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乙型肝炎病毒细胞模型研究进展国外医学?流行病学传染病学分册生箜鲞筮塑塑!望P笪!Q臣!Q!:!.?295? 乙型肝炎病毒细胞模型研究进展 王字平江家骥 【摘要】乙型肝炎病毒(HBV)的体外培养细胞模型是研究HBV生物学特性,乙型肝炎发病机制,体外抗 HBV药物筛选及致癌机制的重要工具.目前已根据不同的需要建立起多种HBV细胞模型. 【关键词】乙型肝炎病毒;细胞模型 乙型肝炎病毒(HBV)是一种较为严格的嗜肝 DNA病毒,由于病毒黏附以及DNA转录和复制对宿 主有严格的要求,HBV只感染人类和类人猿.对 HBV的研究由于缺乏合适的可利用的动物模型而受 到一定限制,人类还不能全面了解HBV感染人体后 所产生的一系列生理病理变化的机制.1986年 Sureau等利用电穿孔基因转移技术,将ayw亚型 HBVDNA导入体外培养的人肝癌细胞系HepG2细 胞,获得的转染细胞系成功表达了HBV的全部病毒 标志,并从培养上清液及细胞裂解物中证实了Dane 颗粒存在,HBV的体外培养才获得真正突破.建立 表达HBV的体外培养细胞模型,对研究HBV生物学 特性,乙型肝炎发病机制,体外抗HBV药物筛选及 致癌机制的研究有重要意义. 1.肝源细胞系 肝脏是HBV感染和复制的主要场所,故肝细胞 是HBV感染模型的首选细胞.目前应用于HBV培 养的细胞系有成人肝细胞系,胚胎肝细胞系和肝癌 细胞系,尤其是肝癌细胞系,如HepG2,Huh6一C15, Huh一7,Hep3B,PLC/PRE/5等,在HBVDNA及其基因 组片段的转染细胞系的建立中占有重要的地位. 1.1成人肝细胞模型 用含HBV感染颗粒的人血清接种培养的成人 肝细胞,可在上清中检测到HBV抗原和HBVDNA, 表明HBV可感染原代培养的成人肝细胞,同时用 presl特异性抗血清能阻断病毒感染.在含2% 二甲亚砜(DMSO)培养液中加入聚乙二醇,可显着增 强HBVDNA内吞量和提高病毒的吸附效率而不改 变HBV感染的组织及种属特异性.HBV感染成人 肝细胞模型与自然感染过程相似,病毒抗原可在较 作者单位:350304,福州医科大学,在职研究生, 工作单位为福建卫生学校检验科(王宇平); 3513025,福建医科大学传染病教研室(江家骥) 长时间内存在,细胞内出现HBVDNA复制型,但成 人肝细胞是一类终末分化的细胞,不能传代培养,且 在肝细胞铺板后,成熟肝细胞的功能(如白蛋白产生 能力)下降,失去典型多角形态,对病毒敏感性也逐 渐下降,限制其实际应用_2j. 1.2胚胎肝细胞模型 人胎肝细胞系可较好模拟人体内肝细胞的生物 学功能,并对血清HBV感染敏感,可产生HBV复制 型和各种病毒标志物,释放Dane颗粒.来自不同胎 龄的胎肝细胞对HBV感染显示相同的感染动力 学_3j,但成熟的原代胎肝细胞体外长期培养非常困 难,细胞分化能力有限,不能多次传代,且胎肝细胞 的分化状态对病毒复制可能产生影响,限制了其应 用和研究. 1.3HepG2细胞 是HBV细胞培养中最常用的细胞株之一.用 重组载体pDoLTHBV一1(含2个HBV头对尾二聚体, 以尾对尾方向串联)转染HepG2细胞,经G418筛选, 获得一个产高水平HBeAg及HBsAg的细胞克隆,称 之为2.2.15细胞.病毒在2.2.15细胞内复制可持 续很长时间,可传代培养维持达1年,是应用最为广 泛的乙型肝炎细胞模型.该细胞株培养上清液可检 测到HBVDNA,免疫电镜可检出22nm球形及杆状 颗粒和42nm颗粒.将培养上清注射黑猩猩可致典 型肝炎症状,进一步证实HBV转染的HepG2细胞支 持病毒体的复制.其缺点是:HBV整合于宿主细胞 染色体上,且不能被清除;表达不稳定,随传代次数 增加主要抗原表达量逐渐降低;与其他肿瘤细胞株 相同,对血清直接感染不敏感.Ladner等l将对 四环素敏感的巨细胞病毒(CMV)启动子连接到 PBR322质粒上并与ayw亚型HBVDNA连接成 ptetHBV质粒,转染HepG2细胞获得HepAD38细胞 株,由于前C区基因受到破坏,HBVDNA产量比 2.2.15细胞高约11倍_5j.HepAD38细胞株可利用 四环素对HBV复制进行调控,培养所需的时间只有 国外医学-流行病堂篮堂盟生笠鲞筮塑!塑 2.2.15细胞的一半,适用于研究HBV复制过程和复 制中间型以及抗HBV药物筛选.利用CMV启动子 构建拉米夫定突变株质粒可用于HBV突变株以及 对拉米夫定耐药突变株的药物筛选6j.Delaney 等7,8利用杆状病毒AutographaCalifomia将具有复 制能力的HBV基因组导入HepG2细胞,可表达各种 HBV抗原,并能直接检测HBVcccDNA.用该系统对 拉米夫定的药效进行评价,发现拉米夫定能减少细 胞内复制中间体和细胞外HBVDNA,并且该系统还 可用于检测药物对HBV变异株的作用l_9j,但该系统 中杆状病毒进入细胞是通过非特异的摄取方式,每 个细胞内有多个HBV拷贝,并且通过杆状病毒介导 基因转移受物种限制性,不能作为动物体内试验的 方法.Sprinzl等lmj利用AdHBVI.3系统,将293细 胞包装好的病毒感染HepG2细胞获得成功.HBV DNA可在宿主细胞内高效独立复制,并可检测到病 毒复制各环节的中间产物;该系统利用腺病毒的泛 嗜性巧妙绕过了HBV感染的种属和器官特异性障 碍,使HBV可以感染多种跨种属细胞,如小鼠,大 鼠,树肝细胞,鸭肝细胞等,并提高了转染效 率_l;与2.2.15细胞相比,该细胞允许对HBVDNA 进行体外定点诱变,HBV复制水平和产量可通过调 节HBV重组腺病毒的感染数量进行控制,便于选择 合适的HBV复制水平进行药效试验;借助腺病毒的 感染过程,容易将HBV基因组导入细胞,提高了转 染效率;并且该模型还可用来研究不同种属和器官 来源的细胞支持HBV复制的能力,为研究HBV感染 的种属和器官特异性提供有力的工具. 