H5N1禽流感病毒中和抗体抗原结合表位的分析研究.doc

国家自然科学基金申请书申请代码：C03011403受理部门： 收件日期：受理编号：第 29 页 版本1.007.544国家自然科学基金申 请 书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了资助类别：面上项目亚类说明：自由申请项目附注说明： 项目名称：H5N1禽流感病毒中和抗体抗原结合表位的分析研究申 请 者：周伯平 电话：依托单位：广东医学院 通讯地址：深圳市布心路2019号 邮政编码：518020 单位电话电子邮件： 申报日期： 2007年3月1日国家自然科学基金委员会基本信息yoKWT/OQ申 请 者 信 息姓名性别男出生年月1962年9月民族汉族学位博士职称主任医师主要研究领域病毒性肝炎和新发传染病 电电子邮件 传个人网页 工作单位广东医学院 /附属深圳市第三人民医院在研项目批准号 依托单位信息名称代 码52402301 联系人吴柱国 电子邮件 电网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码00000000 20003119 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 申请代码C03011403:传染病的预防与治疗研究 基地类别 预计研究年限2008年1月 2010年12月研究属性基础研究 申请经费38.5000万元摘 要(限400字)：本项目在我们发现H5N1禽流感患者恢复期血清具有显著的体内抗病毒效果的前期工作基础上，采用H5N1假病毒体系,结合EBV转化B细胞单克隆筛选技术分析确定H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位。采用H5N1禽流感病毒感染小鼠模型，对B细胞克隆分泌的中和抗体的体内抗病毒效果进行测定和评价。通过对恢复期血清供者和受者的血清中H5N1禽流感病毒中和抗体谱及其滴度的分析，为人禽流感的免疫血清治疗提供实验室依据，为评价人禽流感疫苗免疫效果提供中和抗体谱的参照。项目的完成所确定的中和抗体抗原结合表位的氨基酸序列，是设计H5N1禽流感亚单位疫苗的重要依据；而分泌中和抗体的B细胞克隆是制备治疗用单克隆抗体的重要物质基础。 关 键 词(用分号分开，最多5个)H5N1禽流感病毒，中和抗体，抗原结合表位，细胞克隆，被动免疫治疗 项目组主要成员（注: 项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）11970-2-17 男副主任医师博士广东医学院2101 抗体筛选 6 21965-5-21 男副主任医师博士广东医学院 重组蛋白表达 6 31967-6-16 女主管护师其他广东医学院2101 临床治疗 病例随访 6 41976-7-7 男主管技师学士广东医学院3122 免疫学实验 3 51982-9-22 女硕士生学士广东医学院3122 动物实验 6 61980-4-8 女博士生硕士中国科学院上海生命科学研究院上海交通大学医学院健康科学研究所 B细胞克隆筛选 6 71977-1-24 男助理研究员硕士中国科学院上海生命科学研究院 假病毒的制备 6 8 9总人数高级中级初级博士后博士生硕士生833011说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费34.70001.科研业务费3.5000（1）测试/计算/分析费1.0000HA截断蛋白的设计，抗原表位肽的设计（2）能源/动力费（3）会议费/差旅费1.0000往来香港大学、上海中科院进行实验和交流（4）出版物/文献/信息传播费1.5000SCI论文2篇、中文期刊23篇（5）其它2.实验材料费20.7000（1）原材料/试剂/药品购置费19.2000免疫磁珠、流式抗体、细胞培养试剂，重组蛋白表达，假病毒制备等（2）其它1.5000禽流感患者标本采集和运输3.仪器设备费0.0000（1）购置（2）试制4.实验室改装费5.协作费10.5000中和抗体效价测定及其体内抗病毒效果二.国际合作与交流费0.00001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流三.劳务费2.0000研究生劳务费用四.