真核生物基因表达调控PPT课件

真核生物基因表达调控 1 EukaryoticGeneExpressionandRegulation 第八章 真核基因表达调控 真核生物基因表达调控 2 本章主要内容基因表达与调控的基本概念与原理转录水平的调控 transcriptionalregulation DNAlevel Genetic Chromatinlevel Epigenetic 转录后水平的调控 post transcriptionalregulation RNAinterference RNAi Proteindegradation Ubiquitin proteasome 真核生物基因表达调控 3 第一节基本概念与原理 BasicConceptsandPrinciples 真核生物基因表达调控 4 Genome cell srepertoireofDNA Transcriptome cell srepertoireofRNAtranscripts Proteome cell srepertoireofproteins 单个基因 单个细胞 中心法则 真核生物基因表达调控 5 一 基因表达的概念 基因组 genome 一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因 基因表达 geneexpression 基因经过转录 翻译 产生具有特异生物学功能的蛋白质分子或RNA分子的过程 基因表达调控 generegulation orregulationofgeneexpression 基因表达是受内源及外源信号调控的 真核生物基因表达调控 6 RegulationofGeneExpression 真核生物基因表达调控 7 二 基因表达的时间性及空间性 一 时间特异性 真核生物基因表达调控 8 人体发育过程中不同类型 珠蛋白的含量变化 真核生物基因表达调控 9 二 空间特异性 基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异 实际上是由细胞在器官的分布决定的 所以空间特异性又称细胞或组织特异性 cellortissuespecificity 在个体生长全过程 某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现 称之为基因表达的空间特异性 spatialspecificity 真核生物基因表达调控 10 BARD1isexpressedspecificallyintheapicaldomainsofArabidopsisinflorescence A ovules B anthers C andembryos D InsuithybridizationA B C D antisenseBARD1probe E senseBARD1probeasanegativecontrol 朱玉贤第五章课件 真核生物基因表达调控 11 四种母源影响基因的mRNA和蛋白沿果蝇胚胎前 后轴分布的浓度变化图 protein BICOID NANOS 第十章 基因和发育 mRNA 真核生物基因表达调控 12 Facts Identicalgenome VirtuallyeverycellinanorganismcontainsacompletesetofgenesSpatialspecificity ButtheyarenotallturnedonineverycellortissueTemporalspecificity EachcellofanorganismexpressesadistinctivesubsetofgenesatdifferenttimeordevelopmentalstageTightregulation Duringdevelopmentdifferentcellsexpressdifferentsetsofgenesinapreciselyregulatedfashion 真核生物基因表达调控 13 三 基因表达的方式 按对刺激的反应性 基因表达的方式分为 一 组成性表达 constitutiveexpression 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达 通常被称为管家基因 housekeepinggene 真核生物基因表达调控 14 这类基因表达又称为组成性基因表达 constitutivegeneexpression genesforessentialcellularstructuresandmetabolicpathways e g rRNA actin tubulin usuallyexpressedathighleveltheleveloftheirgeneexpressionmayvary Housekeepinggenes rRNA actin tubulinarecommonlyusedasloadingcontrolinRT PCRorNorthernblot 真核生物基因表达调控 15 二 诱导和阻遏表达 在特定环境信号刺激下 相应的基因被激活 基因表达产物增加 这种基因称为可诱导基因 induciblegenes 如果基因对环境信号应答是被抑制 这种基因是可阻遏基因 repressiblegenes 基因表达调控大多数是对这些基因的转录和翻译速率的调节 从而导致其编码产物的水平发生改变 影响其功能 真核生物基因表达调控 16 四 基因表达调控的生物学意义 一 维持细胞增殖 分化 二 维持个体生长 发育 三 适应环境变化 第九 十章 基因与疾病 基因与发育 将要讲到 真核生物基因表达调控 17 1 Transcripts 转录本 beginandendbeyondthecodingregion 5 UTRand3 UTR 2 Theprimarytranscriptisprocessedby 5 capping3 formation polyAsplicing 3 Maturetranscriptsaretransportedtothecytoplasmfortranslation 一般而言 基因表达调控主要是发生在基因转录水平上的调节 即 mRNA合成的多少 transcription 真核生物基因表达调控 18 五 基因转录调节基本要素 一 RNA聚合酶 RNAPolymerase 二 特异DNA序列 cis actingelements 三 调节蛋白 trans actingfactors GeneexpressionregulationatthelevelofDNA