基因重组与转座.ppt

基因重组 宋成义博士 副教授 2020 4 18 2 主要内容 基因重组同源重组位点特异性重组转座重组拷贝选择 2020 4 18 3 第一节基因重组概述第二节同源重组第三节位点特异性重组第四节转座重组 2020 4 18 4 一 定义 二 意义 第一节基因重组概述 是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换 插入等的重新组合 形成新的DNA分子的过程 重组是遗传学的灵魂 没有重组就没有生物的进化 没有重组也就没有现代的分子克隆技术 基因变化 物种演变 进化的基础 2020 4 18 5 三 遗传重组的类型 2020 4 18 6 同源重组 Homologousrecombination 涉及两条携带同样遗传位点的染色体间的DNA序列交换 位点特异性重组 Site specificrecombination 发生在两个特异序列之间 转座重组 Transposition 指的是转座子移到基因组的新位点 拷贝选择 Copychoice 是一种RNA病毒使用的重组 2020 4 18 7 第二节同源重组 定义特性真核生物的同源重组原核生物的同源重组 2020 4 18 8 1 同源重组定义 同源重组 HomologusRecombination 是指发生在姐妹染色单体 sisterchromatin 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 2020 4 18 9 2 同源重组特性 同源性 无特异性的要求 重组就可以在此序列中的任何一点发生 同源区越长越有利 同源区太短 越难发生重组 只要同源序列足够长 那么即使相差仅1bp的不同的遗传标记 仍然可能发生重组 2020 4 18 10 大肠杆菌重组 至少要求有20 40bp是相同的大肠杆菌基因组与 噬菌体或质粒重组 大于13bp枯草杆菌基因组与质粒重组 大于70bp哺乳动物重组 150bp以上 2020 4 18 11 同源重组需要一系列的蛋白质催化 如原核生物细胞内的RecA RecBCD RecF RecO RecR等 真核生物细胞内的Rad51 Mre11 Rad50等等 同源重组可以双向交换DNA分子 也可以单向转移DNA分子 后者又被称为基因转换 GeneConversion 2020 4 18 12 原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中 而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后 重组热点 一些序列发生重组的频率高于其他序列真核生物的染色质状态影响重组 如异染色质及其附近区域很少发生重组 在真核生物中 双链DNA分子间基因重组是完成减数分裂所必需的 2020 4 18 13 3 真核生物的同源重组模型 Hollidaymodel 相互侵入 交换 模型RobinHolliday于1964年提出了重组的杂和DNA模型 又称Holliday模型 解释了交互重组现象 对称的杂合双链Meselson Raddingmodel 单链侵入模型 Holliday模型中为对称的杂合双链 而实际情况有不均等分离现象 1975年Meselson Radding提出模型解释这种不对称重组现象 交互重组和基因转换Double strandbreaksinitiaterecombination 双链断裂重组模型 2020 4 18 14 Hollidaymodel 2020 4 18 15 2020 4 18 16 Meselson Radding 单链侵入模型 Holliday模型中为对称的杂合双链 而实际情况有不均等分离现象 1975年Meselson Radding提出模型解释这种不对称重组现象 2020 4 18 17 1 在两个DNA分子中的一个单链发生断裂2 游离出一个单链末端侵人到另一个DNA分子中 2 被切割的DNA留下的缺口由DNA聚合酶进行修复 3 在另一个DNA分子中被替代的链降解 而两个末端被连接 4 开始 一个异源双链将只在两个DNA分子中的一个形成 支链迁移将在另一个DNA分子上产生另一个异源双链 像在Holliday模型一样 异构化使两侧的DNA分子重组 通过这个模型 异源双链首先只在两个DNA分子中的一个形成 然后一旦Holliday连接体形成 支链迁移能在另一个DNA分子上产生异源双链 单链侵入模型 2020 4 18 18 Double strandbreaksinitiaterecombination 双链断裂重组模型 虽然Holliday模型以及随后的Meselson和Radding所作的修改可以解释生物中发生的大多数同源重组事件 但仍有一些例外的重组现象 最典型的例子为基因转换 geneconversion 基因转换首先在酵母及真菌中被发现 现已证实在许多生物中存在 