管理费1.8000合 计38.5000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）38.5000其他经费来源合计38.5000报告正文一、项目的立题依据和研究内容1. 项目的立题依据1）研究目的和意义人感染H5N1型高致病性禽流感病情重、病死率高（超过50%）1，目前还没有特异有效的治疗药物和方法。2003年底以来，亚洲地区持续暴发H5N1型高致病性禽流感。同时，禽流感跨重属之间传播的现实提示，禽流感病毒在人与人之间的传播并造成爆发流行只是时间问题1。抗流感病毒药物奥司他韦一般在发病后48小时内使用有一定作用2，而临床上绝大多数患者确诊时已经错过了最佳时机。与此同时，奥司他韦抗药性的H5N1耐药株的出现，提示无论是预防还是治疗，奥司他韦均不可能是一个满意的答案。另一个应对的选择就是预防性疫苗的应用，但由于病毒的高致病性，目前离研制出大量有效稳定的疫苗还有相当远的距离3。在这一方面，亚单位流感疫苗在安全性和大量制备工艺上有明显的优势，但有赖于H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位的确定。被动免疫是有效预防和治疗流感的另一可能策略。采用免疫血清被动免疫治疗在许多病毒性疾病取得了很理想的结果4。其中，最能引起人们注意的是2003年的恢复期血浆有效治疗SARS病毒感染的报道5。因此，有理由相信免疫血清治疗对同为病毒性疾病的人禽流感应该是一个有效的方法。目前，有关免疫血清的中和抗体的抗原特异性（抗原结合表位）、中和抗体的体内抗病毒作用及其机制、免疫血清/抗体治疗的疗效预测指标和临床使用的指南性方案等等许多问题还不清楚。从而限制了免疫血清治疗人禽流感的临床应用。只有对这些问题的深入研究，才能为人禽流感的被动免疫治疗提供切实可行的方案。而解决这些问题的关键切入点就是对中和抗体的抗原结合表位的分析。因此，本项目在我们发现H5N1禽流感患者恢复期血清具有显著的体内抗病毒效果的前期工作基础上，采用H5N1假病毒体系,结合EBV转化B细胞单克隆筛选技术分析确定人H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位。采用H5N1禽流感病毒感染小鼠模型，对B细胞克隆分泌的中和抗体的体内抗病毒效果进行测定和评价。通过对恢复期血清供者和受者的血清中H5N1禽流感病毒中和抗体谱及其滴度的分析，为人禽流感免疫血清治疗提供实验室依据，为评价人禽流感疫苗免疫效果提供中和抗体谱的参照。项目的完成所确定的中和抗体抗原结合表位的氨基酸序列，是设计H5N1禽流感亚单位疫苗的重要依据；而分泌中和抗体的B细胞克隆是制备治疗用单克隆抗体的重要物质基础。2）国内外研究现状及分析a.免疫血清/特异性抗体治疗人H5N1禽流感病毒感染的效果据我们调查，除我们之外，目前还没有采用免疫血清治疗人禽流感的报道。主要的担忧是流感病毒抗原变异导致中和抗体无法有效的中和病毒。对甲型流感病毒H3N2的血凝素（HA）抗原区分析后，确定了两个突出表面的位于靠近受体结合区的肽环，分别是140-146位氨基酸残基组成的的140s 环和155-164位氨基酸残基组成150s 环，是中和抗体的结合识别部位6。研究显示，这些肽环易于发生抗原漂移和突变进而导致这些区域的糖基化，使得中和抗体无法与相应的区域结合7。相似的肽环也在H5N1病毒中发现，对不同H5N1病毒株HA同一区域的氨基酸序列分析发现，2004年从越南分离的H5N1病毒株存在可能糖基化的氨基酸位点3, 8。上述抗体因可阻断病毒吸附到宿主细胞而可能具有较强的中和病毒作用，但从理论上讲，中和抗体不仅仅包含针对上述两个肽环特异性的抗体。针对病毒的其他相对保守抗原如HA其他区段的抗体包括受体结合区的190螺旋（190 -helix），或作用于病毒复制的吸附后阶段的病毒特异性抗体如NA的抗体，同样可以中和病毒作用3。因此，理论上采用H5N1禽流感患者恢复期血浆或接受H5N1病毒疫苗免疫的免疫血清治疗同为H5N1病毒的感染，存在因基因变异而导致抗HA中和抗体无法结合相应抗原的可能很小。Lu等报道采用灭活的非致病性H5N2病毒（A/Duck/pottsdam/1042-6/86）为疫苗免疫小鼠产生的抗体可以交叉保护宿主对高致病性H5N1的病毒感染9。2006年，我们对收治的深圳市首例重症禽流感患者进行了H5N1禽流感患者恢复期血浆治疗，发现在给予恢复期血浆治疗后，患者体内病毒量迅速下降10, 11。