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文档简介
大致流程:QIAamp Viral RNA Mini Kit利用了硅胶膜的选择吸附的特性,结合真空或分离柱处理,是同时纯化多个样品的理想选择。先将样品在高变性条件下裂解,灭活RNase,确保病毒RNA的完整性。调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件,将样品转入QIAamp Mini column。RNA与膜结合,而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。用特殊的Rnase-free缓冲液洗脱得到的高质量的RNA,可以直接进行下游实验,也可储存备用。纯化产物无蛋白质,核酸,其他杂质和抑制剂污染。无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀,QIAamp膜就可以保证高纯,完整的RNA的极高回收率。所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。注意:1. 样品如果是冷冻保存的,要避免反复冻融。否则会导致蛋白质变性沉淀,降低病毒效价,最终减少产量。此外,沉淀还会堵塞QIAamp膜。若产生了沉淀,可以通过6800g,离心3min,小心吸取上清进行实验。2. 在将样品放入QIAamp分离柱前,一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳吸附条件。如果起始样品量较大,超过了140ul,那么最好分几次放入分离柱。3. 如果样品中存在细胞DNA,那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。为避免此现象的发生,推荐用无细胞液体提取病毒RNA。如果样品中含有细胞,如脑脊液,骨髓,尿液等,应该先过滤,或者1500g离心10分钟,然后取上清。如果RNA,DNA一起分离了出来,洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行消化,然后70,15min失活Dnase。4. column可以吸附大于200核苷酸的RNA,产量取决于样品大小,样品保存和病毒效价。流程推荐的起始样品量为140ul,不过280ul也是可以的。上柱前,小量的样品要用PBS调节到140ul,而低效价的样品要先行浓缩到140ul。对大于140ul的样品,上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加,但用于洗涤步骤的缓冲液AW1和AW2通常无需改变。如果起始样品量比较多,建议将裂解样品分多次进行上柱。无需担心柱子会超载,纯化产物的质量也不会受影响。样品量超过560ul时,最好先浓缩样品。需准备的东西(分离柱法):无水酒精(96100);1.5ml离心管;灭菌,Rnase-free枪头,离心机(适用于1.5ml和2ml离心管)。试剂准备:1. 吸取310ul buffer AVE加入到装有310ug冷冻carrier RNA的管子中,配成1ug/ul的溶液。充分溶解后,将其分成合适的等份,20冻存。反复冻融不要多于3次。2. 检查buffer AVL的沉淀情况,必要的话可置于80温育至沉淀溶解。按照表1及公式计算一批样品所需的buffer AVL-carrier RNA混合物的体积(说明书1516页写的比较清楚,不再详述)。轻柔的颠倒混匀10次,不要涡旋,避免产生泡沫。(Note:buffer AVL-carrier RNA应该现用现配,28可保存48小时。用前,存放时产生的沉淀必须在80加热重新溶解。溶解次数要小于6次。80加热不能超过5min。)n x 0.56 ml = y mly ml x 10 l/ml = z ln = number of samples to be processed simultaneouslyy = calculated volume of Buffer AVLz = volume of carrier RNABuffer AVE to add to Buffer AVL因此,carrier rna溶解在ave之后就大概5.6ul每管分装,或者10.2也可。之后冻存,由于其冻融不能超过3次。3. buffer AW1在用前需按照瓶子上的说明,加入无水乙醇(96100)稀释。(52904 19ml AW1需加入25ml乙醇)说明书17页4. buffer AW2在用前需按照瓶子上的说明,加入无水乙醇(96100)稀释。(52904 13ml AW1需加入30ml乙醇)说明书17页柱子的使用(分离柱法):要避免交叉污染。1. 样品上柱时要小心,不要弄湿柱子的边缘。2. 在所有的移液步骤中注意要换枪头。3. 枪头主要不要碰到QIAamp膜。4. 斡旋后瞬时离心1.5离心管,将盖子上的液体甩下来5. 全程带手套,一旦手套接触到样品,立即更换手套。6. 放入离心机离心前要盖上column。7. 将column和收集管从离心里拿出后,将column放入新的收集管内。丢弃旧的收集管及过滤物,并妥善处置。8. 每次只打开一个column,注意避免产生悬浮颗粒离心:1. 