一种等位基因形式转变为另一种等位基因形式 只发生在减数分裂时期 2020 4 18 19 异常分离与基因转变 在一个杂合体中 如果一染色体把基因A交给它的同源染色体 则它的同源染色体必定把基因a交回给它 所以在真菌中 一个座位上的两等位基因分离时 应该呈现2 2或1 1 1 1或1 2 1的分离 表8 1 这就说明重组通常总是交互的 可是Lindegren在面包酵母 Saccharomycescerevisiae 中发现 有的子囊含有 3A 1a 或 1A 3a 的子囊孢子 以后在脉孢霉 酿酒酵母 子囊菌Ascobolusimmersus及果蝇中也发现这种现象 2020 4 18 20 2020 4 18 21 同源重组机制的应用 基因敲除小鼠 2020 4 18 22 4 原核生物的同源重组 细菌同源重组的特点细菌的接合 转化以及转导重组都是同源重组 而且这种重组是发生在一个完整的环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间的 且重组需要3种基因所编码的RecA和RecBCD蛋白质 2020 4 18 23 A 转化 transformation 概念 受体菌直接摄取供体菌裂解后游离的DNA片段而获得新性状 转化因子 在转化过程中转化的DNA片段 分子量 1 107 10 20个基因 2020 4 18 24 机制 感受态受体菌摄取同源DNA后发生重组 2020 4 18 25 B 接合 conjugation 概念 通过性菌毛连接沟通 将遗传物质 质粒或染色体DNA 从供体菌转移给受体菌的过程 接合性质粒 F质粒 R质粒 Col质粒 Vi质粒非接合性质粒 不要求 机制 2020 4 18 26 电镜下的接合 2020 4 18 27 F质粒的接合 性菌毛末端 受体接合桥形成 F质粒形成切口 一条DNA链进入受体菌内 F质粒留在供体细胞的一条链进行复制并形成互补链 2020 4 18 28 F质粒的接合 2020 4 18 29 C 转导 Transduction 2020 4 18 30 普遍性转导 generalizedtransduction 噬菌体转导供体菌染色体上全部DNA片段 发生于裂解期 完全转导 供体菌DNA片段与受体菌染色体整合并随之传代 流产转导 供体菌DNA片段不与受体菌染色体整合也不可自我复制 大多为此 2020 4 18 31 细菌裂解期 细菌DNA 将供菌任意DNA装配 噬菌体DNA 普遍性转导模式图 整合 未整合 完全转导 流产转导 细菌被普遍性转导噬菌体感染 2020 4 18 32 局限性转导 restrictedtransduction 32 前噬菌体从宿主菌染色体上脱离时发生偏差 将前噬菌体两侧的宿主染色体基因转移到受体菌 使受体菌的遗传性状发生改变的过程噬菌体转导供体菌染色体上特定部位的DNA片段 发生于溶原期噬菌体将自身一段DNA留在供菌染色体上 却将相邻供菌的部分DNA带给受菌并整合至受体菌染色体上 2020 4 18 33 33 局限性转导模式图 正常脱离 断裂和再接 断裂和再接 偏差脱离 gal gal gal gal bio bio bio bio 2020 4 18 34 RecA和RecBCD系统重组机制 RecBCD蛋白在chi位点3 侧的一条链上产生切口 RecBCD蛋白同时具有解螺旋酶的活性 使chi位点附件切口的DNA解链单链区被RecA蛋白和SSB蛋白覆盖RecA蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分D loop区域的DNA产生切口 新切口的3 端 thetailofnewlynickedDNA 与另一条DNA的单链区互补配对DNA连接酶封闭切口 形成HollidayjunctionRuvA和RuvB发动迁移反应RuvC拆分重组中间体 2020 4 18 35 第三节位点特异性重组 定义 发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组 如噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组 2020 4 18 36 特性这类重组依赖于小范围同源序列的联会 重组事件只涉及特定位置的短同源区或是特定的碱基序列之间 重组的蛋白不是rec系统而是int等 如噬菌体l的定点插入 重组时发生精确的切割 连接反应 DNA不失去 不合成 两个DNA分子并不进行对等的交换 有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子上 因此将这种形式的重组又称为插入重组 2020 4 18 37 例 噬菌体的对E coli的整合 POP BOB BOP POB 需要整合酶 Int 拓扑异构酶活性 和整合宿主因子 IHF 参与 非可逆反应 2020 4 18 38 通过attP和attB间的相互重组 