骨髓间充质干细胞的转染

第一大肠杆菌感受态的制备转化是将外源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段。受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能容许外源DNA分子进入的感受态细胞。一，实验材料：1， LB液体培养基：称取蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,溶于800ml去离子水中，用NaOH调节PH到7.5，加去离子水定容至1L,高压灭菌20min.2， LB平板培养基：LB液体培养基中按1.5%的浓度加入琼脂，加热溶解，进行高压灭菌。取出后趁热在无菌条件下，倒入无菌的平皿中，每套平皿中加入12-15ml，凝固后倒置，4冰箱保存备用。3， 0.1mol/lCaCL2溶液：称取1.1g 五水CaCL2用双蒸水溶解，定容到100ml.高压灭菌20min.二，实验步骤： 1，从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单个菌落，接种到3-5mlLB液体培养基中，37震荡培养12h左右，直至对数生长期，然后将该菌液以1：100(1：50)接种到100mlLB液体培养基中，37震荡培养2-3h至OD600nm=0.5 2，培养液在冰上冷却10min,转入离心管中，4下，4000r/min离心10min. 3,弃去上清液，用预冷的0.1mol/l CaCL2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min. 4,4下，4000r/min离心10min. 5,弃去上清液，加入300l预冷的0.1mol/l CaCL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即制成感受态细胞悬液。 6，以上制备好的细胞悬液可在冰上放置，24h内用于转化实验，或添加冷冻保护剂（15-20%）后超低温-70冷冻贮存。第二， 将带有目的基因的载体质粒转化到感受态大肠杆菌中。1， 取200l感受态细胞悬液（若是冷冻保存液，冰浴中使其解冻，解冻后立即进行下面操作）加入载体质粒溶液（含量不超过50ng,体积不超过2l）.2， 将含有混合液的离心管轻轻摇匀，冰上放置30min后，42水浴中热冲击2min,然后迅速置于冰上冷却3-5min.3， 向各管中加入100l LB液体培养基，使总体积约为0.2ml,即制备成转化反应原液，混匀后37温浴15min以上，震荡培养。此时细菌回复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。第三， 质粒菌落的准备1， LB培养基的配制：称取胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g.加入适量去离子水摇动容器至容器溶解，然后用5M(mol/l)氢氧化钠调节ph到7.0，然后用去离子水定容到1L,待上述溶液完全溶解后，向另一广口瓶中加入琼脂粉，每100ml LB培养基加入1.5g琼脂粉。进行高压灭菌后，将融化的LB固体培养基在55水浴中，待培养基温度将至55即授课触摸，加入抗生素，每100ml LB培养基中加入1ml 100mg/ml的卡那霉素（1g/1000ml），充分摇匀。2， LB培养板制作：将加入抗生素的LB培养基充分摇匀后倒入90x25mm2皿中10-20ml LB,倒板后打开盖子半盖状态，在紫外灯下10-15min.最后封口，4保存。3， 划板接种菌：用接种环取新鲜培养的菌落或甘油菌液，划板接种到卡那霉素（千分之一）的LB平板上，37温箱孵育16-18h(一般12h开始生长菌落，时间以菌落生长状态判断。)，将平板应该反放，注意不可让菌落长太大。4， 摇菌：（1） 首先将卡那霉素2ml,解冻，然后加于200ml高压灭菌后的LB液体培养基中，摇匀，然后用5ml移液枪分装两个10ml离心管，每管5ml含卡那霉素的LB培养基。然后立即对LB液体培养基的容量瓶封口，并酒精擦拭火焰消毒。在使用5ml移液器过程中，枪头不可碰到容量瓶或离心管壁。（2） 其次，用10微升或0.5-1微升的抢吸取培养板上的单个菌落，然后将枪头在10ml离心管中晃动数次，将枪头打入10ml离心管中。（3） 最后，对10ml离心管封口，用记号笔记下操作时间，操作质粒菌的名称，顺序。（如：2011，8，17 a/b s3）（4） 将接种取完的菌板封闭放于4，将含有卡那霉素的LB培养基放于4，将10ml离心管管口封闭好，用报纸包扎放于塑料泡沫中，放入摇床，37摄氏度，200r,摇16-18h(目的是使细菌快速生长，并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。)5， 储备甘油菌： 制备10-15%甘油菌液，将高压灭菌好的甘油放于4保存，然后将摇过的菌取出，将甘油与菌液一同放入无菌操作台中，在灭菌条件下，用剪刀剪1ml枪头一个小斜口，然后吸取400微升甘油放于3ml菌液中，然后进行涡旋震荡，待甘油菌液混匀后，将甘油菌液封口，记下标记放于-20保存。注意事项：1，卡那霉素使用时，首先应分装到ep管中以100mg/ml,每管3ml浓度放入5ml管中，-20保存。第四， 质粒DNA分子的大量提取1， 准备材料： 已经制备好的600ml菌液，TIANGEN（endofree plasmid kit,K9428无内毒素质粒大提取试剂盒），20个50ml离心管， 5ml枪头，200微升枪，枪头（用于吸取RnaseRNA）,计时器，吸水纸，五水酒精，异丙醇，废液钢。