QIAamp Viral RNA Mini Kit中文说明书.doc

大致流程：QIAamp Viral RNA Mini Kit利用了硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，是同时纯化多个样品的理想选择。先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。用特殊的Rnase-free缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。纯化产物无蛋白质，核酸，其他杂质和抑制剂污染。无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA的极高回收率。所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。注意：1. 样品如果是冷冻保存的，要避免反复冻融。否则会导致蛋白质变性沉淀，降低病毒效价，最终减少产量。此外，沉淀还会堵塞QIAamp膜。若产生了沉淀，可以通过6800g，离心3min，小心吸取上清进行实验。2. 在将样品放入QIAamp分离柱前，一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳吸附条件。如果起始样品量较大，超过了140ul，那么最好分几次放入分离柱。3. 如果样品中存在细胞DNA，那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。为避免此现象的发生，推荐用无细胞液体提取病毒RNA。如果样品中含有细胞，如脑脊液，骨髓，尿液等，应该先过滤，或者1500g离心10分钟，然后取上清。如果RNA，DNA一起分离了出来，洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行消化，然后70，15min失活Dnase。4. column可以吸附大于200核苷酸的RNA，产量取决于样品大小，样品保存和病毒效价。流程推荐的起始样品量为140ul，不过280ul也是可以的。上柱前，小量的样品要用PBS调节到140ul，而低效价的样品要先行浓缩到140ul。对大于140ul的样品，上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加，但用于洗涤步骤的缓冲液AW1和AW2通常无需改变。如果起始样品量比较多，建议将裂解样品分多次进行上柱。无需担心柱子会超载，纯化产物的质量也不会受影响。样品量超过560ul时，最好先浓缩样品。需准备的东西（分离柱法）：无水酒精（96100）；1.5ml离心管；灭菌，Rnase-free枪头，离心机（适用于1.5ml和2ml离心管）。试剂准备：1. 吸取310ul buffer AVE加入到装有310ug冷冻carrier RNA的管子中，配成1ug/ul的溶液。充分溶解后，将其分成合适的等份，20冻存。反复冻融不要多于3次。2. 检查buffer AVL的沉淀情况，必要的话可置于80温育至沉淀溶解。按照表1及公式计算一批样品所需的buffer AVL-carrier RNA混合物的体积（说明书1516页写的比较清楚，不再详述）。轻柔的颠倒混匀10次，不要涡旋，避免产生泡沫。（Note：buffer AVL-carrier RNA应该现用现配，28可保存48小时。用前，存放时产生的沉淀必须在80加热重新溶解。溶解次数要小于6次。80加热不能超过5min。）n x 0.56 ml = y mly ml x 10 l/ml = z ln = number of samples to be processed simultaneouslyy = calculated volume of Buffer AVLz = volume of carrier RNABuffer AVE to add to Buffer AVL因此，carrier rna溶解在ave之后就大概5.6ul每管分装，或者10.2也可。之后冻存，由于其冻融不能超过3次。3. buffer AW1在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇（96100）稀释。（52904 19ml AW1需加入25ml乙醇）说明书17页4. buffer AW2在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇（96100）稀释。（52904 13ml AW1需加入30ml乙醇）说明书17页柱子的使用（分离柱法）：要避免交叉污染。1. 样品上柱时要小心，不要弄湿柱子的边缘。2. 在所有的移液步骤中注意要换枪头。3. 枪头主要不要碰到QIAamp膜。4. 斡旋后瞬时离心1.5离心管，将盖子上的液体甩下来5. 全程带手套，一旦手套接触到样品，立即更换手套。6. 放入离心机离心前要盖上column。7. 将column和收集管从离心里拿出后，将column放入新的收集管内。丢弃旧的收集管及过滤物，并妥善处置。8. 每次只打开一个column，注意避免产生悬浮颗粒离心：1. 收集管用1.5ml和2ml均可2. column离心一般在6000g（8000rpm）。全速离心也不会影响产量。裂解和第一次洗涤时离心速度可以稍低，保证所有的溶液都经过膜。第二次洗涤时应该全速离心。所有离心都可在室温下进行。操作流程：开始前：1. 使样品及buffer AVE达到室温。2. 检查buffer AW1和AW2是否按照说明配好3. 根据说明将溶于buffer AVE的carrier RNA加入到buffer AVL中流程：1. 吸取560ul准备好的buffer AVL（含有carrier RNA）到1.5ml离心管中。（根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA）2. 将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有buffer AVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。（为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用）3. 室温放置10min。（10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活）4. 瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。5. 样品中加入560ul无水乙醇（96100），斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。（只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不要用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量）6. 吸取630ul上步中的溶液小心的加入column（已装入到2ml离心管中）中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000g（8000rpm）离心1min。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。（每一个column都要盖上，以防交叉污染。8000rpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过）7. 小心的打开column的盖子，重复第6步。（如果样品量超过了140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱）8. 小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW1。盖上盖子，8000rpm离心，1min。将column放入新的2ml收集管（Kit提供）中，弃去旧的收集管。（即使样品量大于140ul，也无需增加buffer AW1的量）9. 小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心（14000rpm），3min。接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免buffer AW2残留，然后再进行第11步。（buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步）10. 推荐：将column放入新的2ml收集管（Kit中未提供）中，弃去旧的收集管，全速离心1min。11. 将column放在1.5ml离心管（kit中未提供）中。弃去旧的收集管。小心的打开column，加入60ul 室温的buffer AVE。盖上盖子，室温放置1min。8000rpm离心1min。（单次60ul buffer AVE可以洗脱膜上90的病毒RNA。每次40ul buffer AVL，洗两次，可以将产物量提高10。用小于30ul的buffer洗脱，将会降低产物量，也不会提高产物浓度。病毒RNA在20或70下可以稳定保存1年。）样品浓缩：针对病毒效价较低的样品进行，比较简单，请参阅第30页。问题指导：详细的问题指导可参考第3235页，内容比较简单清晰，不再详述注意事项：要注意避免Rnase污染：1. 应用微生物学无菌技术。手和灰尘是最常见的Rnase污染源，所以操作过程一定要带手套，勤换手套。尽可能的保证管子盖着。操作过程中，动作要迅速，以避免RNA降解。2. 过程中建议使用一次性管子。这些管子通常是无Rnase污染的，而且无需前处理（例如Axygen的产品）3. 非一次性器材在用前一定要进行处理，以避免Rnase污染。塑料制品应该用0.1M NaOH，1mM EDTA浸泡，然后用Rnase-free水浸泡。耐氯仿的制品也可以用氯仿浸泡。4. 玻璃器皿用前可以用去垢剂彻底浸泡，然后大于240烘箱烘4小时或更长（过夜）。也可以用DEPC处理。用0.1DEPC 于37浸泡过夜，然后高压灭菌或10