环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体 原噬菌体通过attL和attR间的相互重组而切除 具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合 Int的拓扑异构酶活性 使两条双链各自断开一条单链 瞬间旋转然后交换连接 形成Holliday中间提 在另两条单链之间发生同样的断裂重接 从而完成双链间的重组 2020 4 18 39 2020 4 18 40 三类位点特异性重组系统的重组酶Cre FLP和R均属于 整合酶家族 Cre loxP系统FLP FRT系统R RS系统 Sce 系统等 位点特异性重组系统 2020 4 18 41 GATEWAYCloning 2020 4 18 42 2020 4 18 43 2020 4 18 44 CreandloxPmousestrains Creexpressingstrains containatransgenethatexpressescreunderthecontrolofawidespread general ortissue specific conditional promoter Theyareusedtoproducegeneralorconditionalknockoutsrespectively InducibleCrestrains containatransgenethatexpressesamodifiedformofCrerecombinasethatisnon functionaluntilaninducingagent suchasdoxycycline tetracycline RU486 ortamoxifen isadministeredatadesiredtimepointinembryonicdevelopmentoradultlifeLoxP flanked floxed strains containloxPsitesflanking oneachsideof acriticalportionofatargetgeneorgenomicregionofinterestCrerepoterstrains containloxPsitesincombinationwithvisible fluorescentorlacZ markerproteinsusedtotraceCrerecombinationsucessand oralterationsingeneexpression 2020 4 18 45 第四节转座重组 定义 转座子 元 或转座元件 transposon transposableelement 即能够反复插入到基因中许多位点的特殊DNA片段 它们可从一个位点转移到另一个位点 从一个复制子到另一个复制子 在转移时原来位置上的这些结构依然存在或不存在 2020 4 18 46 2 转座重组特点 不必借助同源序列就可移动的DNA片段 即转座作用与供体和受体之间的序列无关 原核生物和真核生物均有转座子 转座序列可沿染色体移动 甚至在不同染色体间跳跃 2020 4 18 47 3 种类与结构特征 1 两种类型 A简单转座子 simpletransposon 或 插入序列insertionsequenceIS B复合转座子 compositetransposon 2 特征 a 两端有20 40bp的反向重复序列 IR b 具有编码转座酶 transposase 的基因c 复合转座子除转座酶基因外还有1 数个基因 d 转座酶催化转座子插入新位点 2020 4 18 48 A插入序列 最简单 是细菌染色体 质粒和某些噬菌体的正常组分 是一个自主的单位 每种IS均编码自身转座所需的蛋白质 特点 1 比较小 0 75 1 5kb 2 只有转座酶基因 3 两端有反向重复序列 命名 IS 编号 鉴定类型 长度700 2000bp IR invertedrepeat IS IR 2020 4 18 49 每种IS元件具有不同序列 但有共同的组织形式 插入序列IS1的结构 2020 4 18 50 2020 4 18 51 2020 4 18 52 B复合转座子 compositetransposons Tn 特点 1 2 25kb 2 两端有两个相同或高度同源IS序列 3 含转座酶基因 抗生素基因等反向重复序列组成转座酶基因特殊基因 如抗性基因 调节基因等表示法 通常以Tn和后面加上数码表示 如Tn903 调节基因 2020 4 18 53 Tn TnAfamily l具有IR 转座酶基因 调节基因 解离酶 抗生素基因 2020 4 18 54 2020 4 18 55 1 转座的模式 4 转座子的转作机制与模式 复制型转座非复制型转座保守型复制 2020 4 18 56 2 复制型转座模式 replicativetransposition 