2， 操作步骤：（1） 取过夜培养的菌液加入50ml离心管中，配平（tem；21，prog:0, speed:8000rpm）,time:3min。收集菌液尽量吸除上清，由于菌液较多可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。（2） 尽量吸除上清，为了确保上清液全部吸除，可以用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。（3） 向溶液P1中，用200微升的枪吸取RnaseA加入其中，放置到圆周振荡器或移液枪吹打，混匀。（4） 向留有菌体沉淀的离心管中加入7ml溶液P1（已经加入RnaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀（使用5ml枪时，可以调3.5ml，即加两次即可，以节约中间调枪时间），一定要彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解效果，从而引起提取量和纯度低。（5） 向离心管中加入7ml溶液P2，立即温和的上下翻转6-8次，轻轻混匀，室温放置5min,不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA，此时菌液变的清亮粘稠，若未变清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，以后应减少菌液量。（6） 向离心管中加入7ml溶液P4，立即温和上下翻转6-8次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min左右，800rpm,离心5-10min,然后将溶液倒入过滤器CS中，在倒入过程中过滤口下面应放置50ml离心管，慢慢推动推柄过滤，然后将滤液收集到自带的干净50ml离心管中，如果菌体过多（多于100ml）,建议延长离心时间20-30min.（7） 柱平衡处理，在（6）离心过程中，向吸附柱CP5中（吸附柱放入50ml离心管中）加入25ml的平衡液BL，8000rpm,（8228g）离心2min，倒掉离心管中废液，将吸附柱重新放回收集管中（对于平衡处理过的柱子最好立即使用）（8） 在(6)的滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多易引起RNA污染），上下颠倒混匀后转移到平衡后的含有50ml收集管的吸附柱CP5中。（吸附柱CP5的最大容积是15ml,可以分2次过柱，称量调平，室温8000rpm,8228g）,离心2Min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。注意：在进行分2次过柱，每次均按以上条件进行。（9） 向吸附柱中加入10ml漂洗液PW（使用前按照说明加入五水乙醇）8000rpm（8228g）离心2min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（10） 重复步骤（9）（11） 向吸附柱中加入3ml五水乙醇，目的除去杂质，室温8000rpm(8228g)离心2min,倒掉废液。（12） 将吸附柱CP5重新放回收集管中8000rpm(8228g)离心5min,目的是将吸附柱中残余漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切，PCR等)，为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP5开盖，置于室温放置数分钟，从而彻底晾干吸附柱材料中残留的漂洗液。(13) 将吸附柱CP5置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min,然后室温8000rpm（8228g）离心2分钟，将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管中，-20摄氏度保存。注意：洗脱液用量大多少主要依据拷贝数以实验所需要的浓度来确定，洗脱缓冲液体积不少于1ml,体积过小会影响回收效率。第五， 大量质粒DNA的产物纯化实验材料：（1） TIANGEN大量DNA产物纯化试剂盒（规格50次）（2） 酶切反应体系：灭菌蒸馏水55l； x 20管 即1100lbuffer(10x)10l; x20管 即 200l质粒30l, x 20管 即 600l酶（15l/管）3-5l，x20管 即100l总体积 2000l 1g质粒需要至少5IU酶进行消化（1gDNA=5iu酶），质粒浓度0.3g/l(30l即9g),30l质粒即需要至少5IU酶，TAKARA的酶是1l=10iu（150iu/瓶），酶切时酶的量为十倍量使用。但是酶的用量不应大于反应体系的十分之一。（3） 冰浴盒，1ml枪头（枪），200l枪(枪头)，5ml离心管，1.5ml离心管（20个），0.5ml离心管20个，20l枪（枪头），废液钢（4） DNA线性化回收体系： 漂洗液PW（操作前先往15mlPW中加入60ml无水乙醇） 平衡液BL 结合液BL 洗脱缓冲液EB 吸附柱CB3 收集管（2ml） 调节水浴锅为37。