苛养菌的分离培养

苛养菌的分离培养及鉴定方法 何为苛养菌 1 苛养菌主要是指对生长环境 营养要求较苛刻的细菌 在普通环境中不能或难以生长 体外培养需添加特殊因子或其他营养成分 2 苛养菌在临床上涉及到的主要有 嗜血杆菌属 肺炎链球菌 化脓性链球菌 奈瑟氏菌 布拉汉氏菌 军团菌等3 有一些特殊的实验可帮助苛养菌的鉴定 一些选择性培养基可帮助细菌的鉴定 血平板培养基 血平板培养基又叫血平板 主要用于链球菌及其他苛养菌的分离 培养及溶血活性的检测 主要成分 其中的蛋白胨和牛肉粉主要提供细菌生长所需要的碳源 氮源 氨基酸及维生素 氯化钠维持培养基中的渗透压 琼脂用做凝固剂 脱纤维羊血一方面提供一些特殊的生长因子 另一方面用于观察溶血反应 A嗜血杆菌属 与人类密切相关的嗜血杆菌有8种 比较常见的是流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌简称流感杆菌 属嗜血杆菌属 本属细菌因人工培养时必须加新鲜血液或血液成分方能生长 故名嗜血杆菌 流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属中最常见的对人有治病性的细菌 可引起原发性化脓性感染和呼吸道继发感染 近年来也是社区获得性肺炎的主要病原菌 流感杆菌 Hemophilusinfluenzae 是人类上呼吸道的正常菌群 以往一直被误认为是流行性感冒的病原菌 但实际致病范围极广 除引起呼吸道病变外 尚可引起脑膜炎 败血症 结膜炎 女性生殖道感染 蜂窝织炎等 不仅是婴幼儿感染的常见致病菌 亦是成人感染的病原菌之一 1 形态与染色流感嗜血杆菌是一群无动力 无芽孢 呈球杆状或多形态的革兰阴性小杆菌 菌落为圆形 无色 透明 2 培养特性需氧或兼性厌氧 培养时需要X因子和V因子 血液中因x子经加热可释放 故常用巧克力色培养基分离培养 另外金黄色葡萄球菌生长时能产生本菌需要的V因子 因此与金黄色葡萄球菌共同培养时 离金黄色葡萄球菌菌落近的生长好 形成卫星现象 副流感只需V因子 杜克氏只需X因子 该菌的药敏实验为HTM平板 3 致病物质和所致疾病致病物质主要为荚膜 菌毛与内毒素 根据荚膜多糖 b型致病力最强 所致疾病分原发感染和继发感染两类 前者为急性化脓性感染 后者常在流感 麻疹等感染后发生 临床有慢性支气管炎 中耳炎 鼻窦炎等 多见于成人 于1930年 流感嗜血杆菌分类为两类 即荚膜菌株及没有荚膜的菌株 虽然已知荚膜类的乙型流感嗜血杆菌是毒性的主因之一 但感染流感嗜血杆菌的病因仍未完全清楚 它们的荚膜能帮助它们抵抗在没有免疫的寄主体内的吞噬作用及不触发补体介导的裂解 没有荚膜的菌株则较少侵略 但它们能诱发炎症而产生其他病症 如会咽炎 病源菌根据不同的生化反应可分为6个生物型 和 致病者多为 和 型 根据荚膜多糖抗原性不同 可将有荚膜菌分为a b c d e和f6个血清型 b型致病力最强 其次为e和f 根据细菌外膜蛋白 OMP 又可分为不同的亚型 有荚膜者致病力大于无荚膜者 流感杆菌主要通过呼吸道在人与人之间传播 也可通过孕妇产道感染 新生儿由于有来自母体的被动免疫 故2个月内发病率低 3个月至3岁儿童的血清抗体水平最低 此期易产生感染 杜克雷嗜血杆菌 杜克雷氏嗜血杆菌的形态特点是短而细小 呈短棒状 两端较为钝圆 长约1 5微米 宽约0 5微米 往往成双平行排列呈双链状 大多数细菌分布在细胞外呈链状排列 仅少数细菌可在细胞内呈团块分布 人是它的储存宿主 对温度的敏感性很高 不耐热 超过38 时就很快死亡 干燥及65 时均可迅速死亡 