因组文库的构建 1 真核生物基因组DNA的制备YAC载体系统 制备的基因组片段 10Mbp 染色体分带技术将各个染色体分离 载体系统 制备的基因组片段 200kbp 采用常规的基因组DNA的制备方法 2 真核基因组DNA一级文库的构建 YAC文库 a 染色体DNA的部分酶切获得平均长度为200 500kb的DNA片段 多切点限制性内切酶 EcoRI BamHI特点 有较多重叠克隆子 稀切点限制性内切酶 NotI MluI特点 重叠克隆子较少 b 酶切片段与YAC克隆载体连接 YAC克隆载体pYAC4 C 酶切片段与载体连接 d 重组YAC载体转化酵母球形体1 g基因组DNA500个转化体e YAC文库的筛选1 探针杂交法 以特异性的探针分子与文库的克隆子进行杂交2 PCR筛选法 f YAC基因组文库的保存 活化菌体 将含重组载体的阳性克隆 AB1380菌株 划线接种于AHC平板上 于30oC培养至长出1 3mm的红色菌落 短期保存 parafilm膜将平板周围封起来于4oC保存4 6周 长期保存 接种一个单独的YAC克隆子于3mlYPD培养基中 在30oC摇床振荡过夜 然后加入1ml80 的甘油 混匀后分装于 80oC保存 3 真核基因组亚文库的构建 DNA载体的文库 4 cDNA文库的构建 cDNA文库 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组 储存于某种受体菌中 该群体就称该生物基因组的cDNA文库 cDNALibrary 原理 将带poly A 的mRNA经酶促反应转变为双链DNA 再与原核载体连接 1 制备用于克隆cDNA的mRNA a mRNA的制备动物细胞mRNA的制备植物细胞mRNA的制备b mRNA的来源选用mRNA含量高的组织材料 或通过药物等方法提高mRNA的含量c mRNA完整性的检测 mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力 见下页图 哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译 SDS PAGEanalysisofproteinstranslatedbycell freetranslationsystem Lane1 proteinmarker Lane2 withoutmRNA Lane3to7 translationproductsoftotalmRNAfrommammaliancells mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力 mRNA分子的大小 哺乳动物mRNA长度为500 8000bp 大部分mRNA位于1 5 2 0kb之间 总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力 利用哺乳动物细胞提取的poly A RNA合成cDNA Lane1 HindIII EcoRI Lane2 thefirstchainofcDNA Lane3 thesecondchainofcDNA Lane4 HindIII d mRNA在细胞中的丰度 高丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50 90 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA 低丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0 5 以下 2 mRNA的富集 典型的哺乳动物细胞含有10000 30000种不同的mRNA分子 某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝 mRNA的丰度与文库克隆子数的关系N ln 1 P ln 1 1 n N 所需克隆数 P 要求的概率 n 一种mRNA在总mRNA中的相对比例 a 按大小对mRNA进行分级分离 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子 该方法的分离效果最好 但从凝胶中回收的得率较低 蔗糖梯度离心 加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等 再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA b cDNA的分级分离 mRNA通过反转录形成cDNA 在插入到克隆载体前 通过琼脂糖凝胶电泳 将不同大小的cDNA分子分离开来 优点 避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解 增加了获得全长cDNA克隆的概率 获得更准确的分级分离效果 分子量 c 多聚核糖体免疫学纯化法 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体 将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱 A蛋白 Sepharose柱 上 随后用EDTA将多聚核糖体解离下来 并通过Oligo dT 层析分离mRNA 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝 3 cDNA第一链的合成 利用反转录酶合成cDNA的第一链 4 cDNA第二链的合成 a 自身引导合成法 单链cDNA的3 端能够形成发夹状的结构作为引物 在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下 合成cDNA的第二链 缺点 在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时 会导致对应于mRNA5 端的地方的序列出现缺失和重排 自身引导法合成双链cDNA b 置换合成法 原理 以第一链合成产物cDNA mRNA杂交体作为切口平移的模板 RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口 产生一系列RNA引物 