实验步骤：1， 酶切体系的配制: 将20管的酶切体系放于5ml离心管中，在冰浴上进行操作，吹打混匀，分装到20个管（100l/管），短暂离心2-3s,取出置入到37水浴中，放置2h.2， 酶切DNA线性化处理（1） 柱的平衡：向吸附柱CB3中加入500l平衡液BL，12000rpm(13400g),1min,倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中（当天使用）（2） 向每管酶切反应体液（100l）中，加入5倍体积（500l）的结合液PB,充分混匀。（3） 将（2）中混匀溶液加入吸附柱中（20个），（吸附柱CB3的容积为800l）,室温放置2min,12000rpm离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（4） 向吸附柱CB3中加入600l已事先加有五水乙醇的漂洗液PW，然后室温静置2min,12000rpm30-60s,倒掉收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（5） 向吸附柱CB3中加入600l漂洗液PW,12000rpm,离心30-60s,倒掉收集管中的废液。（6） 将离心吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(1340g)离心2min,尽量去除漂洗液，将吸附柱放入室温晾干。（7） 取出吸附柱CB3放入一个干净的离心管1.5ml中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min,1200rpm,收集DNA液（加入洗脱液不少于50l）.（8） 为了提高DNA回收量，可将离心得到的溶液重新加到离心吸附柱中，重复步骤。3， DNA浓度及纯度检测： OD260值为1相当于大约50g/ml双链DNA或40g/ml单链DNA. 回收5-6l放入ep管中，用于检测浓度防止反复冻融。 （1）首先用超纯水冲洗比色皿，然后用五水乙醇冲洗，干燥后，用灭菌水调零。比色皿最大容量300l. （2）根据需要以适当比例加样。如取6l线性化处理的DNA进行检测,以1：50比例进行(2l质粒+98ml高压灭菌的双蒸水)。读数时先调零，用50l灭菌水。稀释质粒先加水98l，再加2l质粒DNA(质粒浓度的计算公式x ng/l=OD260x5000. （3）读数，首先“bank”调零，然后读数记录3次。如下： OD260 , OD280 , OD260/OD280. 此比值在1.7-1.9为正常范围。注意事项：（1） Buffer,酶在使用前必须要进行短暂离心，因为Buffer(500l/管)，酶（15l/管）会沾到瓶壁上引起浪费。（2） 酶只有在最后开始的加的时候才从-20冰箱中取出，因为酶中含有50%甘油防冻液，因此从-20拿出不结冰。（3） 在短暂离心时间调至short,然后按青绿色按钮离心力为2000rpm松手。（4） 将分装后的20管酶切反应体系放于到水浴锅总，不可让水浸没离心管。（5） 质粒不能反复冻融，使用前要进行混匀，提取后分装-20保存。 第六， 细胞转染常规瞬时转染(以24孔板为例)方法一：1， 细胞准备：在转染前24h,在24孔板中，每孔接种500l 2x105个/ml细胞。转染时细胞融合度为80-90%，要求铺板时细胞要消化完全混匀，避免重叠生长。2， 转染样品的准备： (1) 转染前4h更换新的完全培养基10%FBS+L-DMEM.（1） 用50l无血清L-DMEM稀释0.8g质粒DNA(质粒DNA初始浓度0.3g/l),轻轻吹吸3-5次混匀。（2） 轻轻颠倒混匀转染试剂lipofectamineTM2000,用50l 无血清L-DMEM稀释2.0l转染试剂lipofectamineTM2000,轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min.（3） 混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min.（4） 转染复合物加入到24孔板细胞板中，100l/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。（5） 将细胞板置于37，5%CO2培养箱中培养18-48h,转染4-6h后可换新鲜培养基。方法二：（方法二效果不是很好）(1)待细胞80-90%融合时，在转染前4h更换新的完全培养基10%FBS+L-DMEM,制备DNA-lipofectamine2000复合物（1：2.5），每孔含有0.8g质粒+2l lipofectamine2000，室温放置30min. (2) 吸去培养孔中原培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入无血清的L-DMEM 100l/孔，每孔缓慢加入上述复合物（每孔含有0.8g质粒+2l lipofectamine2000）。设立对照孔加入无血清的L-DMEM100l, 4h后，小心吸去培养孔中培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入完全培养基0.5ml,转染24h后，倒置荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白表达。3， 注意事项：（1） 凡是进行转染过程中不同细胞转染量要自己摸索。（2） 抗生素一般对于真核细胞无毒，但因为阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞，从而降低了细胞的活性，导致转染效率降低，因此，在转染培养基中，在准备转染前进行细