但它的耐寒性能较强 从病灶中或培养菌落中取材检查可见2个或2个以上细菌连成锁状有如鱼群在游泳 故称鱼群状 在淋巴腺组织切片中可见典型的连锁杆菌 杜克雷嗜血杆菌对温度较敏感 43 44 以上温度则失去抵抗能力 20分钟即可死亡 对42 抵抗性稍强 但4小时死亡 在37 中可活6 8天 10 20 之间7 10天后可死亡 在此温度中较大肠菌 葡萄球菌抵抗力弱 较淋球菌强 对寒冷抵抗力较强 5 中可生存1周 冻干时可能生存1年 对干燥的抵抗性弱 在人工培养中温度是发育的重要因素 在19世纪以前人们把梅毒与软性下疳混为一谈 直到1889年 意大利皮肤病学家杜克雷从3例患有生殖器溃疡的病人患部取脓性分泌物 接种到自己身上 并形成了溃疡 他在自身患部排出的脓性分泌物中发现一种微生物 这种微生物特别喜欢在含有新鲜的人血或兔血的培养基上生长 所以被称之为杜克雷氏嗜血杆菌 就是以后证实的软性下疳致病菌 杜克雷嗜血杆菌对X因子需要性高 不需要V因子 将纯培养物注射入家兔可引起面部溃疡性病灶 人感染后 不能产生持久免疫力 B肺炎链球菌 1 形态与染色该菌为革兰染色阳性 菌体呈矛头状 成双或短链状排列的双球菌 有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜 普通染色时荚膜不着色 表现为菌体周围透明环 无鞭毛 不形成芽孢 菌体衰老时可呈现革兰染色阴性 2 培养特性和生化反应营养要求及在血平板上菌落特征基本同甲型链球菌 培养时间稍久菌落中央下陷呈脐窝状 在血清肉汤中培养稍久亦因细菌自溶而使浑浊的培养液变澄清 自溶酶可被胆汁或胆盐等物质活化 加速细菌溶解 故可用胆汁溶菌试验与甲型链球菌相区别 该菌通过optochin敏感实验得到鉴定 该菌的药敏实验平板为血MH平板 放CO2环境 1ug苯唑西林纸片可用来筛选P耐药 但须认识到 当OX 20mm时表明肺炎链球菌对P敏感 此菌往往也对其他B 内酰胺 包括阿莫西林和多数头孢素 抗生素敏感 如果OX 19 则需要重新检测青霉素 头孢霉素MIC 以确认该菌株是否是耐药 许多药物还没有药敏试验的解释标准 不能够提供准确的 令人满意的一些重要抗生素 如超广谱头孢 碳青霉烯 的药敏试验结果 3 致病性 在化脓性球菌中 肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌 不同的是 到目前为止 肺炎链球菌极少对青霉素类抗生素产生耐药性 肺炎链球菌主要的致病物质是肺炎链球菌溶血素及荚膜 荚膜具有抗原性 是肺炎链球菌分型的依据 此菌可引起大叶性肺炎 脑膜炎 支气管炎等疾病 C链球菌 1 形态与染色链球菌为革兰染色阳性细菌 菌体球或卵圆形 直径不超过2um 呈链状排列 致病性链球菌链较长 无芽孢 大多数无鞭毛 幼龄菌常有荚膜 多数兼性厌氧 少数厌氧 过氧化氢酶阴性 适温37度 营养要求较高 培养基中需加入血清 血液或腹水 在液体培养基中呈沉淀生长 但也有呈均匀浑浊生长 肺链 在固体培养基上形成细小 表面光滑 圆形 灰白色 半透明或不同的菌落 2 链球菌的生化反应链球菌在普通培养基上生长不良a 杆菌肽敏感试验 A群溶血性链球菌对杆菌肽非常敏感 而其他群链球菌通常耐受 故此试验可对链球菌进行鉴别 b CAMP试验 下血平板上B群溶血性链球菌能产生CAMP因子 可促进金黄色葡萄球b溶血素活性 3 致病性链球菌广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部 可引起人类多种疾患 A族占90 以上 