液相色谱定量方法指导原则

液相色谱定性定量方法 1有关色谱峰的基本概念 一 峰底 CD 峰的起点与终点之间连接的直线峰高 h 峰最大值到峰底的距离峰宽 KL 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半高峰宽 W1 2 通过峰高的中点作平行于峰底的直线 其与峰两侧相交两点之间的距离峰面积 A 峰与峰底之间的面积 又称响应值拖尾峰 Tailingpeak 后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰 Leadingpeak 前沿较后沿平缓的不对称峰基线 Baseline 在正常操作条件下 仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线噪声 N 由各种因素所引起的基线波动基线漂移 Baselinedrift 基线随时间定向的缓慢变化 1有关色谱峰的基本概念 二 2通过测量和计算得到的色谱参数 一 死时间 deadtime t0 不保留组分的保留时间 即流动相 溶剂 通过色谱柱的时间 死体积 deadvolume V0 由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间 V0 F t0 F为流速 保留时间 retentiontime tR 从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间 保留体积 retentionvolume VR 从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积 又称洗脱体积 VR F tR 调整保留时间 adjustedretentiontime t R 扣除死时间后的保留时间 在实验条件 温度 固定相等 一定时 t R只决定于组分的性质 因此t R 或tR 可用于定性 t R tR t0 调整保留体积 adjustedretentionvolume V R 扣除死体积后的保留体积V R VR V0或V R F t R 2通过测量和计算得到的色谱参数 二 柱效能 色谱柱在分离过程中主要有动力学参数决定的分离效能 通常用理论板数或有效板数表示 理论板数 若应用调整保留时间tR 计算理论塔板数 所得值称为有效理论塔板数 n有效或neff 有效板数 2通过测量和计算得到的色谱参数 三 分离度 两个相邻色谱峰的分离程度 以两个组分保留值之差与其平均峰宽之比表示 分离度图示 响应值 组分通过检测器系统产生的信号值 相对响应值 单位量物质与单位量参比物质的响应值之比 2通过测量和计算得到的色谱参数 四 校正因子 f 相对响应值的倒数 它与峰面积的乘积正比于物质的量 定量限 LOQ 是指样品中被测物能被定量测定的最低量 其测定结果应具有一定的准确度和精密度 定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力 2通过测量和计算得到的色谱参数 五 检测限 LOD 系指试样中的被测物能被检查的最低量 是鉴别试验的灵敏度指标 其越低 反应的灵敏度越高 3液相色谱的定性分析 1 与已知物直接对照2 已知物峰高增加法3 二极管阵列检测器的三维图谱定性4 与其他仪器联用定性 4色谱法定量的依据 在一定的操作条件下 检测器的响应信号 色谱峰的峰面积或峰高 与进入检测器组分的量成正比 即 mi fiAi或mi fihi 式中 mi 组分的量fi 比例常数这就是色谱法定量的依据 5峰面积A的测量方法 一 1 峰高h乘半峰宽w1 2法将色谱峰视为等腰三角形 得到的面积为实际面积的0 94倍 故实际面积应为 适合于对称峰 A 1 065h w1 2 相对计算可略去前面系数 2 峰高乘平均峰宽法不对称峰不能作前述近似 可于峰高0 15及0 85处测得峰宽 取其平均值进行计算 A h w0 15 w0 85 2 5峰面积A的测量方法 二 3 峰高乘保留时间法难以量度半峰宽的狭窄峰或半峰宽以上重叠的峰可用下式计算 A 1 065h b tR 相对计算可略去1 065和常数b 4 剪纸称重法对于不对称或分离不完全的峰 可将峰剪下 以质量代其面积 使用较少 5 自动积分法将记录仪与自动积分仪连接 可直接准确 快速地测出峰的面积 6 以峰高代替峰面积定量法当各种实验条件严格保持不变时 一定进样范围内色谱峰的半峰宽不变 即可用峰高代替峰面积定量 特别对于狭窄的峰 较面积定量法更为准确 5峰面积A的测量方法 三 6定量校正因子 一 检测器对不同物质的响应值不同 故相同质量的不同物质通过检测器时 产生的峰面积不等 因而不能直接应用峰面积计算组分含量 为此引入 定量校正因子 以校正峰面积 使之能更真实地反映组分含量 前面已知 mi fiAi即 fi mi Ai 6定量校正因子 二 fi称绝对校正因子 定量分析中常用的是相对校正因子f i 