在输注血浆后32小时内，病毒载量从3.94 log copies/mL降至低于检测下限水平，下降近10，000倍。连续监测病毒载量显示患者体内病毒量已得到有效的控制和清除。伴随病毒载量的下降，患者的临床表现、肺功能和胸部放射学检查均有明显的改善。据我们了解，这是全世界第一个，也是迄今为止唯一一个采用恢复期血浆治疗人H5N1禽流感的报道10。尽管由于缺乏病例对照，1例患者免疫血浆治疗的成功不好断言免疫血浆（血清）的治疗效果，但我们的观点得到其他实验室结果的支持3, 12, 13。Hanson 等和Lu等分别采用人源化的抗甲型流感H5 血凝素抗原的单克隆抗体和H5N1免疫的马免疫球蛋白的F（ab）2治疗致死剂量H5N1感染的小鼠，发现被动免疫能够有效的保护感染小鼠，显著降低感染小鼠的死亡率。在感染早期给予足量的抗体治疗，可以使小鼠不发病3, 12。这些结果表明，免疫血清是可以有效的抑制和清除H5N1的感染。Luke 等对1918年世界流感大流行期间，采用恢复期血制品（全血、血浆、血清，主要为血清）治疗的临床报道进行了meta分析13。正如文中所述，尽管由于大部分临床试验没有严格的随机对照分组，接受恢复期血制品治疗的病人多为病情较为严重而常规治疗无效的患者；但就已有的资料分析显示治疗组的总死亡率（54/336,16%）显著低于非治疗组(452/1219,37%)13。不仅如此，接受免疫血清治疗的患者的临床表现如呼吸频率、发热、疲乏、白细胞数等等显著较对照组改善得快。尽管例数较少，Mcguire 等的资料提供非常有益的启示，即流感患者恢复期血清与同一时期的正常人血清的治疗效果显著不同，前者在改善临床表现方面具有显著优势13。因此，免疫血清治疗人H5N1感染值得进一步的探索。随着现代血浆分离置换技术的问世，各大城市的血站甚至医院都配备了相应的设备和人员。使得大量血浆采集安全简便，按照美国FDA的规定，健康个体可以每周采集血浆1000到1200mL。按此计算，一个H5N1康复者，提供一次血浆就可以供多个患者使用。所收集血浆不仅可供当地的患者使用，而且还可冻存或制备成免疫球蛋白，供其他地区或不同时期的患者使用。如果免疫血浆治疗人H5N1禽流感的疗效和标准方案得以建立，对治疗人禽流感具有重要的实践意义。当然，恢复期血清的使用也存在一些问题，包括抗原性及其血制品使用的安全性问题，而最主要的是大量血清的来源问题。理想的选择应该是采用生物技术制备的中和抗体，而制备中和抗体的基础就是对中和抗体的抗原结合表位及其中和效价的认知。b. H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位的分析研究理论上，中和抗体是恢复期血清体内抗病毒效果的主要元素。因此，对恢复期/免疫血清中的中和抗体的研究显得十分重要。这其中，对中和抗体的特异性抗原结合表位的确定又是关键点。因为，后者既是对中和抗体的进行特征性分析和探讨免疫血清治疗的疗效和机制的基础，又是研制开发治疗用中和抗体和亚单位疫苗的重要信息。然而，目前还没有人H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位信息方面的报道。事实上，由于多种原因，目前对H5N1禽流感病毒抗体的研究报道极少。已有的资料显示，大约在病毒感染后2周，患者体内就可以检测到H5N1病毒中和抗体的存在14。采用血凝抑制实验，通过测定从H5N1减毒疫苗免疫小鼠制备的单克隆抗体与不同H5N1病毒分离株的反应性，Hanson等对中和抗体VN042的抗原结合位点进行了大致的定位分析3。然而，这一方法显然受限于可用于实验的病毒分离株的数量及其变异程度，因而难以对抗原结合位点进行准确的定位，同时实验的生物安全要求高也是一个限制因素。因此，建立快速准确的分析方法，是推进研究中和抗体抗原表位的关键。对流感病毒复制过程的观察结果显示病毒HA与细胞受体结合是病毒感染细胞的起始和关键步骤。HA诱导机体产生的抗体是最重要的中和抗体，当然，抗NA的抗体也有一定中和作用。事实上，病毒中和实验测定出的抗流感病毒的主要成分是抗HA抗体15。因此，采用基因工程技术，将不同长度的重叠序列HA和NA表达在细胞或重组的假病毒表面，根据中和抗体与这些表达HA和NA的细胞或假病毒抗原结合能力，就可以较准确的分析抗体的结合表位。