猩红热 丹毒 新生儿败血症 脑膜炎 产引起各种化脓性炎症 褥热以及链球菌变态反应性疾病等 D奈瑟氏菌 寄生的脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌是重要的致病菌 脑膜炎奈瑟氏菌是人类流行性脑脊髓膜炎的病原菌 多数菌株在初分离时有荚膜 一般通过呼吸道传播所引起 常在冬末春初季节发病最为流行 淋病奈瑟氏菌可引起急或慢性淋菌性尿道炎 阴道炎 主要通过性接触传播 1 形态与染色本属细菌为革兰染色阴性 球形或球杆形 球菌多呈双球菌状排列 相邻一侧扁平或略凹呈肾状 杆菌则较短粗 长宽相比为2 1 无鞭毛 脑膜炎奈瑟氏菌在患者脑脊液中 多位于中性粒细胞内 形态典型 在孵育24h后的培养物中 常呈现衰退形态 菌体大小较不一致 着色亦深浅不匀 新分离菌株大多有荚膜和菌毛 2培养特性营养要求较高 需在含有血清 血液等培养基中方能生长 最常用的是巧克力培养基 专性需氧 5 CO2条件下生长更佳 最适生长温度为37度 低于30度不生长 孵育24小时后 形成直径1 0 1 5mm的无色 圆形 光滑 透明 似露滴状的菌落 在血平板上不溶血 产生自溶酶 人工培养如不及时转种 超过48h常死亡 3 检验方法鉴定直接涂片检查a 淤血斑 刺破淤血斑做血膜片 干燥固定后革兰染色阴性双球菌呈对排列 可初诊 b 脑脊液 取脑脊液离心后沉淀物涂片同上分离培养将标本直接接种于血琼脂平板 巧克力平板 置于5 10 co2 35度培养24小时后可见圆形 湿润小菌落 经涂片证实G 双球菌 该菌鉴定主要通过氧化酶 糖类发酵和血清学试验以及培养生长特点进行a 细菌染色形态b 氧化酶试验阳性C 触酶试验阳性d 分解葡萄糖 麦芽糖产酸不产气e 荚膜多糖抗原直接凝集试验 注意 该菌能产生自溶酶 易自溶 故采集时标本不易放冰箱 应保温立即送检 必要时可作双份血清测定抗体效价的变化 淋球菌 1879年 奈瑟从35例急性尿道炎 阴道炎及新生儿急性结膜炎病人的分泌物中 分离出淋病双球菌 1885年 Bumm在人 牛或羊的凝固血清培养基上培养淋球菌获得成功 保温保湿及时送检 及时接种 30min内 培养基应孵热后再接种 标本取后应立即接种于培养基中 国外常用的培养基有Thayer Martin培养基及改良的Stuart运送培养基 国内也已研制成国产培养基 如加多粘菌素E 25 g mL 的血液琼脂或巧克力琼脂 初代分离时应用5 二氧化碳环境 烛缸 培养温度36 为宜 相对湿度80 以上 培养24 48h观看结果 淋球菌在多粘菌素B血液琼脂 一种常用的培养基 上经24 48小时培养之后 可形成圆形 凸起 湿润 光滑 半透明或灰白色的菌落 如继续培养 菌落体积增大 表面粗糙 边缘皱缩 如表现为以上情况 初步判定为淋球菌阳性 形态与染色淋球菌呈卵圆形或豆形 菌体长0 6 0 88um 宽约0 58um 常成对排列 邻近面扁平或稍凹陷 像两粒豆子对在一起 无鞭毛 不形成芽孢 在急性感染的机体内 其形态较典型 多位于细胞浆内 慢性期则在细胞外 淋球菌革兰染色阴性 首先该菌生长较慢 营养要求高 需要在5 CO2环境下才能生长良好 这是区别于其他奈瑟菌的前提 接下来是作氧化酶 触酶 其他生化反应采用酶法进行 可用非发酵菌用的糖类生化管 葡萄糖 麦芽糖 乳糖 蔗糖 果糖 其他须作硝还 DNA试验均阴性 涂片时不要用力涂擦 以防止细胞破裂和变形 涂片厚薄要合适 涂片过薄 涂片中几乎没有细胞 会造成假阴性 涂片过厚 脱色不易干净 会使各种成分难以分辨 女性生殖道中有些菌如不动杆菌等很象淋球菌 