在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链 优点 a 合成cDNA的效率高 b 直接利用第一链的反应产物 不纯化 c 避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA 置换法合成cDNA的第二链 c 引物 衔接头法 5 双链cDNA分子的克隆 a 同聚物加尾法利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3 端都加上一个互补的同聚片段 通过退火使两个片段连接成重组质粒 再将重组质粒转化受体细胞 同聚物加尾法克隆双链cDNA b 接头 衔接头法 c mRNA cDNA克隆法 方法 在mRNA反转录合成cDNA第一链后 将dA残基加到mRNA cDNA杂交体上 然后与带dT尾的克隆载体连接 转化受体细在宿主细胞内 mRNA被降解并代之以DNA 缺点 克隆的效率低 为双链cDNA克隆的1 10 6 cDNA文库的筛选和鉴定 核酸杂交 是最常用 最可靠的方法之一 可大规模地分析文库的克隆子 同源探针 至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列 常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆 部分同源探针 探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同 常用于克隆家族基因 b 特异性免疫学检测 在cDNA表达文库中 目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应 通过酶学的方法加以检测 c cDNA克隆的同胞检测 将cDNA文库分成若干组含有10 100个克隆子的易于处理的cDNA文库 对每组cDNA文库进行检测 当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测 直到获得阳性单克隆 第三节目的基因的分离 1 目的基因的功能克隆1 根据蛋白质氨基酸序列分离目的基因对于未知功能的蛋白质基因 其目的基因的分离可从蛋白质开始 通过蛋白质的分离纯化 蛋白质氨基酸序列的测定 相对应的基因片断序列的设计 制备PCR扩增引物或合成DNA探针 从总DNA中分离目的基因片断 或根据特异性蛋白质制备特异性抗体 然后从表达文库中筛选克隆子 从蛋白质到目的基因的分离 2 功能互补克隆目的基因 从某一基因组中提取总DNA 经限制性内切酶不完全酶切后 与克隆载体连接 转化某一种与目的基因功能互补的缺陷型受体细胞 当含有目的基因片断的重组质粒进入受体细胞后 细胞才能生长 从而很方便地将含目的基因的克隆子挑选出来 2 序列克隆法分离目的基因 1 根据部分已知序列或同源序列分离目的基因如果知道某个基因的一部分序列 或知道某基因的家族基因的序列 则可根据已知序列或家族基因高度保守的同源序列合成DNA探针 通过探针杂交技术 从DNA酶切片断或克隆子中筛选所要克隆的目的基因片断或克隆子 同源探针杂交克隆目的基因 2 表达序列标签法分离目的基因 利用基因序列中一段特异性的DNA片断 100 500bp 作为该基因与其它基因差异的标签 expressedsequencetag EST 然后以该标签作为获得新基因的依据 3 基因表达系列分析法 基本原理 一个基因转录的mRNA上一段9 10个碱基的核苷酸序列 sequencetag ST 序列标签 代表一个特定的转录产物 它们能被识别位点为四个碱基的限制性核酸内切酶 anchoringenzyme AE 锚定酶 所切割 多个序列标签通过酶切和酶连后成为双标签序列的多联体 将多联体克隆到测序载体上 通过连续序列分析确定每个ST序列在转录产物中的拷贝数 频率 通过与Genebank序列比较 确定某一种ST序列是新的基因或是已克隆的基因 基因表达系列分析法克隆分析目的基因 3 杂交法分离目的基因 1 差别杂交法 对于两个不同生长状态的细胞群体 目的基因在其中一个细胞群体中得到表达 而在另一个细胞群体中没有表达 两个细胞群体的mRNA存在明显差异 利用可表达目的基因的mRNA构建cDNA文库 分别与两个细胞群体总mRNA反转录后制备的cDNA探针进行杂交 根据杂交结果的差异 筛选阳性克隆子 差别杂交法筛选含目的基因的阳性克隆子 2 减法杂交分离目的基因 减法杂交 subtractivehybridization 又称为扣除杂交或减数杂交 通过杂交技术除去两种细胞群体中普遍存在的基因序列 使目的基因序列得到有效的富集 适合于目的基因拷贝数较低的基因的分离 减数杂交分离目的基因 4 差示分析法分离目的基因 mRNA差异显示 根据真核生物mRNA带有poly dA 的结构 合成poly dT MN引物与mRNA的3 端互补 在反转录酶的作用下合成cDNA mRNA杂交分子 然后合成5 随机引物 通过PCR扩增获得所有mRNA的cDNA分子 通过凝胶电泳检测出差异的cDNA条带 差别显示克隆目的基因 5 功能结合法筛选目的基因 原理 在cDNA表达文库中 目的基因表达产物能与其它反应底物 探针 结合 形成一种稳定的可明显区别的特征 从而获得含有目的基因的克隆子 功能结合法筛选目的基因 6 DNA插入诱变分离目的基因 原理 将一段特定的DNA序列 标签DNA 插入到植物某一基因内部或相邻位置 诱导该基因突变并形成突变体 再以标签DNA为探针从突变体基因组DNA文库中分离突变基因片断 再根据突变基因片断制备探针 从野生型植株基因组中分离野生型目的基因 转座子标签法分离目的基因 T DNA标签插入诱变分离目的基因 7 基因定位克隆分离目的基因 原理 根据目的基因在基因组上的位置特性对其进行克隆 通过DNA连锁分析 染色体缺失等方法将目的基因或其突变体定位到染色体上 在目的基因的一侧或两侧确定一条或一对紧密连锁的RFLP分子标记 利用紧密连锁的DNA分子标记序列作为探针 通过染色体步查等将含目的基因的克隆分离 对目的基因进行测序及相关分析 基因定位克隆分离目的基因的条件 构建含有大片断DNA的基因组文库 YAC文库BAC Bacterialartificialchromosome 文库TAC Transformation competentartificialchromosom 文库与目的基因紧密连锁