transcriptionalregulation highlysequence dependent variedregulationfordifferentgenes 真核生物基因表达调控 19 cis actingelements promoters regulatorysequencesofgenestrans actingfactors proteinsandRNAsthatbindcis elementsandpromoteorrepressgeneexpression 真核生物基因表达调控 20 一 RNA聚合酶启动子 调节序列和调节蛋白通过DNA 蛋白质相互作用 蛋白质 蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性 RNAPolI rRNA 相对活性50 70 RNAPolII mRNA 相对活性20 40 RNAPolIII tRNA 相对活性10 RNAPolIV smallncRNA 相对活性 真核生物基因表达调控 21 真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异DNA序列 称为顺式作用元件 cis actingelement 顺式作用元件能够被转录调节蛋白特异识别和结合 从而影响基因表达活性 启动子 promoter 顺式作用元件又分增强子 enhancer 沉默子 silencer 二 特异DNA序列 真核生物基因表达调控 22 反式作用因子 trans actingfactor 能直接或间接与顺式作用元件相互作用 进而调控基因转录的一类调节蛋白 统称为反式作用因子 按其功能不同 常有以下三类 基本转录因子 识别promoter元件转录调节因子 识别enhancer或silencer共调节因子 不能进行DNA 蛋白质相互作用 三 真核基因的调节调节蛋白 真核生物基因表达调控 23 RNA聚合酶 在转录因子帮助下 形成的转录起始复合物 holoenzyme 1 基本转录因子 generaltranscriptionfactor GTF 是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合 并启动转录的一类调节蛋白 TBP TATA boxbindingprotein TFII polIIassociatedTF 真核生物基因表达调控 24 2 转录调节因子 transcriptionfactor TF 这类调节蛋白能识别并结合转录起始点的上游序列和远端的增强子元件 通过DNA 蛋白质相互作用而调节转录活性 决定不同基因的时间 空间特异性表达 转录激活因子 transcriptionalactivator 转录阻遏因子 transcriptionalrepressor 3 共调节因子 transcriptionalregulator co factor 首先与转录因子发生蛋白 蛋白相互作用 进而影响它们的分子构象 以调节转录活性 本身无DNA结合活性 如果与转录激活因子有协同作用 共激活因子 与转录阻遏因子有协同作用 共阻遏因子 真核生物基因表达调控 25 常见转录因子的结构域 domain DNA结合域 DNAbindingdomain BasicAA K R rich positivelycharged 转录激活域 trans activationdomain TF 真核生物基因表达调控 26 ZincFinger bHLH bZIP Homeodomain 1 TF最常见的DNAbindingdomain 真核生物基因表达调控 27 1 锌指 zincfinger 常结合GCbox Cys X2 4 Cys X3 Phe X5 Leu X2 His X3 His C terminal helix bindingDNA 真核生物基因表达调控 28 2 碱性亮氨酸拉链bZIP 真核生物基因表达调控 29 bHLH蛋白 basicHelix Loop Helix 3 碱性螺旋 环 螺旋bHLH 真核生物基因表达调控 30 2 TF常见的trans activationdomain 真核生物基因表达调控 31 Activationdomainisinterchangeable 真核生物基因表达调控 32 InteractionAssaysDesignofTwo hybrid Three hybrid etc separablefunctionaldomains Two hybridassay protein protein Tri hybridassay protein RNA 真核生物基因表达调控 33 1 RNApolymeraseII2 promoterandenhancers3 transcriptionfactors Eukaryoticgeneexpressionisusuallycontrolledatthelevelofinitiationoftranscription 真核基因转录起始的调控 真核生物基因表达调控 34 Holoenzyme asupramolecularcomplexcomprisingPolII mostGTFs andMediator SrbcomplexInyeast a2MDaholoenzyme TBPsufficesfortranscription OrderedAssemblyandPolIIHoloenzyme TFIID TFIID one step multiple step 真核生物基因表达调控 35 TFIIBbindstoDNAandcontactsRNApolymeraseneartheRNAexitsiteandattheactivecenter andorientsitonDNA 25bp Q prok 10bpvseuk 25bp SequentialAssembly TBP TATAbindingproteinTAFs TBPassociatedfactors BindingofTFIID TBP 11TAFs 800KD totheTATAboxisthefirststepininitiation 真核生物基因表达调控 36 CTD RNAPolIIC terminaldomain CTDisanunusualextensionappendedtotheCterminusofthelargestsubunitofRNApolymeraseII