常可造成涂片的假阳性结果 咽和直肠标本的直接涂片结果也常由于正常菌丛或各种杂菌的掩盖而不可靠 只有培养法才是金标准方法 也只有培养法才能获得药敏结果 尤其对PPNG这样多重耐药的淋球菌意义更大 在糖类生化管表面加液体石蜡的目的是因为淋病奈瑟菌是以发酵形式利用糖类 而在氧气存在时发酵代谢受到抑制 加入石蜡则可隔离氧气 使得细菌的发酵产酸现象更为明显 便于观察 再则 之所以要用非发酵菌的生化管 是因为其配方中糖类与蛋白胨的比例为1 0 2 细菌分解蛋白胨产碱较少 不足以影响代谢糖类时的产酸 还因为培养基中加入了少量琼脂可使代谢时所产生的酸性物质能在局部聚积 使得颜色变化现象更为明显 如此便提高生化管的灵敏度 F卡他莫拉菌 革兰氏染色显示为阴性 故为革兰氏阴性非发酵菌 过去一直认为卡他莫拉菌是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌 但是 近20多年的研究发现 该菌不仅可以引起儿童和老年人的上呼吸道感染 而且还是引起成人下呼吸道感染的主要病原菌 是儿童中耳炎 肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常见致病菌 仅次于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌 而且其发病率逐年增加 形态学卡他莫拉菌又称为卡他奈瑟菌和卡他布兰汉菌 卡他莫拉菌在血平板 巧克力平板等各种培养基上生长良好 菌落呈 冰球 状 培养24h后形成灰白色 光滑 直径1 3mm不透明 不溶血的菌落 易从培养上刮下培养48h后 形成表面干燥 不平 边缘不整齐的菌落 如用接种环推移 整个菌落可移动 有特殊手感 卡他莫拉无芽孢 无鞭毛 形态上易于其他奈瑟菌属相混淆 本菌不分解任何糖类 可产生氧化酶 触酶和DNA酶 硝酸盐还原试验阳性 与脑膜炎奈瑟球菌的鉴别卡他莫拉是DNA 硝酸盐还原均为阳性 与莫拉菌属的鉴别卡他为球菌 成双或肾性排列 DNA阳性 而莫拉为球杆菌 DNA为阴性 军团菌 军团菌是隐藏在空调制冷装置中的致病菌 随冷风吹出浮游在空气中 吸入人体后会出现上呼吸道感染及发热的症状 严重者可导致呼吸衰竭和肾衰竭 军团菌最早是由于部队室内密闭作业 导致群体发生上呼吸道感染而得名 军团病是一种非常严重的 有时可以致命的肺炎 军团病是由军团杆菌引起 这种细菌产生在自然环境中 在温水里及潮热的地方蔓延 人工供水系统有时也能为军团杆菌的大量繁殖提供生存环境 这些系统包括淋浴器 矿泉池 喷泉以及空调设备的冷却水塔 人们通常是由于呼吸了被军团杆菌污染的水源散发的水雾而传染上军团病的 鉴定方法细菌培养法军团菌为革兰氏阴性杆菌 专性需氧 胞内寄生菌 军团菌最初是从以军团菌病人肺组织感染的豚鼠中分离出来的 这种方法虽然有较高的可靠性 但非常昂贵 而且费时费力 不久就被平板培养法所取代 目前标准培养基为活性碳酵母浸膏琼脂平板 也称军团菌生长平板 BCYE 接种在BCYE平板上的样品在温度为35 37 C 培养10天 在浓度为2 5 CO2的环境下培养更有利于军团菌的生长 军团菌的菌落通常呈白色 灰色 有荧光 军团菌在BCYE平板上生长而在平板和半光氨酸缺失BCYE Cys平板上不生长 血清学玻片凝集法军团菌感染l周左右可检测出血清中军团菌特异性IgM抗体 2周左右可检测到特异性IgG抗体 现已发现嗜肺军团菌有15个血清型 其中 嗜肺军团菌血清1型 Lp1 与人类疾病关系最密切 其次为血清4型 Lp4 和6型 Lp6 布鲁氏菌 生物学形状 