同样利用这一体系，可以实现关键结合位点的突变，对抗体抗原结合位点进行精确分析。研究显示，联合应用重叠序列的重组蛋白和人工合成的重叠序列多肽，是分析SARS病毒和麻疹病毒中和抗体的特异性抗原结合表位的切实可行的方法16, 17。由于恢复期血清含有多种中和抗体的存在，采用上述方法可以分析血清中不同抗原特异性抗体的组成（抗体谱）和总的病毒中和抗体效价。对于H5N1病毒感染康复者及其免疫者血清中中和抗体的抗原结合表位，还需要在单克隆水平才能确定。从免疫小鼠的脾细胞，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体是既往分析其他病毒中和抗体的常用方法。杂交瘤技术可以用于单克隆抗体的大量制备，但对于抗体的抗原结合表位分析来说，该技术太费时费力，而主要的缺陷是得率低。再者，鼠源性单克隆抗体在日后的应用还需要进一步的人源化。而采用噬菌体展示技术从抗体cDNA文库筛选单克隆抗体，对筛选用的抗原纯度要求高，而且筛选出的单克隆抗体的亲和力较难达到理想要求。新近，Traggiai 等以表达在BHK细胞表面的S蛋白为抗原，采用改良EBV转化B细胞技术，从SARS康复患者的记忆型B细胞中克隆筛选出35种具有中和作用的单克隆抗体，显示出该检测系统的实用性和优越之处，特别是与传统的微量细胞培养中和试验的抗体测定方法相比，无须BSL3的要求，大大地提高实验效率18。这对同样为包膜病毒的H5N1病毒中和抗体的抗原结合表位分析具有很好的借鉴意义。c. 假病毒在H5N1禽流感中和抗体的测定中的应用病毒中和作用是中和抗体特征性生物功能，测定抗体的病毒中和效价最常用的方法是微量细胞培养中和试验。但由于H5N1病毒的高致病性，微量中和实验要求在生物安全三级实验室进行，同时由于难以扩增高滴度的病毒液，使得制备病毒的过程费时费力。此外，由于中和抗体效价的确定依赖于对CPE的主观观察，使得结果在一定程度上受主观因素的影响。鉴于中和抗体主要是针对病毒表面膜蛋白，因此，可以采用整合H5HA和/或NA蛋白的假病毒替代真正的H5N1病毒进行抗体中和效价的测定。假病毒的应用可以较好的解决上述弊端，同时，通过在病毒基因中引入报告基因如荧光蛋白酶（Leu）或GFP可以客观的测定抗体的中和效价。此外，还可以通过对H5基因的突变，改变抗原结合位点的关键序列，对抗体的抗原结合位点及其中和效果进行分析。应用假病毒进行抗体中和活性测定在SARS和HCV等等均有成功的报道。有关H5N1假病毒的构建及其应用，目前国外还没有文献报道，国内刘华雷等构建了整合禽类来源的H5基因的鼠白血病假病毒，但还没有整合HA及NA的假病毒构建表达的报告，也没有表达临床分离株的HA的假病毒的报道19。本项目的合作者中科院上海巴斯德研究所构建了表达从不同禽流感患者分离病毒株H5HA基因和NA的假病毒，通过流式细胞分析感染细胞表面的HA的表达情况，发现HA的高效表达依赖于NA的帮助。采用制备的假病毒，对接受H5基因疫苗免疫的小鼠血清中和抗体测定分析，显示很好的应用前景。参考文献：1.Weber CJ. Update on preparing for the next influenza pandemic. Dermatol Nurs, 2006, 18: 362-6.2.Jefferson T, Demicheli V, Rivetti D, et al. Antivirals for influenza in healthy adults: systematic review. Lancet, 2006, 367: 303-13.3.Hanson BJ, Boon AC, Lim AP, et al. Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice. Respir Res, 2006, 7: 126.4.Hemming VG. Use of intravenous immunoglobulins for prophylaxis or treatment of infectious diseases. Clin Diagn Lab Immunol, 2001, 8: 859-63.5.Cheng Y, Wong R, Soo YO, et al. Use of convalescent plasma therapy in SARS patients in Hong Kong. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2005, 24: 44-6.6.Wiley DC, Wilson IA, and Skehel JJ. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature, 1981, 289: 373-8.7.Caton AJ, Brownlee GG, Yewdell JW, et al. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (H1 subtype). Cell, 1982, 31: 417-27.8.Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, et al. H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes. Embo J, 2002, 21: 865-75.9.Lu X, Edwards LE, Desheva JA, et al. Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses. Vaccine, 2006, 24: 6588-93.10.刘水腾，周伯平. 深圳市首例H5N1人禽流感临床报告. 中华传染病杂志, 2007, 25.11.Zhou B CX, Smith G, Qiu C, Xu K, Li Y, Duan L, Liu S, Yuan J, Lu P. Convalescent Plasma Therapy of Influenza A (H5N1) Infection. N Engl J Med, 2007, submitted.12.Lu J, Guo Z, Pan X, et al. Passive immunotherapy for influenza A H5N1 virus infection with equine hyperimmune globulin F(ab)2 in mice. Respir Res, 2006, 7: 43.13.Luke TC, Kilbane EM, Jackson JL, et al. Meta-analysis: convalescent blood products for Spanish influenza pneumonia: a future H5N1 treatment? Ann Intern Med, 2006, 145: 599-609.14.Katz JM, Lim W, Bridges CB, et al. Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts. J Infect Dis, 1999, 180: 1763-70.15.Wang Z SJ. Detection of neutralizing antibody against influenza virus. GUO WAI YI XUE YU FANG ZHEN DUAN ZHI LIAO YONG SHENG WU ZHI PIN FEN CE, 2004, 27: 130-132.16.Chou TH, Wang S, Sakhatskyy PV, et al. Epitope mapping and biological function analysis of antibodies produced by immunization of mice with an inactivated Chinese isolate of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV). Virology, 2005, 334: 134-43.17.Zvirbliene A, Kucinskaite I, Sezaite I, et al. Mapping of B cell epitopes in measles virus nucleocapsid protein. Arch Virol, 2007, 152: 25-39.18.Traggiai E, Becker S, Subbarao K, et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med, 2004, 10: 871-5.19.