微生物实习总结.doc

华南农业大学2012微生物学教学实习总结专业：植物保护（微生物工程方向）指导老师：纪春艳，阮小蕾，卓侃课程名称：微生物教学实习班级：09植保微生物 2 班实习时间：2012.04.23-04.27（第十周）学号:200930200619学生姓名王艳丽1、 实习实验内容（1） 土壤微生物的分离、培养及识别1. 实验目的和内容目的：1）掌握从土壤中分离微生物的方法 2）掌握常用的分离纯化微生物的操作技术内容：1）用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌 2）用平板划线方法分离微生物 3）斜面接种及穿刺接种2. 实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化，方法有：单细胞挑取法、平板划线法和稀释倒平板法。本实验利用稀释倒平板从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。基本原理为：将含有各种微生物的土壤悬浮液进行稀释后涂布接种到各种选择培养基平板上，在不同条件下培养，从而使各种微生物在各自的培养基上形成单菌落。单菌落是一个细胞繁殖而成的集合体，即是一个纯培养。平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释样液接种到不同选择性培养基的平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，进行平板菌落计数。3. 实验材料1) 培养基 已灭菌的牛肉膏、高氏一号、查氏培养基。2) 仪器及用具 99mL无菌水1瓶，含9mL无菌水的试管6支，80%乳酸，95%乙醇，无菌培养皿，1mL无菌移液管，土壤样品、天平、称量纸、钥匙、试管架、涂布器。4. 操作步骤（1） 土壤稀释分离法分离纯化细菌、放线菌和霉菌1. 土壤样品采集待测地块上，若地块面积小于50平方米，对角线三点采样，若大于50平方米，对角线五点采样。 一般定点于耕作层0-20cm，先除去表土1-2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。2. 无菌操作制备土壤稀释液1) 制备土壤悬液：称取土样1g，迅速倒入含有99mL无菌水的三角瓶中，振荡510min，使土样充分打散，即成10-2的土壤悬液。2) 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液1mL，吹入9mL无菌水即成10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-310-8的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。3. 涂布法测定菌落数的方法1) 涂布法：将0.10.2mL菌悬液滴在平板表面中央位置，右手拿无菌涂布器平放于平板表面，将菌液先沿一条直线轻轻来回推动，使之均匀分布，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板边缘可改变方向用涂布器再涂布几次。2) 接种量和培养基：细菌：取10-6、10-7、10-8两管稀释液各0.2mL，分别接入两个牛肉膏蛋白胨琼脂平板中，涂布均匀。放线菌：取10-2、10-3、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液56滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出0.2mL加入高氏1号培养基平板中，涂布均匀。霉菌：取10-2、10-3、10-4两管稀释液各0.2mL，分别接入查氏培养基中，涂布摇匀。4. 培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于2830中恒温培养，细菌培养12d，放线菌培养57d，霉菌培养35d。观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。5. 划线分离细菌 用接种环从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离。划线的方法多样，目的是获得单个菌落。常用的划线方法有两种：连续划线和分区划线。6. 穿刺接种霉菌 用接种针将培养出的霉菌挑出，接种到新的查氏培养基上。5. 