第二章-离心分离技术.ppt

1 第二章离心分离技术 2 第一节离心机的种类与用途 一 离心技术离心技术在生物科学 特别是在生物化学和分子生物学研究领域 已得到十分广泛的应用 每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种形式的离心机 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备 生物样品悬浮液在高速旋转下 由于巨大的离心力作用 使悬浮的微小颗粒 细胞器 生物大分子的沉淀等 以一定的速度沉降 从而与溶液得以分离 而沉降速度取决于颗粒的质量 大小和密度 3 离心机的种类与用途 常速离心机按照转速分类高速离心机超速离心机 4 常速离心机 转速 8000r minR C F 1 104g用途 分离细胞 细胞碎片 培养基残渣等固形物的分离 也可用于酶的结晶等较大颗粒的分离 5 高速离心机 转速1 104 2 5 104r minR C F1 104g 105g用途 分离各种沉淀物 细胞碎片及较大的细胞器等为了防止离心过程中温度升高而造成酶等生物分子的变性失活 有些高速离心机装设有冷冻装置 谓之冷冻高速离心机 6 超速离心机 转速2 5 104 12 104r minR C F106g或更高结构 离心管帽 冷冻装置和温控系统 真空系统 安全保护系统 制动系统 指示仪表等 按用途分 制备型超速离心机 分离纯化生物大分子 细胞器 分析型超速离心机 测定样品纯度 根据紫外吸收率或折光率等判断 沉降系数 相对分子量 7 离心机其他分类方式 间歇根据操作方式可分为半连续连续分析用根据用途可分为制备用分析 制备两用工业离心设备中 常见的有管式和碟片式两大类 8 离心机简单示意 9 第一节离心机的种类与用途 10 管式离心机 11 碟片式离心机 喷嘴型 12 第一节离心机的种类与用途 二 离心机的主要构造和类型 离心机可分为工业用离心机和实验用离心机 实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机 制备性离心机主要用于分离各种生物材料 每次分离的样品容量比较大 分析性离心机一般都带有光学系统 主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质 依据待测物质在离心场中的行为 用离心机中的光学系统连续监测 能推断物质的纯度 形状和相对分子质量等 分析性离心机都是超速离心机 13 第一节离心机的种类与用途 1 制备性离心机可分为三类 低速离心机 最大转速8000rpm左右 最大相对离心力约为10000g 容量为几十毫升至几升 分离形式是固液沉降分离 可用水平转头 角度转头 其转速不能严格控制 通常不带冷冻系统 于室温下操作 用于收集易沉降的大颗粒物质 如红血球 酵母细胞等 这种离心机多用交流整流子电动机驱动 电机的碳刷易磨损 转速是用电压调压器调节 起动电流大 速度升降不均匀 一般转头是置于一个硬质钢轴上 因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要 否则会损坏离心机 14 第一节离心机的种类与用途 高速离心机 最大转速为10000 25000rpm r min 最大相对离心力为100000 g 分离形式也是固液沉降分离 通常配有各种角式转头 荡平式转头 区带转头 垂直转头和大容量连续流动式转头 一般都有制冷系统 以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量 离心室的温度可以调节和维持在0 40oC 转速 温度和时间都可以严格准确地控制 并有指针或数字显示 通常用于微生物菌体 细胞碎片 大细胞器 蛋白质的硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离纯化工作 但不能有效地沉降病毒 小细胞器 如核蛋白体 或单个分子 15 第一节离心机的种类与用途 超速离心机 大于2 5 10 104r min 最大离心力106g 有驱动和速度控制系统 温度控制系统 真空系统 减少摩擦 新式的有微处理机 按编定程序运转 自动计算速度和时间 有40多种不同容量和性能的转头给用户选择 离心容量由几十毫升至2升 分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离 离心管平衡允许的误差要小于0 1克 超速离心机的出现 使生物科学的研究领域有了新的扩展 它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离 还可以分离病毒 核酸 蛋白质和多糖等 16 第一节离心机的种类与用途 角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头 它是由一块完整的金属制成的 其上有4 12个装离心管用的机制孔穴 即离心管腔 孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20 40度之间 角度越大分离效果越好 优点是具有较大的容量 且重心低 运转平衡 寿命较长 颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管壁 然后再沿管壁滑向管底 因此管的一侧就会出现颗粒沉积 此现象称为 壁效应 壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱 影响分离效果 2 转头 角式转头 17 第一节离心机的种类与用途 荡平式转头 这种转头有4或6个自由活动的吊桶 离心套管 当转头静止时 吊桶垂直悬挂 当转头转速达到每分钟200到800转时 吊桶荡至水平位置 这种转头最适合做密度梯度区带离心优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中 离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴 而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度 因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带 其缺点是颗粒沉降距离长 离心所需时间也长 18 第一节离心机的种类与用途 19 第一节离心机的种类与用途 区带转头 区带转头无离心管 主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成 转子桶中装有十字型隔板装置 把桶内分隔成四个或多个扇形小室 隔板内有导管 梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入 通过这些导管分布到转子四周 转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定 20 第一节离心机的种类与用途 沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头 在径向的散射离心力作用下 颗粒的沉降距离不变 因此区带转头的 壁效应 极小 可以避免区带和沉降颗粒的紊乱 分离效果好 而且还有转速高 容量大 回收梯度容易和不影响分辨率的优点 使超离心用于制备和工业生产成为可能 区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头 耐腐蚀要求高 操作复杂 21 第一节离心机的种类与用途 垂直转头 其离心管垂直放置 样品颗粒的沉降距离短 离心所需时间也短 适用于密度梯度区带离心 离心开始时和结束时液面和样品区带要作九十度转向 因而降速要慢 22 第一节离心机的种类与用途 连续流动转头 可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离 转头与区带转头类似 由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成 离心时样品液由入口连续流入转头 在离心力作用下 悬浮颗粒沉降于转子桶壁 上清液由出口流出 23 第一节离心机的种类与用途 3 离心管离心管主要用塑料和不锈钢制成 不锈钢管强度大 不变形 能抗热 抗冻 抗化学腐蚀 但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品 如强酸 强碱等 塑料离心管常用材料有聚乙烯 PE 聚碳酸酯 PC 聚丙烯 PP 等 其中PP管性能较好 塑料离心管的优点是透明 或半透明 硬度小 可用穿刺法取出梯度 缺点是易变形 抗有机溶剂腐蚀性差 使用寿命短 塑料离心管都有管盖 离心前管盖必须盖严 倒置不漏液 管盖有三种作用 防止样品外泄 用于有放射性或强腐蚀性的样品时 这点尤其重要 防止样品挥发 支持离心管 防止离心管变形 24 第一节离心机的种类与用途 4 分析性离心机分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统 以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程 从而确定其物理性质 利用特殊配置的数据处理机自动计算s 沉降系数 和Mr 主要用于生物大分子的相对分子质量测定 估价样品纯度和检测生物大分子构象的变化等 主要产品有美国Beckman公司的ModelE及日本日立公司的282型 25 第一节离心机的种类与用途 26 第一节离心机的种类与用途 分析性超速离心机的转头是椭圆形的 以避免应力集中于孔处 转头通过一个有柔性的轴联接到高速的驱动装置上 转头在低温和真空的腔室中旋转 转头上有2 6个装离心杯的小室 离心杯是扇形石英的 可以上下透光 离心机中装有光学系统 在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质 在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片 在分析离心杯中物质沉降情况时 在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜 结果在检测系统的照像底板上产生了一个 峰 随着沉降的不断进行 界面向前推进 因此峰也移动 从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度 分析性超速离心机的主要特点就是能在短时间内 用少量样品就可以得到一些重要信息 能够确定生物大分子是否存在 其大致的含量 计算生物大分子的沉降系数 结合界面扩散 估计分子的大小 检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例 