刘华雷 RL-J, 周斌, 魏建超, 郑其升, 陈溥言. 表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的重组鼠白血病病毒的特性. 生物工程学报, 2005, 21: 47-51.2. 项目的研究内容、研究目标和拟解决的关键问题 1）研究目标a. 明确H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位及其体内抗病毒作用效果b. 测定H5N1禽流感患者恢复期血清中和抗体谱，为临床免疫血清治疗提供实验室依据和指导意见。c. 获得分泌单克隆抗体的B细胞克隆2）研究内容a. H5N1假病毒的制备及其在抗体中和试验中的应用以慢病毒（逆转录病毒）载体为基础，构建表达H5HA，H5HA/NA，HA/NA/M2,的假病毒。根据载体中的报告基因Luc活性的测定分析假病毒的感染性，采用流式细胞技术分析表面表达的H5N1基因情况进行测定分析。通过与微量中和试验的结果进行平行比较，评价采用假病毒测定中和抗体效价的敏感性和特异性。在前期工作中，我们已经成功构建制备了表达不同H5N1分离株HA，HA/NA、HA/NA/M2的假病毒，并发现HA的高表达需要NA的协同作用。通过测定假病毒感染细胞中荧光蛋白酶的活性，发现假病毒的感染活性与VSV相当。采用假病毒测定HA基因疫苗免疫小鼠血清中和抗体效价，显示出病毒中和作用与抗体的稀释度之间密切相关性。b. 表达重叠序列的HA截断重组子的构建及其在真核细胞中的表达根据HA的功能分区、空间结构、与受体结合区的组成、糖基化位点的分布设计N端与另一蛋白C端重叠的截断蛋白的表达，构建相应的真核表达载体并在真核细胞中表达。以表达目的基因的细胞或纯化蛋白为抗原，通过测定恢复期血清或B细胞克隆上清与不同区段截断蛋白的反应性，是分析中和抗体的抗原结合位点的重要一步，可以将抗体的结合位点作一大致初步定位。c. 从H5N1禽流感康复者记忆型B细胞库中克隆分泌中和抗体的B细胞H5N1禽流感康复者体内产生H5N1特异性抗体的细胞分布在记忆型B细胞中，采用改良的EBV转化技术结合限制性稀释的方法，从记忆型B细胞库中克隆分泌H5N1禽流感抗体的B细胞克隆。在这一过程中，早期制备的H5N1假病毒可以用于替代微量中和实验检测克隆上清中是否含有中和抗体，从而提高克隆筛选的效率。克隆B细胞上清中的单克隆抗体或其纯化物是进行抗原结合表位分析的物质基础。 d. 中和抗体表位的分析和确定 对上述B细胞克隆分泌的具有中和作用的单克隆抗体进行抗原表位分析是本项目的核心内容。我们首先分析抗体与重组截断蛋白的反应性，初步定位抗体识别的区段。然后，结合对识别抗原的生物信息分析，采用合成的重叠序列多肽对中和抗体的线性抗原结合表位进行确定。e. 中和抗体对H5N1病毒感染小鼠的体内抗病毒效果我们将对中和抗体的体内抗病毒作用进行研究。观察中和抗体被动免疫对小鼠体内H5N1病毒的清除作用及其对感染小鼠生存结果的影响。实验结果可以为中和抗体被动免疫治疗提供直接的实验证据。f. H5N1禽流感患者及接受免疫血清治疗者中和抗体谱及其滴度的分析以上述真核表达的HA，NA，重叠序列的截断HA以及合成的多肽为抗原检测供者和受者血清中的中和抗体种类及其滴度，比较两者抗体谱的差别。对接受治疗的禽流感患者不同时间点（恢复期血清输注前及输注后不同时间）的血清标本中和抗体谱的进行测定分析。这些结果可以提供以下信息，第一恢复期血清含有的抗病毒作用的中和抗体的量，从而为恢复期血清有效治疗的临床观察提供实验室依据。第二，中和抗体谱既是对B细胞克隆分析结果的验证，又是很好的补充。第三，中和抗体谱还是评价疫苗免疫效果的重要参考。3）拟解决的关键问题：a. 用于抗原结合表位分析的中和抗体的克隆我们的目的是分析中和抗体的抗原结合表位，需要尽可能获得所有针对HA的中和抗体谱，但不需要大量生产。传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体技术，费时费力，主要的缺陷是得率太低，不能完全反应宿主产生的抗体谱。而噬菌体抗体技术需要制备高纯度的筛选用抗原，而且筛选的抗体亲和力是主要问题。为此，我们拟选择改良的EBV转化B细胞克隆技术，从记忆型B细胞中克隆出分泌中和抗体的B细胞。