注意事项1) 一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。2) 在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。3) 放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。6. 实验结果与分析本小组任务是用涂布法分离土壤中的真菌，选用的是查氏培养基，因细菌长势比真菌快，且培养基中未加链霉素、抗生素等抑制细菌生长的物质，因此本次实验用于分离的9个培养皿全部长出了细菌，只有处理浓度为10-4土壤悬液中的一个皿中长出了少量真菌（即霉菌）菌落。划线法分离细菌：其中一个皿划线重复，未达到划线稀释的目的，最后没有长出单菌落，另一个皿虽划线无重复，但是划线次数较少，也没有分离出单菌落。霉菌分离：接种的地方有霉菌菌落长出，但其他地方也有霉菌菌落，分离结果不好。（二）水的细菌学检查细菌总数的测定1 目的要求通过实验掌握水样的采集和水样中细菌总数的测定方法。2. 实验原理1) 水中细菌总数的测定 水中的细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，水体被有机物污染的程度越重。水中细菌的种属繁多，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中的细菌的总数实际上是一种近似值。绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在肉膏蛋白胨培养基上进行生长。因此应用平板菌落计数技术来测定水样中的细菌总数基本上能代表水样中细菌的数量。2) 水中细菌总数的测定和计算在肉膏蛋白胨培养基上，1ml水样，经37，24h 培养后所生长出来的总菌数。我国饮用水的卫生学指标：在1ml自来水中细菌总数不得超过100个。3. 实验器材培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基；灭菌水其他用具：灭菌三角瓶，灭菌培养皿，灭菌试管 等4. 操作步骤1) 水样的采集 自来水：水龙头火焰灼烧3min，再开放水龙头流水5min后，以灭菌三角瓶接取水样。湖水：取距水面10-15cm的深层水样，最好立即实验，否则放入冰箱中保存。2) 细菌总数测定（1）自来水A、用灭菌管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中，做两个皿。B、分别倾入约15ml已溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。C、另取一空的灭菌培养皿，倾入约15ml肉膏蛋白胨琼脂培养基，作空白对照。D、培养基凝固后，倒置于37中，培养24h，进行菌落计数 。（2）湖水A、稀释水样：a、取4个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。b、取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀。c、再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此 稀释到第四管，稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4。B、自最后三个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。C、各倾入约15ml已溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。D、培养基凝固后，倒置于37中，培养24h，进行菌落计数。3) 菌落计数1、 自来水：两个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。2、 湖水：（1） 先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的1/2，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数。（2） 首先选择平均菌落数在30-300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。（3） 若有两个稀释度的平均菌落数均在30-300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，采取两者的平均值，若大于2，则取其中较小的菌落总数。