测定生物大分子的分子量 还可以检测生物大分子的构象变化等 27 二 离心方法的选择 对于常速和高速离心机 由于所分离的颗粒大小和密度相差较大 只要选择好离心速度和时间 就能达到分离效果 超速离心的离心方法 差速离心 密度梯度离心和等密度梯度离心 28 第二节离心方法的选择 一 基本原理 离心力 centrifugalforce Fc 当一个粒子 生物大分子或细胞器 在高速旋转下受到的离心作用力 Fc 由下式定义 Fc m a m 2ra 粒子旋转的加速度 m 沉降粒子的有效质量 粒子旋转的角速度 r 粒子的旋转半径 cm 29 第二节离心方法的选择 相对离心力 relativecentrifugalforce RCF 由于在转速相同的情况下 离心力会随离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离变化 因此在文献中常用 相对离心力 或 数字 g 表示离心力 RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数 RCF Fc Fg 1 12 10 5 n2 r g Fc为离心力 Fg为地心引力 r为离心转子的半径距离 以cm为单位 g为地球重力加速度 980cm sec2 n为转子每分钟的转数 r min 或rpm 30 第二节离心方法的选择 一般在低速离心时 转速小于5000r min 离心力的大小常用r min来表示 而超速离心时则用g或 g来表示 由于离心管中从管口到旋转中心的距离是不同的 所以在同样转速时 管口和管底所受到的离心力也有差别 例如 在某个角度转头中 离心管口到旋转中心的距离为4 8cm 而离心管底到旋转中心的距离是8 0cm 当转速为12000r min是 离心管口和离心管底所受到的相对离心力RCF分别是 RCF 管口 1 12 10 5 12000 2 4 8 7734gRCF 管底 1 12 10 5 12000 2 8 0 12891g科技文献中离心力的数据通常是指其平均值 RCFav 即离心管中点的离心力 旋转轴 340 rmin rav rmax 31 第二节离心方法的选择 为便于进行转速和相对离心力之间的换算 Dole和Cotzias利用RCF的计算公式 制作了转速 rpm 相对离心力 RCF 和旋转半径 r 三者关系的列线图 图式法比公式计算法方便 换算时 先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数 然后将这两点间划一条直线 与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值 32 转速 离心力与离心半径的关系 33 第二节离心方法的选择 沉降系数 sedimentationcoefficient S 根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度 若 用2 n 60表示 则 X1 离心前粒子到旋转轴的距离 X2 离心后粒子到旋转轴的距离 S 一般在10 13秒左右 故把沉降系数10 13秒称为一个Svedberg单位 简写S 量纲为秒 例如 动物细胞的核糖体沉降系数等于80S 它的含义就是 80 10 13s 细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异 所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开 34 第二节离心方法的选择 4 沉降系数与物质相对分子质量 由沉降系数根据Svedberg公式可以计算出物质的相对分子质量 Mr RTS20 w D20 w 1 Mr 相对分子质量 D20 w 以20 的水为介质时颗粒的扩散系数 R 气体常数 T 绝对温度 S20 w 以20 的水为介质时颗粒的沉降系数 偏比容 等于溶质粒子密度的倒数 溶剂密度 35 第二节离心方法的选择 5 沉降速度 sedimentationvelocity 对于球形颗粒Fc 1 6 d3 p m 2XFf 3 dv当Fc Ff时 1 6 d3 p m 2X 3 dvv 1 18 d2 p m 2X Fc 离心力 Ff 摩擦力 d 球形粒子直径 流体介质的粘度 P 粒子的密度 m 介质的密度 v 粒子移动的速度从上式可知 粒子的沉降速度与粒子直径的平方 粒子的密度和介质密度之差成正比 离心力场增大 粒子的沉降速度也增加 从此式可以看出 当 P m 则S 0 粒子顺着离心场方向沉降 当 P m 则S 0 粒子到达某一位置后达到平衡 当 P m 则S 0 粒子逆着离心场方向上浮 36 第二节离心方法的选择 6 沉降时间 sedimentationtime Ts 在实际工作中 常常需要在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来 这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的 如果转速已知 则需确定分离某粒子所需的时间 根据沉降系数 S 式可得t 1 S lnXmax lnXmin 2X2 离心转轴至离心管底内壁的距离 X1 离心转轴至样品溶液面之间的距离 为转子角速度 rad s 其中 lnXmax lnXmin 2为一常数 