定义为组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比 mi ms用质量单位时 f w称相对质量校正因子mi ms用摩尔为单位时 f M称相对摩尔校正因子注意 应用中一般地略去 相对 两字 6质量校正因子的测定方法 三 准确称取一定量待测组分的纯物质和标准物质的纯物质混和后 取一定量 在检测器的线性范围内 在实验条件下注入色谱仪 出峰后分别测出两者峰面积 由前式可求得校正因子 7常用的几种定量测定方法 一 1 归一法当试样中的全部组分都出峰 即都反映在色谱图上 时 可以从校正后每峰峰面积占全部色谱峰总面积的分数 求得该组分的质量分数 7常用的几种定量测定方法 二 归一法的特殊情况若试样中各组分的相对校正因子很接近 如同系物中沸点接近的组分 上式则可简化为 xi 100 当测量参数为峰高时 也可以用峰高归一法计算组分含量 用峰高校正因子 以峰高代峰面积代入前页算式即可 归一法具有简便 准确的特点不足之处在于仅可使用于所有组分都出峰的情况 7常用的几种定量测定方法 三 2 内标法使用条件 试样中各组分不能全部出峰 各组分含量悬殊 仅需测定其中部分组分 操作步骤 准确称取一定量的试样 加入一定量的选定标准物 内标物 混匀后进样 进行色谱分析 根据内标物和试样质量以及色谱图上相应的峰面积 计算待测组分的量 7常用的几种定量测定方法 四 内标法待测组分含量计算式如下 由前可推得 各符号意义同上 内标法中常以内标物为基准 即 f s 1 也可用峰高代替峰面积 做法同上 内标法注意事项 内标物应是试样中不存在的纯物质 加入的内标物量与试样中待测组分量相近 内标物的色谱峰应位于待测组分色谱峰附近或几个待测组分色谱峰之间 7常用的几种定量测定方法 五 内标法优缺点 优点 定量准确 对试样含有不出峰的组分情况下 也不影响测定 缺点 每次测定都必须准确称取样品和内标物质量 不适于快速分析 7常用的几种定量测定方法 六 内标曲线法 若以Ci 对Ai As作图 则可得一条通过原点的直线 内标标准曲线 为一常数 上式则可化为 xi 用内标法待测组分含量计算式 若固定试样称取量 加入内标物也恒定 则有 7常用的几种定量测定方法 七 内标标准曲线的绘制 将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液 系列 b 取固定量的标准溶液和内标物 混合后进样分析 测出Ai和As c 用Ai As对标准溶液浓度作图 可得一组通过原点的直线 内标标准曲线 7常用的几种定量测定方法 八 样品测定与组分定量 称取与绘制标准曲线相同量的试样和内标物 测出其峰面积比 由标准曲线即可查出待测组分的含量 内标标准曲线法应用在生产过程控制分析上 不须计算校正因子 对液体样品也可量取体积 具有简便快速的特点 7常用的几种定量测定方法 九 3 外标标准曲线法 a 取被测组分的纯物质 配制成一系列不同浓度的标准溶液 b 分别取一定体积上述溶液注入色谱柱 c 得到色谱图后测出峰面积或峰高 d 绘出峰面积 或峰高 对浓度的关系曲线 标准曲线 标准曲线的绘制 7常用的几种定量测定方法 十 外标法样品测定 一 在同样操作条件下注入同样量 一般为体积 的待测试样 从色谱柱上测得峰面积或峰高 在标准曲线上即可查出待测组分的浓度 外标法也用于生产过程的控制分析 操作简便 计算简单 但分析结果准确性取决于操作条件的稳定性和进样的重现性 7常用的几种定量测定方法 十一 外标法样品测定 二 当试样中待测组分浓度变化不大时 可不必作标准曲线 而用单点校正法 即配制一个与被测组分含量接近的标准样 分别取相同量体积进样 测定标准样和待测样的峰面积 按下式计算组分含量 Ci Ai As Cs 7常用的几种定量测定方法 十二 4 标准加入法 一 标准加入法实质上是一种特殊的内标法 以欲测组分的纯物质加入到待测样品中 分别测定加入前后的峰面积 从而计算欲测组分在样品中的含量 a 可以单点加入 色谱条件完全相同的情况下 按以下公式计算 7常用的几种定量测定方法 十三 标准加入法 二 b 可以加入一系列浓度 按标准曲线外推法计算出欲测物在样品中的含量 优点 不需要另外的内标物 不必要进样非常准确 操作简单 若在前处理过程加入 可补偿被测组分在处理过程中的损失 缺点 色谱条件要求完全一致 否则会带来分析误差 7常用的几种定量测定方法 十四 7常用的几种定量测定方法 十五 标准加入法 三 标准加入法标准曲线绘制 将一系列已知量待测物分别加入到几等份的样品中 配制成浓度为 cx 0 cx c1 cx c2 cx c3 和样品有相同基体的标准系列溶液 加标 spiking 通过仪器分别测量以上系列溶液的响应值S0 S1 S2 S3 S4 以响应信号S对浓度c作图 再将直线外推与浓度轴相交于一点 下图 求得样品中待测物浓度cx 优点 基体 matrix 相近 或者说基体干扰相同 缺点 麻烦 适于小数量的样品分析 8影响定量准确度的因素 1 样品制备 衍生化成可气化的或有紫外吸收或带荧光的 转化率