转座子作为可移动的元件被复制 一个拷贝保留在供体原来的部位不变 另一个拷贝则插入到受体的位点上 结果供体和受体都有一个转座子的拷贝 需两种酶 转座酶 transposase 作用于靶位点和原来转座子两端 解离酶 resolvase 作用于复制后的拷贝 2020 4 18 57 2020 4 18 58 过程 a 共合体形成切口 连接 复制 2020 4 18 59 b 拆分 靶位点的DR形成 2020 4 18 60 3 非复制型转座 nonreplicativetransposition 转座子从供体一个位点转移到受体新位点处 供体位点留下缺口 受到损伤 严重时致死 或宿主修复系统识别修复 只需转座酶 2020 4 18 61 4 保守型复制 conservativetranspositionJ 保守转座的转座因子从供体位点上切离 插入到靶位点上 供体位点恢复原状 这种因子的转座酶和 整合酶家族相关 注意 某些转座子只具有一种转座机制 而另一些可能具备两种途经 如IS1和IS903 2020 4 18 62 2020 4 18 63 5 TnA家族转座需要转座酶和解离酶 TnpA介导转座分为两步 分别由tnpA编码的转座酶 tnpR编码的解离酶 resolvase 来完成 转座酶可以结合在末端38bpIR中的25bp的序列上 转座酶识别末端重复序列 并可交错5bp切割靶DNA 使转座子插入 解离位点 res 是内部的特殊位点 只有TnA家族才具有这一位点 Res位点中包含3个tnpR结合序列 I II III 每个序列长30 40bp 三个序列同时和tnpR解离酶结合 使DNA保持一个适当的拓扑结构 2020 4 18 64 a 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性 b 转座不是简单的转移 涉及转座子的复制 Hotspots 热点 Regionalpreference 在3kb区域内的随机插入 d 某些转座因子 Tn3 对同类转座因子的插入具有排他性 免疫性 e 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复 f 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应 转座的特点 c 转座插入的靶位点并非完全随机 插入专一型 2020 4 18 65 5 转座子转座频率的调控 转座酶的水平 控制自身转座的核心通过反义RNA的翻译水平控制 IS10R外侧边缘两个启动子甲基化作用控制转座酶合成过表达转座酶抑制转座 2020 4 18 66 表观修饰转座元件的甲基化 不同转座子不一样 SB促进 PB抑制组蛋白作用相关因子 细胞 生物类型 2020 4 18 67 5 转座子的某些遗传学效应 转座引起插入突变 IS Tn和Mu噬菌体都可能引起插入突变 插入位点若在一个顺反子 cistron 的前端功能基因中 可能造成极性突变 移码或终止密码突变 指减低蛋白质合成速度的基因突变 2020 4 18 68 2020 4 18 69 造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复IS1 Tn10 造成9bp的重复 IS3 造成3或4bp的重复 IS4 造成11bp的重复 插入位点出现新基因复合转座子带有抗性基因 如抗药性基因ampc 可产生两方面效应 一个基因的插入突变 出现抗药基因 2020 4 18 70 引起染色体畸变在一个染色体上 甚至不同染色体上 若有同一转座子的两个拷贝 其提供的相同重组位点 可导致缺失 倒位 插入 方向相同 产生缺失 方向相反 发生倒位 转座引起的生物进化 2020 4 18 71 2020 4 18 72 通过转座子介导的姐妹染色单体间的染色体内异位交换 2020 4 18 73 切除效应指转座子从原来位置上消失 准确切除 使原插入发生恢复突变 不准确切除 留下转座子残迹 产生插入突变 但转座子标志消失 2020 4 18 74 转座子切离所造成的序列变异 2020 4 18 75 外显子改组当二个转座子被同一转座酶识别而整合到染色体的邻近位置时 则位于它们之间的序列有可能被转座酶作用而转座 如果这DNA序列中含有外显子 则被切离并可能插入另一基因中 这种效应称为外显子改组 exonshuffling 图 外显子改组将导致基因组中新基因的产生 2020 4 18 76 双转座子插入所引起的外显子改组示意图 2020 4 18 77 1 可使原来相距较远的基因组合在一起 形成一个操纵子 2 产生一个新蛋白 把原来两段分离的DNA序列连在一起 3 启动子部位的插入可使基因打开或关闭 4 过多转座 频率过高 对细胞不利 细胞在长期进化中形成了一些不利于转座的代谢途径 可与转座过程平衡 5 转座基因插入时 大多数受体基因均被钝化 但也有基因被激活 这是因为转座子有自己的启动子 