Itcomprisesfrom25to52tandemcopiesoftheconsensusrepeatheptadY1S2P3T4S5P6S7 S2andS5aremajorphosphorylationsites CTDphosphorylationcausetheconversionofprolineisomerizationstates PhosphorylationpatternsontheCTDrepeatsdeterminedifferentsetsofassociatedfactors sothatprovideadynamicplatformtorecruitdifferentregulatorsofthetranscriptionapparatus Ineukaryoticcells thetranscriptionofgenesisaccuratelyorchestratedbothspatiallyandtemporallybytheC terminaldomainofRNApolymeraseII CTD 真核生物基因表达调控 37 PIC PhosphoS5isrequiredforassemblyofthePICandfacilitatesmRNAcappingviarecruitmentofcappingenzymes Elongation S5graduallybecomesdephosphorylated whereasS2isphosphorylated Terminating PhosphoS2ensuresefficient3 RNAprocessingbytriggeringrecruitmentof3 RNAprocessingmachinery Ending CTDsarefreeofphosphategroups non phosphorylatedCTDsarerequiredforRNApolymeraseIItorecycleandbindapromoterforthenextcycleoftranscription S2 S5 thetriggerfortranscriptionalprocessmodulation 真核生物基因表达调控 38 真核生物基因表达调控 39 FactorsinvolvedingeneexpressionincludeRNApolymeraseandthebasalapparatus activatorsthatbinddirectlyto co activatorsthatbindtobothactivatorsandthebasalapparatus andregulatorsthatactonchromatinstructure chromatinremodelingcomplex ManyTranscriptionalActivators i e CAATGC box 真核生物基因表达调控 40 Neartheinitiationsite Alittlefaraway 真核生物基因表达调控 41 SP1stimulatestranscriptioninpresenceofTAFII110 GCboxesboundbyDNAbindingproteinSP1SP1recruitsTFIIDbybindingTAFII110Partiallyreconstitutedcomplex TBPand3TAFs inadditiontootherGTFs PolIIleadstohighlevelsoftranscription SV40earlypromoter Near 真核生物基因表达调控 42 Mediatorcomplexistargetedbyanactivator Mediatorisastablecomplexcontainingseveralproteins 20 50 MediatorbindstotheRNApolIIandtranscriptionfactors activatorsorrepressors and mediates theregulatorysignalstopolII 中介复合体 Far 真核生物基因表达调控 43 Whatisthemechanismofactivation Twomodels Tetheringholoenzyme recruitment Activatingholoenzyme allosteric 真核生物基因表达调控 44 Infavorofrecruitmentmodel 勾引模型 真核生物基因表达调控 45 tatproteinofHIVcanstimulatetranscriptioninitiationwithoutbindingDNAatallTheactivatingdomainofthetatproteincanstimulatetranscriptionifitistetheredinthevicinityofpromoterbybindingtotheRNAproduct tarsequence ofapreviousroundoftranscription tar tat 真核生物基因表达调控 46 DNA bindingdomainistobringtheactivationdomainintothevicinityofthestartpoint Andactivationisindependentofthemeansoftethering wecanthinkofDNA binding orRNA bindinginthecaseoftat domainasprovidinga tethering function whosemainpurposeistoensurethattheactivationdomainisinthevicinityoftheinitiationcomplex Thenotionoftetheringisamoregeneralideathatinitiationrequiresahighconcentrationoftranscriptionfactorsinthevicinityofthepromoter Thismaybeachievedwhenactivatorsbindtoenhancers upstreampromoterelements orinanextremecasebytetheringtoanewly madeRNAproduct 真核生物基因表达调控 47 总结所有激活因子的共性 识别靶位点 启动子 增强子 的特异性由DNA结合域决定 