称为转子因子k常数或k值 37 第二节离心方法的选择 7 K值 kfactor K值是用来描述在一个转子中 将粒子沉降到离心管底的效率 也就是溶液达到澄清的一个指数 所以也叫 cleaningfactor 原则上 K值愈小 粒子沉降到离心管底需要的时间愈短 通常 离心机的转子说明书中提供的K值 是在最大转速下所计算出来的数值 若未达到最大转速 可用下试计算K值 12K1 22K2利用此公式预估的离心时间 对水平式转子最适合 对固定角式转子而言 实际时间将比预估的时间短一些 38 第二节离心方法的选择 一 差速离心Differentialcentrifugation 这是最普通的离心法 即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心 使沉降速度不同的颗粒 在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法 此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间 当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时 在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀 分出的上清液在加大转速下再进行离心 又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液 如此多次离心处理 即能把液体中的不同颗粒较好地分离开 此法所得的沉淀是不均一的 仍杂有其它成分 需经过2 3次的再悬浮和再离心 才能得到较纯的颗粒 39 第二节离心方法的选择 40 第二节离心方法的选择 41 第二节离心方法的选择 二 密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度 将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部 通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层 分离 类型 速度沉降 等密度沉降 常用介质 氯化铯 蔗糖 多聚蔗糖 分离活细胞的介质要求 1 能产生密度梯度 且密度高时 粘度不高 2 PH中性或易调为中性 3 浓度大时渗透压不大 4 对细胞无毒 42 第二节离心方法的选择 离心管先装在密度梯度介质溶液 样品液加在梯度介质的液面上 离心时 由于离心力的作用 颗粒离开原样品层 按不同沉降速度向管底沉降 离心一定时间后 沉降的颗粒逐渐分开 最后形成一系列界面清楚的不连续区带 沉降系数越大 往下沉降越快 所呈现的区带会越靠近离心管底 43 第二节离心方法的选择 由 P m可知S 0 因此该离心法的离心时间要严格控制 既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带 又要控制在任一粒子达到离心管底之前 如果离心时间过长 所有的样品可全部到达离心管底部 离心时间不足 样品还没有分离 离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束 样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度 梯度介质通常用蔗糖溶液 其最大密度和浓度可达1 28kg cm3和60 此法是一种不完全的沉降 沉降受物质本身大小的影响较大 一般是用于分离大小相异而密度相似的物质 44 什么是等密度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时 在离心力作用下 不同浮力的物质颗粒或向下沉降 或向上漂浮 一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置 等密度点 形成区带 这种方法称为等密度梯度离心 或称为平衡密度离心 3 等密度离心 isopycnicsedimentation 第二节离心方法的选择 45 第二节离心方法的选择 用途 分离密度不等的颗粒 特点 介质密度高 陡度大 介质最高密度大于被分离组分的最大密度 力场比速率沉降法大10 100倍 需要高速或超速离心 原理 样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处 并停留在那里达到平衡 从而将不同密度的成分分离 46 等密度离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差 密度差越大 分离效果越好 与颗粒的大小和形状无关 这种方法一般应用于物质的大小相近 而密度差异较大时 47 等密度离心与密度离心的区别 在密度梯度离心方法中 欲分离的颗粒并未达到其等密度的位置 而等密度离心则要求欲分离的颗粒处于密度梯度中的等密度点上 等密度梯度离心所采用的离心介质及其密度梯度范围与密度梯度离心不同 48 49 在等密度梯度离心中蔗糖的梯度的作用与密度梯度离心中梯度原理是不同的 在密度梯度离心中梯度的目的是减少样品的扩散 相反 在等密度梯度离心中 使用的密度是足以阻止颗粒移动的密度 当颗粒达到与本身密度相同的密度区时就会停留在该区域 50 梯度材料的选择 作为一种理想的梯度材料应具备以下几点 