收集管用1.5ml和2ml均可2. column离心一般在6000g(8000rpm)。全速离心也不会影响产量。裂解和第一次洗涤时离心速度可以稍低,保证所有的溶液都经过膜。第二次洗涤时应该全速离心。所有离心都可在室温下进行。操作流程:开始前:1. 使样品及buffer AVE达到室温。2. 检查buffer AW1和AW2是否按照说明配好3. 根据说明将溶于buffer AVE的carrier RNA加入到buffer AVL中流程:1. 吸取560ul准备好的buffer AVL(含有carrier RNA)到1.5ml离心管中。(根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA)2. 将140ul血浆,血清,尿液,培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有buffer AVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒,混匀。(为保证裂解效率,一定要彻底混匀,形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用)3. 室温放置10min。(10分钟足够,延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活)4. 瞬时离心,将盖子上的液滴甩回管底。5. 样品中加入560ul无水乙醇(96100),斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心,将盖子上的液滴甩回管底。(只可以用乙醇,因为其他酒精会降低产量和纯度。不要用变性酒精,因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul,按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀,形成均一溶液,以保证产量)6. 吸取630ul上步中的溶液小心的加入column(已装入到2ml离心管中)中,注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子,6000g(8000rpm)离心1min。将column放入新的2ml离心管中,弃去旧的收集管。(每一个column都要盖上,以防交叉污染。8000rpm的速度是为了限制噪音,全速离心也是可以的,不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜,可以更高的速度再次离心,直到溶液完全透过)7. 小心的打开column的盖子,重复第6步。(如果样品量超过了140ul,那么重复此步骤,直到所有的裂解液都上柱)8. 小心的打开column盖子,加入500ul buffer AW1。盖上盖子,8000rpm离心,1min。将column放入新的2ml收集管(Kit提供)中,弃去旧的收集管。(即使样品量大于140ul,也无需增加buffer AW1的量)9. 小心的打开column盖子,加入500ul buffer AW2。盖上盖子,全速离心(14000rpm),3min。接着进行第11步,或者先进行第10步,以避免buffer AW2残留,然后再进行第11步。(buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动,导致回流,使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生,因此,最好先进行第10步)10. 推荐:将column放入新的2ml收集管(Kit中未提供)中,弃去旧的收集管,全速离心1min。11. 将column放在1.5ml离心管(kit中未提供)中。弃去旧的收集管。小心的打开column,加入60ul 室温的buffer AVE。盖上盖子,室温放置1min。8000rpm离心1min。(单次60ul buffer AVE可以洗脱膜上90的病毒RNA。每次40ul buffer AVL,洗两次,可以将产物量提高10。用小于30ul的buffer洗脱,将会降低产物量,也不会提高产物浓度。病毒RNA在20或70下可以稳定保存1年。)样品浓缩:针对病毒效价较低的样品进行,比较简单,请参阅第30页。问题指导:详细的问题指导可参考第3235页,内容比较简单清晰,不再详述注意事项:要注意避免Rnase污染:1. 应用微生物学无菌技术。手和灰尘是最常见的Rnase污染源,所以操作过程一定要带手套,勤换手套。尽可能的保证管子盖着。操作过程中,动作要迅速,以避免RNA降解。2. 过程中建议使用一次性管子。这些管子通常是无Rnase污染的,而且无需前处理(例如Axygen的产品)3. 非一次性器材在用前一定要进行处理,以避免Rnase污染。塑料制品应该用0.1M NaOH,1mM EDTA浸泡,然后用Rnase-free水浸泡。耐氯仿的制品也可以用氯仿浸泡。4. 玻璃器皿用前可以用去垢剂彻底浸泡,然后大于240烘箱烘4小时或更长(过夜)。也可以用DEPC处理。用0.1DEPC 于37浸泡过夜,然后高压灭菌或10
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