DNA结合域将转录激活域带到基础转录区域附近 直接作用的激活因子具有DNA结合域和转录激活域 没有转录激活域的激活因子可能与具有转录激活域的共激活因子一起行使功能 基础转录区域中许多元件是 共 激活因子的靶位点RNA聚合酶可以和多种不同的转录因子相互作用 形成全酶复合物行使功能 真核生物基因表达调控 48 Synergy Highlevelsoftranscriptioninducedbymultiplefactors Transcriptionfactorscanenhancetranscriptioninanon linearmannerSynergisiticactivationoccursduetomultiplecontactswiththemachineryMultiplecopiesofthesameactivatoralsoinducesynergisticactivation 真核生物基因表达调控 49 Interferon enhancer EnhancersoftenhavebindingsitesforseveraltranscriptionfactorsTranscriptionfactorscanbindcooperativelyatadjacentsitesArchitecturalfactors withnoregulatorydomains i e HMG1 canassistassemblyRemarkablyincreasebindingaffinityforbothDNAandmachinery 真核生物基因表达调控 50 HMG1 肩并肩 手挽手 根基稳 魅力足 香肩并立 玉指紧扣 脚如磐石 面若桃花 真核生物基因表达调控 51 Onepossiblestrategy Looping Cohesinshelptostabilizeenhancer promoterinteractions Howdoenhancersactindependentofdistanceandorientation 真核生物基因表达调控 52 Anenhancermayfunctionbybringingproteinsintothevicinityofthepromoter AnenhancerdoesnotactonapromoterattheoppositeendofalonglinearDNA butbecomeseffectivewhentheDNAisjoinedintoacirclebyaproteinbridge AnenhancerandpromoteronseparatecircularDNAsdonotinteract butcaninteractwhenthetwomoleculesarecatenated Twoexperimentssupporttheloopingmodel Theessentialroleoftheenhanceristoincreasetheconcentrationofactivatorinthevicinityofthepromoter 真核生物基因表达调控 53 Receptorsformanysteroidandthyroidhormoneshaveasimilarorganization withanindividualN terminalregion conservedDNA bindingregion andaC terminalhormone bindingregion Steroidreceptorsaretranscriptionfactors ZincfingerTF 真核生物基因表达调控 54 Glucocorticoidsregulategenetranscriptionbycausingtheirreceptortotransportintothenucleusandbindtoanenhancerwhoseactionisneededforpromoterfunction ActivationofGlucocorticoidReceptor GR Nuclearshuttling 真核生物基因表达调控 55 利用GR的特性构建可诱导表达融合蛋白系统 Dexamethasone DEX 地塞米松 氟美松 抗炎药 合成的一种糖皮质激素 通过分子克隆的方法将GR和要研究的核蛋白X构建成融合蛋白 转基因到酵母 动物细胞或者植物中 不施加外源DEX时 融合蛋白与HSP90形成复合物 由于构象和空间位阻等原因 融合蛋白存在于胞质中 不能定位到细胞核 添加DEX时 DEX扩散入胞与GR相结合 融合蛋白改变构象后核定位信号暴露 即可入核行使功能 用以研究核蛋白的功能 包括转录因子 真核生物基因表达调控 56 ActivationTaggingapproachinplants Planttransformation mutantsscreeninglocateT DNAinsertionsiteinArabidopsisgenome how identifytherightgeneconferringmutantphenotype how 构建T DNA序列 其中包括4倍重复的CaMV的35S增强字序列 4 35S元件可以大大增强相邻基因的转录 通过转基因的方法将T DNA片段整合到植物基因组中 植物基因组上与T DNA插入位点相近的基因表达量增高 即得到这个基因gain of function的转基因植物 真核生物基因表达调控 57 XVE LexA的DNA结合域 X VP16转录激活域 V humanestrogenreceptor调控域 E NPTII 转基因筛选标记OLexA 46 LexA操纵子 CaMV35S基本启动子 而非增强子 Achemical inducibleactivationtaggingvectorpER16inplants RB LB T DNAfragment 可以插入到基因组中 其工作原理为 在G10 90启动子控制下 XVE融合转录因子组成型表达 当加入雌激素 雌激素和受体调控域 E 结合 导致XVE融合蛋白构象发生变化 并由细胞质转移进入核内 在细胞核内 XVE中的LexADNA结合域 X 特异识别LexA操纵子区 OLexA VP16的转录激活域 V 激活LB旁边的基因高水平表达 真核生物基因表达调控 58 EnhancerTrap Enhancertrap的质粒包含一个报告基因 lacZ 和基本启动子 这段启动子不足以启动报告基因的表达 但是对增强子非常敏感 将这样的质粒整合到基因组中 如果