（4） 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。（5） 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。（6） 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。5. 实验结果自来水：对照平板菌落为：0。自来水样两平板的菌落数分别为：3、1。所以1ml水样的细菌总数为2个/ml。湖水湖水样不同稀释度的平均菌落数10-210-310-4湖水1843湖水2739平均7.53.56.0由于所有稀释度的平均菌落数均小于30，所以按照稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。湖水中的细菌总数为7.5102个/ml。6. 思考题1、从自来水水样细菌总数检测的结果判断是否符合饮用水的卫生标准？答：由于我国饮用水的卫生学指标为：在1ml自来水中细菌总数不得超过100，而小组测定的自来水中细菌数为2个/ml。所以从自来水水样细菌总数检测的结果看，符合饮用水的卫生标准。2、 你所测的池塘水、河水、湖水的污秽度如何？通过实验你对保护水资源有何认识？答：我组所测的湖水污秽度较高，可能存在误差。通过实验使我们明白只有保护水源，保证其清洁，才能保证我们人类自身的利益，无论是饮食方面，还是环境方面。3、 试与其他同学的实验结果进行比较，从中判断你的实验结果误差如何？原因是什么？答：与其他同学的实验结果相比较，我组自来水水样细菌总数与他组相差不大，但湖水细菌总数少一些，可能原因是用倾注法倒入培养基时，培养基未冷却至45一下，所以高温杀死了大量细菌。4、请回答：干热灭菌、高压湿热灭菌、过滤除菌的原理及适用范围。答：1干热灭菌：通过烧灼或烘烤等方法，使微生物酶、蛋白质变性而杀死微生物。干热灭菌包括：烘箱热空气法：适用于金属和玻璃器皿的灭菌，也是唯一可用于油料和粉料物质的灭菌方法。火焰焚烧法：常使用酒精灯火焰焚烧接种环、接种针和试管口等经焚烧不会损坏的物品。2高压湿热灭菌：热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强，水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变形，还可以使细胞膜脂溶解。高压真气还可以破坏核酸结构，杀灭那些蛋白质外壳变性后仍具有侵染性的病毒。热蒸汽比空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物。蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，顾可迅速提高灭菌物体的温度。水煮沸法：适用于注射器、解剖用具及家庭餐具的消毒。高压蒸汽锅法：主要用于各种耐热耐湿物品的物品，如一般培养基、生理盐水等各种溶液、工作服及实验器材等。3过滤除菌：将液体通过某种多孔的材料，使微生物与液体分离。可用于对热敏感液体的灭菌，如含有酶或维生素的溶液、血清等。还可用于啤酒生产代替巴斯德消毒。2、 实习学习参观益力多公司参观及珠江啤酒集团参观（一）益力多乳制品制作流程及工艺 原料溶解罐（用热水将奶粉及糖类溶解成液状奶）杀菌机（杀菌后得到清洁的原料汁）种菌罐（存储益力多菌）培养罐（用益力多菌发酵，制造发酵液）糖浆罐（制造糖浆）调和液储存罐（将糖浆加到发酵液中制得原料液）混合机（将原料液和原料水混合调配成益力多的味道）成形机（制造益力多容器）灌装机（灌装益力多液）封盖机（封盖）收缩包装机（5支及50支包装成形）（2） 微生物与益力多乳制品制作（微生物原理）乳制品生产过程中利用的微生物是乳酸菌。益力多乳制品主要与干酪乳杆菌代田株（即益力多菌）密切相关，它利用人们提供的底物原料，在适宜的条件下大量生长、繁殖，是一种益生菌。益力多乳制品提供的是一种活菌，而不是益力多菌的代谢产物，据说，在一瓶益力多饮品中就有100亿个活性细菌。益力多菌符合益生菌的7个条件，即：1.能够耐受胃液、胆汁、以存活的状态到达肠内；2.能够在肠内增殖；3.被科学实验证明能够改善肠内菌群；4.能够确保安全性；5.原来就是人体肠道菌群的一种；6.存活在食品中并能保持有效的菌数；7.价廉且容易处理。产品一般可以改善微生物与酶的平衡或刺激特异性与非特特异性免疫，从而改善肠道菌群构成。