1.4HepaRG细胞株 由于用血清直接感染细胞更接近自然感染状 态,适用于研究在自然条件下病毒吸附,穿入宿主细 胞的机制及抗体的中和作用,抗病毒治疗等,而过去 所建立的肝癌细胞株无法直接用患者血清感染. Gripon等从慢性丙型肝炎感染的肝癌患者体内分 离,加入DMSO和类皮质激素培养,建立的HepaRG 肝癌细胞株.HepaRG细胞株与正常的肝细胞相比 具有相似的形态学和生理学功能,既可用于转染,又 和原代肝细胞一样适合于HBV血清直接感染,从培 养上清中可检测到HBV抗原和HBVDNA,而且该细 胞株具有与正常人肝细胞相似的生物学特性,可以 应用于研究病毒感染的早期阶段包括仍然未知的病 毒分子受体,药物对病毒感染早期阶段的作用,抗病 毒药物的筛选,药物的毒理学和药理学在内的许多 领域 2.非肝源细胞系 1980年以来,在肝外组织如胰腺,肾脏,骨髓淋 巴样母细胞和外周血单个核细胞等中陆续发现了 HBVDNA及其基因产物,并且可作为HBV感染复发 的重要来源,提示HBV除了肝细胞外还有泛嗜性, 这是将非肝源细胞列入转染靶细胞的重要依据.目 前用于HBVDNA转染的非肝源性细胞系有:FL51, Hela细胞,单个核细胞系U937细胞,树突细胞等. 这些细胞系可表达病毒的全部或部分抗原,HBV DNA,表明其内环境可支持HBV复制,包装和分泌. HBV基因在U937和树突细胞中成功表达对研究 HBV复制机制,在骨髓来源的细胞系中的调节,免疫 系统对HBV的影响等十分有用,但非肝脏细胞装配 和分泌的HBV颗粒,只是类似于天然状态的HBV病 毒颗粒,与真正天然状态的HBV颗粒有很大差 异13l 3.动物细胞系 许多研究表明,HBV可在动物细胞系中获得短 暂或较长时间的表达.deMeyerHj等研究表明HBV S基因表达的小蛋白(SP)能与Ca2依赖性磷脂结合 蛋白(humanannexinV)特异性结合,促使HBV进入 大鼠原代肝细胞复制并进行表达,介导HBV跨种属 特异性感染.在动物细胞系中的成功转染表明, HBV感染的种属屏障在于其对靶细胞细胞膜的吸附 及透过,而HBV的复制和表达则依赖于肝细胞内环 境.此外,小鼠成纤维细胞系NIH3T3和LtK一,大鼠 Morris肝癌细胞系Q7,果蝇细胞,非洲绿猴肾细胞 Veto等,也常被选为转染靶细胞,可表达HBV的抗 原和分泌病毒颗粒.HBV在非人类细胞内复制的细 胞模型可作为在人类细胞内复制模型的补充15. 4.展望 HBV细胞模型是筛选抗HBV药物,研究HBV 生物学特点及其与细胞问相互作用的必要工具.已 有的细胞模型在研究HBV发病机制,免疫机制,抗 病毒药物的筛选中发挥了一定的作用,但也存在问 题:(1)没有对病毒感染和致癌机制合适的细胞模 型;(2)细胞表达的稳定性问题.今后建立的细胞模 型应借助于分子生物学,分子细胞学的最新进展,寻 找既适用于转染,又可用血清直接感染,接近肝细胞 生理状态并能稳定表达HBV抗原的细胞模型,将对 研究HBV的生物学特性,感染机制,抗病毒药物的 筛选和致癌机制有重要帮助. 国外医堂?逋堂僮瘟:兰丛生旦笠鲞笙堡鲤!F】_IzLmol2gy,October2004,Vo1.31,No.5?297? 参考文献 1GallePit.HagelstemJ,konunerellB.eta1.InvitroexperimentalIn10ction ofprimaryhunmnhepatocytesthhepatitisBvires.Gashntem1o, 1994,106(3):664.673. 2GriponP.DiotC.GuguenGuillouzoC,Reprxxtuciblehighlevel;njLe1L,l ofculturedadulthumanhepatocytesbyhepatitisB订n】s:eff(lr. polyethyloneglycoloiladsorptionandpenetration.Virology,1993,192 (2):534.540. 3OchiyaT,TsorimotoT,UedaK,eta1.Aninvitrosystemforinfectionwith hepatitisBviresthatusesprimary. humanfetalhepatocytes.ProcNatl AcadSciUSA,1989,86(6):1875.1879. 4L,tldnerSK,OttoMJ,BarkerCS,eta1.Inducibleexpressionofhumanhep atitisBvires(HBV)instablytransfectedhepatoblastomacells:anovel systemforscreeningpotentialinhibitomofHBVreplication.:Matimicrob AgentsChemother,1997,41(8):17151720. 