在使转位酶转录的同时 也可使相邻基因转录 6 转座子效应的意义 2020 4 18 78 第五节原核和真核生物转座成分 2020 4 18 79 1 原核生物转座因子 原核生物转座因子的类型 插入序列 转座子 转座噬菌体 2020 4 18 80 A 插入序列 IS insertedsequence 简单的转座因子 携带有转座酶基因 两端有反向重复序列 eg E coli中的IS1 IS11等 发现 E coli中一种突变体 A 不能通过核酸置换回复 非点突变 B 可自然回复 不是缺失 C 突变比野生型密度梯度大 增加一段DNA D 变性单链电镜下出现颈环结构 反向重复序列 2020 4 18 81 B 转座子 Tn transposon 携带有转座酶基因及抗性基因或其它基因 两端有相同的序列 IS eg 酵母 Yeast 中的Tn1 Tn2 Tn9等Tn3 携带有tnpA ampR tnpR等基因 两端分别有36bp的IR Tn9 末端是两个IS1 2020 4 18 82 C 转座噬菌体 mutatorphage 巨型转座子携带有tnpA tnpB基因 末端有E coliDNA 近邻类似IS序列 具有高频的转座作用 2020 4 18 83 CrepressorforA BB33kd与转座有关A70kd转座酶U S毒性蛋白attL attR与寄主同源 反向重复 转座必需GinG区倒位酶 G倒位区38kb P gin 以E coli为寄主的温和型噬菌体 溶源 裂解 2020 4 18 84 Mu的插入途径 a 侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄DNA b 进入裂解生长后 复制产生后代MuDNA几乎全部插入寄主DNA中 并可继续转座 形成寄主DNA和Mu的共合体 噬菌体成熟时 切段共合体包装 2020 4 18 85 5真核生物转座成分 玉米地中的先知BarbaraMcClintock1902 1992NobelPrizeforPhysiologyMedicine1983 2020 4 18 86 McClintock1938年 提出转座基因概念1944 1950 阐明 Ds Ac调控系统 1983年 获诺贝尔生理医学奖J Shapiro等1980年 证实了可移位的遗传基因存在 2020 4 18 87 1 真核生物的转座子分类 a 转座机制与细菌的转座子类似遗传信息 DNA DNA 玉米的Ac Ds元件 果蝇的P元件和FB元件等 b 转作机制类似逆转录病毒遗传信息 RNA DNA RNA 如 逆转录病毒 果蝇的Copia元件 酵母的Ty元件 根据转座机制目前分为两类 2020 4 18 88 Ac因子全长4 5kb 有5个外显子 其产物是转座酶 Ac因子两端是长11bp的反向重复序列 IR Ds因子长0 4 4kb 它的中间 在转座酶基因中 有许多种长度不等的缺失 如Ds9只缺失194bp 而Ds6则缺失2 5kb Ds的两端也都有11bp的反向重复序列 2 玉米的Ac Ds元件 2020 4 18 89 2020 4 18 90 由于缺失转座酶 Ds因子不能自主移动 因此Ds因子是非自主移动的受体因子 dissociator 而Ac则为自主移动的调节因子 activator Ds的转座依赖于Ac元件的存在 Ac Ds的转座属于非复制机制 即不是复制一份拷贝后将拷贝转移 而是直接从原来位置消失 2020 4 18 91 玉米转座因子对胚乳颜色的影响 2020 4 18 92 Ds转座还可以导致染色体断裂 McCtinock还发现Ds存在于玉米9号染色体的一条臂上 带有结节 Ds可导致染色体断裂 2020 4 18 93 spm因子影响基因的表达 Spm因子 11个外显子 产生2 5kb左右的转录本 合成包含621个氨基酸的tnpA蛋白 tnpA蛋白与切除功能有关 第一个内含子中包含ORF1和ORF2两个附加的开放阅读框 选择性剪切过程中产生包含ORF1和ORF2的mRNA 长约6kb 数量是tnpAmRNA的1 编码tnpB蛋白 该蛋白与末端重复序列的结合有关 2020 4 18 94 Spm因子的插入可以控制插入位点基因的表达 1 dspm suppressibleallele 而自主性因子spm的介入 可导致基因的完全失活 原因是tnpA蛋白可以和非自主性spm因子的靶位点结合 使基因的转录无法继续 2 dspm dependentallele 在基因附近包含一个dspm因子 而不是基因内部 该因子可提供一个增强子 促进基因的表达 2020 4 18 95 3 果蝇中的转座子 P因子Copia因子 2020 4 18 96 果蝇的P因子有两种类型 一类是全长P因子 长2907bp 两端有33bp的反向重复序列 IR 有4个外显子 4个ORF 编码转座酶 图 另一类为缺失型P因子 它不能编码转座酶 它的转座依赖于全长P因子 缺失型P因子都是由活性P因子的中段缺失衍生