饮用益力多菌可抑制肠内有害菌的增殖，有害菌所产生的各种有害物质则相应减少。此外，益力多菌产生的乳酸及乙酸能刺激肠道运行而改善排便。有研究表明，益力多菌能使体内NK细胞活性化，促进抗体的产生，从而提高人体自身对细胞的功击和病原体感染的防御能力。（三）珠江啤酒酿造流程及工艺麦芽仓（储存麦芽）粉碎机（粉碎麦芽）糖化锅（粉碎后的麦芽和一定量的酿造水混合，麦芽中的蛋白质分解成多肽和氨基酸，淀粉分解成麦芽糖、葡萄糖等糖类物质的过程）大米筛选机大米粉碎机（原料与处理）糊化锅（大米糊化）麦芽过滤槽（过滤糊化杂质）煮沸锅（过滤后的麦汁加入酒花、麦汁澄清剂等辅料，完成煮沸过程，目的是使麦汁达到一定浓度，杀死麦汁中全部的酶和致病菌及麦汁中的蛋白质絮凝等）酒花滤除器回旋沉淀槽（去除麦汁中的热凝固物，使煮沸后的麦汁清亮透明）麦汁冷却器（利用4冰水，经过薄板换热器将麦汁冷却到工艺规定的温度）空气过滤器酵母培养及添加罐（培养酵母）发酵罐（酵母利用麦汁中碳源和氮源两大能源物质，经过有氧呼吸和无氧发酵，将麦汁中的可发酵性糖分解成酒精、二氧化碳和其他一系列发酵副产物的过程）啤酒添加剂添加罐缓冲罐硅藻土添加罐硅藻土过滤罐硅藻土过滤机（利用硅藻土对啤酒后期处理）冷储藏过滤器储酒罐灌装出场（4） 微生物与珠江啤酒酿造 （微生物原理）用于啤酒酿造的微生物为酵母菌，啤酒的生产是依靠纯种啤酒酵母利用麦芽汁中的糖，氨基酸等可发酵性物质通过一系列的生物化学反应，产生乙醇,二氧化碳及其他代谢副产物，从而得到具有独特风味的低度饮料酒。啤酒发酵过程中主要涉及糖类和含氮物质的转化以及啤酒风味物质的形成等有关基本理论。冷麦汁接种啤酒酵母后，发酵即开始进行。啤酒发酵是在啤酒酵母体内所含的一系列酶类的作用下，以麦汁所含的可发酵性营养物质为底物而进行的一系列生物化学反应，通过新陈代谢最终得到一定量的酵母菌体和乙醇，CO2以及少量的代谢副产物如高级醇、酯类、连二酮类、醛类、酸类和含硫化合物等发酵产物，这些发酵产物影响到啤酒的风味、泡沫性能、色泽、非生物稳定性等理化指标，并形成了啤酒的典型性。啤酒发酵分主发酵(旺盛发酵)和后熟两个阶段。在主发酵阶段，进行酵母的适当繁殖和大部分可发酵性糖的分解，同时形成主要的代谢产物乙醇和高级醇、醛类、双乙酰及其前驱物质等代谢副产物；后熟阶段主要进行双乙酰的还原使酒成熟，完成残糖的继续发酵和CO2的饱和，使啤酒口味清爽，并促进了啤酒的澄清。（5） 益力多公司参观及珠江啤酒集团参观感受参观完益力多公司及珠江啤酒集团，深刻体会到微生物与我们的生活息息相关，微生物虽不起眼，却对人类的生活有巨大的影响，加深了我对微生物学的兴趣，同时对益力多公司及珠江啤酒集团一系列自动化设备表示赞叹。通过参观，了解了实际生产应用中微生物发酵工艺、流程、原理，理论与实际相结合，增进了对课本知识的理解。三、实习小论文啤酒制作过程中有害微生物的污染及控制摘要 本文主要讲述啤酒制作过程中有害微生物的类群、危害、鉴定及控制方法。1. 啤酒有害微生物啤酒生产中，有害微生物主要来源于压缩空气、水源、原料与辅料、接种酵母、设备与管路、包装材料以及各种用具、操作人员及周围环境等，种子酵母的污染和制作过程中的无菌程度尤其重要。有害微生物的生长繁殖会严重影响啤酒的风味、色泽、质量，因此能够快速、准确地检测出啤酒制作过程中的有害微生物并加以控制，是提高啤酒品质的重要因素之一。2. 啤酒有害微生物的类群2.1 按照污染细菌对啤酒生产的危害程度，可将啤酒酿造中常见的污染细菌分为啤酒有害微生物、啤酒间接有害微生物、啤酒潜在有害微生物。（1）啤酒有害微生物：此类菌在各种啤酒中能生长产生危害，并能通过多种途径传播，主要是革兰氏阳性的乳酸菌类、革兰氏阴性的果胶杆菌、巨球菌及野生酵母。（2）啤酒间接有害微生物：此类微生物具有腐败性质，但它们不能在正常的啤酒中生长，故可看作对啤酒无直接害处，例如芽抱杆菌对酒花物质非常敏感，以致不能在啤酒中生长，但它们能形成耐热的孢子，遗留在啤酒中。霉菌是需氧菌也不能在啤酒中生长，但能在原料、容器、包装材料上生长成菌落，产生霉昧，间接传到啤酒中，影响啤酒质量。（3）啤酒潜在有害微生物 ：此类菌是在一定条件下危害啤酒的细菌，包括链球菌、明串珠菌、乳链球菌、克氏小球菌等。当工艺控制出现不正常，啤酒中控制因素降低时，潜在有害菌才生长，特别是在以下情况下：PH值4.5、氧含量1mg/L、过低的苦味质低于20EBC单位、过高的发酵度与最终发酵度的差别(大于1%)、糖化不好等。2.2 按照对氧气的需求，啤酒制作过程中常见的有害微生物可分为：好氧微生物、微好氧微生物、兼性好氧微生物、绝对好氧微生物四大类群。