5ScaglioniPP,MelegariM,WandsJR.Posttranseriptionalregulationof hepatitisBviresreplicationbytheprecoreprotein.JVirol,1997,71(1): 345.353. 6WaltemKA,TipplesGA,AllenMI,eta1.Generationofstablecelllines expressinglamlvudineresistanthepatitisBviresforantiviralcompound screening.AntimicrobAgentsChemother,2003,47(6):19361942. 7DelaneyWE4th,IsomHC.HepatitisBviresreplicationinhumanhepG2 cellsmediatedbyhepatitisBviresrecombinationbaculovirus.Hepatolo gY,1998,28(4):11341146. 8DelaneyWE4th.MillerTG,I90mHC.UseofthehepatitisBvires13eCOlll binantbaculovimshepG2systemtostudytheeffectsof(一)一2,3一 dide-xV3一thiacvtidineonreplicationofhepatitisBvimsandaccumula, lionofcov,dentlyclosedcitelllill”DNA,AntimicrebAgentsChemother. 1999,43(8):2O17-2O26, 9DelaneyWE4th.刚wasR,ColledgeD,eta1.Crosresistancetestingof amihetmdnaviralcompeundsusingnovelrecombinantbaculovimses-,filch encodedrugresistantstrainsofhepatitisBvires,:MatimicrobAgents Chemother,2001,45(6):17()51713. 10SpfinzlIF.Oberink1erH,SchailerH,etal,TransferofhepatitisB”nls gentnnebyadenovimsvectorsintoculturedcellsandmice:Crossingthe speciesbartier.JVim1,2001,75(11):51085l18. 11RenS,NassalM.HepatitisB,n】s(HBV)vifionandcovalentlyclosed circularDNAformationinprimarytupaiahepatocytesandhumanhep, atomacelllinesuponHBVgenuinetransductionwithreplicationdefective adenovimsvectors.JVir01,20o1,75(3):l1O4一l116. 12GriponP,RuminS.UrbanS,etal,Infecfionofahumanhepatornacell linebyhepatitisBvires.ProcNailAcadSciUSA,2002,99(24):15655, 1566o. 13SerM,HeermannKH,GertichWH.ReplicationofhepatitisBviresin transfectednonhepaticcel1.Virology.1990,179(1):300-311. 14deMeyerS,GongZJ,HeogsK,eta1.Influenceoftheadministrationof humanarmexinVollinvitrobindingofsmallhepatitisBsurfaceantigeu tohuroanandtorathepatocytesandoninvitrohepatitisBviresinfec. tion.JViralHepat,2000,7(2):1l14. 15TangH,McLachlanA.TranscriptionalregulationofhepatitisBviresby nuclearhormonereceptorsisacriticaldeterminantofviraltropism.Prcc NatlAcadSeiUSA,200l,98(4):1841.1846. (收稿日期:2004-04-06) 猴痘在土拨鼠体内的传播和发病机制英/GuamerJ?, EmergInfectDis.2004,10(3).426431 2003年56月,美国报告了首批猴痘病例,其中大部分 病例可能通过接触土拔鼠感染.文章介绍了引起美国猴痘 爆发的2只感染猴痘病毒的土拔鼠,在病理,免疫组化 (mc),电镜和分子水平方面的发现. 所研究的2只土拔鼠来自加纳一家饲养有多种啮齿动 物的宠物店.结果发现,2只土拔鼠的眼睑有黄色粘液样分 泌物,1只在舌头中间有一条34mm长的溃疡;有50%的肺 组织发生红褐色实变;肝脏为红色,其间有一些散在的褐色 花斑状区域.经新型多元PCR法检测到肺组织标本中有典 型的正痘病毒序列存在,但标准的单基因P