革兰氏阴性短小杆菌 初次分离时多呈球状 球杆状和卵圆形 单个分散存在 少数情况成对或短链状或聚集成小团状排列 无芽孢 无荚膜 无鞭毛 不运动 革兰染色经常着色不佳 吉姆染色呈紫色 本菌专性需氧 初次分离培养时需5 10 CO2 生长缓慢 营养要求高 最适生长温度为35 37度 在血琼脂平板或肝浸液琼脂平板上 37度养48h长出肉眼可见的透明 无色 光滑性小菌落 血琼脂平板上无溶血现象 致病性内毒素是主要的致病物质 荚膜与侵袭酶有利于细菌通过完整皮肤 粘膜进入宿主体内 并在机体脏器内大量繁殖和快速扩散入血 此外 布鲁菌引起的4型超敏反应也能参与致病 布鲁菌是动物源性疾病 感染家畜引起流产 畜病还可表现为睾丸 附睾 乳腺 子宫炎等 人感染后 主要表现为发热 发冷 体弱不适 全身痛和多汗 头痛等 还包括肝脏损害 血液系统 骨关节受损 男女泌尿生殖系统病变等 微生物学检查 1 标本直接革兰染色检查布鲁菌的意义不大2 临床上抽取血液和骨髓标本 进行分离培养 另外 病后1周后 可用试管凝集试验测定血清IGM抗体 抗体效价 1 160 320为阳性 对慢性患者可进行补体结合试验测IGG 一般以1 10为阳性诊断标准 可诊断慢性或曾患过布鲁菌病 培养与鉴定在血琼脂平板培养5 7天可形成灰色不溶血菌落 在固体培养基上菌落为无色 半透明 圆形 表面光滑 边缘整齐 中央稍凸起 直径为2 3mm 有时可出现粘液或干燥的硬皮样菌落 液体培养基呈轻度浑浊有沉淀 不形成菌膜 培养 30天才能报告阴性 药物敏感试验临床治疗首选强力霉素 其次复方新诺明 由于病程长 用药时间需4 6周 药敏试验可不作为临床常规 但如需要必须采用稀释法做MIC 内酰胺酶以其主要水解对象可分为青霉素酶 头孢菌素酶 广谱酶 超广谱酶 根据生化特征或氨基酸序列的同源性 第一类为头孢菌素水解酶 Amp C酶 产生菌主要系革兰阴性菌 如假单胞菌 肠杆菌 不动杆菌和克雷伯杆菌等 由染色体介导 第二类为青霉素酶和超广谱酶 包括革兰阳性菌的青霉素酶 质粒介导的TEM和SHV酶及其衍生物组成组成的超广谱 内酰胺酶 ESBLs 羧苄青霉素酶 邻氯青霉素酶 OXA酶 和由沙雷菌属与肠杆菌属产生的非金属碳青霉烯酶 第三类为金属酶 由假单胞菌属 脆弱拟杆菌属 产黄菌属 沙雷菌属及嗜麦芽黄单胞杆菌属产生的可水解碳青霉烯抗生素的金属酶 第四类为其他不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶 酶的特殊性 动力学参数及其基因的核苷酸序列 A活性部位为丝氨酸残基 包括多种质粒编码的青霉素酶 如TEM1 SHV1 ROB1或PC1酶 相对分子质量29000 B为金属酶 metalloenzymes 活性部位为半胱氨酸残基 产金属酶的细菌有嗜麦芽黄杆菌 stenotrophomonasmaltophila 气单胞菌和脆性拟杆菌 该类为碳青霉烯酶 耐药的抗生素包括碳青霉烯 青霉素 第一 二 三代头孢菌素 氨曲南 C活性部位为丝氨酸残基 相对分子质量为39000 它的产生与 酶诱导剂有关 归因于调控基因突变 主要是染色体编码的头孢菌素酶 AmpC酶 是由染色体上一组Amp基因介导的 D为青霉素酶 包括OXA 超广谱 内酰胺酶 ESBLs 1 什么是ESBLs ESBLs是英文Extended Spectyum Lactamase缩写 中文意思是超广谱 内酰胺酶 属质粒介导 它是当前抗生素出现的新的耐药趋势之一 2 产ESBLs菌株的耐药特点 如果临床出现产ESBLs菌株 则对第三代头孢菌素 它们是头孢