以下简单介绍几种：（1）乳酸菌：是啤酒工厂污染的主要细菌，其中包含乳酸杆菌和足球菌两个属。它们广泛存在于发酵罐、管道、阀门、啤酒残液中。前者不耐酒花且在低温下生长缓慢，所以不污染啤酒发酵过程；后者会导致啤酒酸化，产生双乙酰的奶油气味，同时会分泌荚膜多糖，使啤酒粘稠、浑浊。（2）发酵单胞菌：发酵单孢菌污染可在包装啤酒中产生硫化氢和乙腔，另外，还能产生少量的二甲基硫和二甲基二硫。在较广的pH范围内生长。污染后会使啤酒变味。对酒花不敏感，耐酸耐酒精强。（3）果胶杆菌：是革兰氏阴性、过氧化氢酶阴性、严格厌氧菌。可在麦汁和包装啤酒中产生大量的乙酸、丙酸和3一羟基丁酮。在被果胶杆菌污染的啤酒中还可检出高浓度的H2S，啤酒出现混浊，并带有一股臭鸡蛋味。 （4）巨球菌：它是专性厌氧的、革兰氏阴性、过氧化氢酶阴性的球菌。可在啤酒中产生大量的丁酸，同时产生少量的乙酸、异戊酸及3一羟基丁酮。麦汁受到污染后，也会产生大量的丁酸和乙酸及少量的戊酸和异戊酸，但不会产生3一羟基丁酮。会给啤酒带来难闻的气味。（5）肠道细菌：发酵车间经常可以检测到如欧式杆菌属、克式杆菌属、多变杆菌属等，它们存在于植物、土壤和水中。肠道细菌在大麦中繁殖迅速，能产生烂白菜的气味，甚至有H2S的味道。在麦汁和发酵初期，也极易迅速繁殖，危害到啤酒的风味。但它在pH4.0以下，2.0%乙醇啤酒中不能繁殖。（6）变形肥大杆菌：污染后会使啤酒产生二甲硫味。它在pH低于3.9时不能生长，但耐6.0%乙醇。3. 啤酒有害微生物的危害（1）异味的产生：有害微生物的各种代谢产物，都能造成啤酒的异味，即使死亡或被除去，异味会依然留在啤酒中。（2）浑浊和沉淀：有害微生物在发酵和储酒中繁殖，会破坏啤酒的胶体平衡，使啤酒很难澄清，以致于过滤很困难。另外，过滤及包装以后，经热消菌和杀菌，微生物的死细胞体也会影响啤酒的澄清透明。（3）黏度升高：有害微生物分泌的多糖物质使啤酒黏度升高，变混影响啤酒外观，同时啤酒也丧失了爽口性。（4）压力提高：瓶装和罐装啤酒中，繁殖一些产气的微生物，如野生酵母和乳酸细菌，使瓶和罐的压力升高，增加容器爆炸的几率，对消费者有潜在的危险。（5）影响酵母的正常生长和繁殖：冷麦汁和发酵液被杂菌污染后，杂菌会与酵母争夺营养，使酵母使用代数缩短、发酵性能降低。再次接种，会导致异常发酵，副产物增多，啤酒风味败坏等。（6）增加消耗，生产效率下降4. 啤酒有害微生物的鉴定4.1 传统的固体培养基法（1） A麦汁培养基，用于检测细菌。利用麦康凯琼脂培养基并在培养基内加入中性红染色剂和放线菌酮以抑制酵母和大多数其他微生物的生长。在30下培养，24h检查菌落为红色、平滑者，可能是肠道细菌；红色、粘性者，可能是柠檬酸细菌；无色、微暗或黄色、平滑者，可能是哈夫尼菌。（2）LAB和MRS乳酸菌培养基，用于检测乳酸菌。利用MRS琼脂培养基、SAD李氏多级选择培养基及乳酸菌培养基分别在需氧或厌氧条件下2730培养，36天即可观察结果。（3）LYS和SDM赖氨酸和差别培养基，用于检测野生酵母。将待检测样品处理后涂布在结晶紫培养基上，28培养48h，凡能生长的即为酵母属野生酵母，非酵母属的野生酵母不会生长。（4）NBB培养基，它分为三种形式：NBBA适用于洗罐水、啤酒等样品的细菌检查；NBBB适用于酵母（回收酵母、培养酵母）的细菌检查；NBBC适用于有酵母的浑浊啤酒，如发酵液、未过滤啤酒。4.2 PCR技术（1）使用一套特异性的引物或一套由特异性引物和一个普通引物所组成的引物，此PCR技术仅产生一种产物。（2）用任意引物，得到一群长短不一的DNA片段混合物，此方法可以鉴别啤酒腐败菌的种及其亚种。（3）嵌套多聚酶链反应技术，其机理在于操作中需要两套引物。5. 啤酒有害微生物的控制5.1 来源控制（1） 水 原水在使用前必须进行膜过滤、紫外线杀菌和热脱氧等必要的处理。关键程序中应当使用无菌水，此外，生产中应尽量使用新鲜水，同时避免蓄水时间过长，要对输水管道、蓄水池或过滤装置等进行定期清洗和杀菌。（2） 气体 啤酒生产中常用的气体主要有氮气、CO2、压缩空气，而气体中的微尘或水分子是微生物传播的载体。这些气体常用于充氧、备压、引酒和充填、洗涤等，会直接接触麦汁和啤酒，因此，都必须达到无菌要求，尤其要注意以下几点：压缩空气（包括充氧和制氮气用）的气源，应当在一定的高空中进行采集。 氮气制备及发酵CO2回收处理过程中，要特别加强除菌和除水控制。 气路管道和过滤系统应定期进行CIP清洗和蒸汽反向灭菌。（3） 物料 生产用原辅料、生产过程使用的添加剂、助滤剂、包装物等物料都必须是安全卫生的。必须加强进厂入库的检测验收，以及使用前的检验和必要的处理。（4