与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性 且易与所分离的生物粒子分开 可达到要求的密度范围 且在所要求的密度范围内 粘度低 渗透压低 离子强度和pH变化较小 不会对离心设备发生腐蚀作用 容易纯化 价格便宜或容易回收 浓度便于测定 如具有折光率 对于超速离心分析工作来说 它的物理性质 热力学性质应该是已知的 这些条件是理想条件 完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的 51 下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料 糖类 蔗糖 甘油 聚蔗糖 右旋糖酐 糖原 无机盐类 CsCl 氯化铯 RbCl 氯化铷 NaCl KBr等 有机碘化物 三碘苯甲酰葡萄糖胺 matrizamide 等 硅溶胶 如Percoll 蛋白质 如牛血清白蛋白 重水 非水溶性有机物 如氟代碳等 52 梯度材料的应用范围 蔗糖 水溶性大 性质稳定 渗透压较高 其最高密度可达1 33g ml 且由于价格低容易制备 是现在实验室里常用于细胞器 病毒 RNA分离的梯度材料 但由于有较大的渗透压 不宜用于细胞的分离 53 聚蔗糖 商品名Ficoll 常采用Ficoll 400也就是相对分子重量为400000 Ficoll渗透压低 但它的粘度却特别高 为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度 主要用于分离各种细胞包括血细胞 成纤维细胞 肿瘤细胞 鼠肝细胞等 54 Percoll 是商品名 它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮 渗透压低 它对生物材料的影响小 而且颗粒稳定 在冷却和冻融情况下还是稳定的 其粘度高 且在酸性pH和高离子强度下不稳定 它可用于细胞 细胞器和病毒的分离 卤化盐类 KBr和NaCl可用于脂蛋白分离 KI和NaI可用于RNA分离 其分辨率高于铯盐 NaCl梯度也可用于分离脂蛋白 NaI梯度可分离天然或变性的DNA 55 氯化铯 是一种离子性介质 水溶性大 最高密度可达1 91g ml 由于它是重金属盐类 在离心时形成的梯度有较好的分辨率 被广泛地用于DNA 质粒 病毒和脂蛋白的分离 氯化铯是目前使用的最好的离心介质 它在离心场中可自行调节形成浓度梯度 并能保持稳定 56 5 介质密度梯度的制备 由以上等密度离心的基本过程可知 采用介质密度梯度的主要目的是形成一系列具有不同密度的区域 以使具有不同浮力密度的颗粒处于其等密度区而彼此分离 介质的密度沿旋转半径增加 接近管底处的密度高于样品的最大密度 液面部分的密度低于样品的最小密度 等密度离心的介质密度梯度一般通过离心的方法来制备 如高浓度盐溶液 在离心力作用下盐离子依次向管底沉降 形成从液面到管底逐渐增加的密度梯度 同时溶质的扩散又会阻碍这种梯度的形成 经过足够时间离心后 两个过程可达到平衡 形成盐溶液密度梯度 并在某一固定转速下保持稳定 57 6 以氯化铯为例 在以氯化铯为介质时 产生所需起始密度的CSCl的重量 可按下列公式计算 式中 每100ml样品液所需加入的CSCl克数d 所需制备的CSCl溶液在25 的密度 58 为了便于应用 右表列出了氯化铯起始密度d 氯化铯的重量 及氯化铯溶液的最终体积V之间的关系 59 离心操作时 先把一定浓度的介质溶液与样品液混合均匀 也可将一定重量的结晶铯盐加到一定量的样品液中使之溶解 然后在选用的离心力下 经过足够时间的离心力分离 铯盐在离心场中沉降 自动形成密度梯度 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成区带 60 必须注意的是在采用铯盐等重金属盐作为离心介质时 它们对铝合金的转子有很强的腐蚀性 要防止介质溅到转子上 使用后要将转子仔细清洗和干燥 有条件的最好采用钛合金转子 61 当欲分离的颗粒的浮力密度已知时 也可不用密度梯度来进行等密度梯度 方法是先将样品在适当的离心力作用下离心 使较重的颗粒都沉降除去 然后将含待分离颗粒的上清夜悬浮在与其浮力密度相同的介质溶液中 再进行离心 直至所需的颗粒沉降到离心管底 此法只适用于分离某些已知的颗粒 62 第二节离心方法的选择 Velocity A andEquilibrium B sedimentation 63 第二节离心方法的选择 64 第二节离心方法的选择 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl 其密度可达1 7g cm3 此法可分离核酸 亚细胞器等 也可以分离复合蛋白质 但简单蛋白质不适用 收集区带的方法有许多种 用注射器和滴管由离心管上部吸出 用针刺穿离心管底部滴出 用针刺穿离心管区带部份的管壁 把样品区带抽出 用一根细管插入离心管底 泵入超过梯度介质最大密度的取代液 将样品和梯度介质压出 用自动部分收集器收集 65 第三节离心条件的确定 三 离心条件的确定 离心力 转速 离心时间温度pH值 66 第三节离心条件的确定 四 离心操作的注意事项 高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备 因其转速高 产生的离心力大 使用不当或缺乏定期的检修和保养 都可能发生严重事故 因此使用离心机时都必须严格