这一技术已经成功应用在SARS单克隆抗体的制备中。更重要的是，项目的合作者中科院上海健康研究中心在这方面积累丰富的经验，在技术上不存在障碍。在征得患者同意的情况下，我们已经获得足够的供本实验需要的外周血单核细胞（PBMC），平行的血清血凝抑制实验结果显示，血凝抑制抗体效价高达1:12800。这为本项目的顺利完成准备了物质和技术基础。b. H5N1禽流感假病毒检测中和抗体技术的建立。采用假病毒来检测中和抗体的效价，可以大大提高效率，而且通过对荧光蛋白酶活性的定量测定中和效价更为客观。所建立的方法不仅可以用于本项目的B细胞克隆的筛选，也可用于将来评价免疫血清中和抗体效价和免疫血清治疗的预后。所制备的假病毒必须正确的将H5HA表达在病毒表面、感染效率和复制效率高。建立的基于假病毒检测中和抗体滴度方法必须敏感、特异和重复性好。在前期工作中，我们已经成功制备了可用于中和抗体测定的禽流感假病毒，显示很好的特异性。目前只要将相应的假病毒用深圳H5N1病毒基因取代即可完成假病毒的制备。通过与微量中和试验测定的免疫血清的中和效价比较，对假病毒检测中和抗体方法的敏感性和特异性进行评价。c. H5N1禽流感病毒中和抗体的特异性抗原结合表位的确定采用重叠序列的蛋白和多肽的可以对抗-HA单克隆抗体的抗原结合表位进行确定。但是部分中和抗体识别可能不是线性多肽，而是结构型抗原决定族。对这一部分中和抗体抗原结合表位的确定，除了采用重组的蛋白定位外，可以结合生物信息分析的结果，构建基因突变的假病毒，根据抗体与关键结合位点突变的假病毒的反应性，来定位抗体抗原结合表位。3. 拟采取的研究方案及可行性分析研究方案：1） H5N1禽流感假病毒的制备及其在测定中和抗体效价中的应用因为前期工作中发现NA对HA高表达起重要的协同作用，而M2的作用较小，所以我们构建制备含全长HA和NA的假病毒。将HA、NA全基因分别克隆在包膜载体(envelope vector)，置于CMV启动子下，然后与含有报告基因（Luc）的慢病毒骨架载体（Transfer vector, 图1）及其结构蛋白（gag/pol）载体（packaging vector）共同转染病毒包装细胞，制备H5N1禽流感假病毒（见图1）。以此假病毒感染禽流感病毒易感细胞如MDCK，通过测定感染细胞内的荧光蛋白酶活性，建立测定血清或B细胞克隆上清的中和抗体效价的方法。通过与微量中和试验结果的平行比较，评价假病毒中和抗体测定方法的敏感性和特异性。图1. H5N1禽流感假病毒载体的构建示意图2） 分泌中和抗体的B细胞克隆的筛选从两位禽流感患者采集外周血，分离PBMC，然后采用免疫磁珠（CD22）和FACS负分选获得IgG+的记忆型B细胞，将上述记忆型B细胞在EBV和CpG 2006寡核苷酸（5-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3）的共刺激下进行限制性稀释培养。采用假病毒测定培养上清中中和抗体的效价，根据中和抗体效价，筛选出分泌中和抗体的B细胞克隆，然后进行扩增培养，收集上清进行抗原表位分析。3） 重叠序列的HA抗原的真核表达及其在中和抗体抗原结合表位分析中的应用依据我们获得的H5N1分离株（Shenzhen/406H/06）全基因序列设计引物，采用RTPCR获得全长HA基因，将HA基因克隆在T载体上。进一步按截断蛋白序列要求构建真核表达载体，转染真核细胞进行瞬时表达。以表达重叠序列的H5HA的细胞和/或纯化的HA抗原，与系列稀释的B细胞克隆培养上清或免疫血清反应，再与酶标的抗人IgG孵育，检测上清/单克隆抗体/恢复期血清中和抗体与不同序列的HA的反应性，从而初步将抗体的抗原结合表位进行定位。截断蛋白的设计主要依据HA功能和结构特点、糖基化位点分布情况。我们先将HA分为HA1和HA2，由于HA1是病毒与受体结合区域，是中和抗体的重要作用位点，我们将受体结合区域130aa-230aa区段表达，其中190螺旋，130s环和220s环及其附件序列将重点分析。在此基础上，结合对HA蛋白序列的生物信息分析，尤其是糖基化位点分布，设计表达重叠序列的重组蛋白。以这些重组的HA蛋白为抗原，通过测定各单克隆抗体与不同区段的HA蛋白的结合反应，初步定位各单克隆抗体抗原结合表位的分布情况。我们将依据与抗体结合截断蛋白的序列，设计合成重叠序列的短肽，进一步对单克隆抗体的线性抗原结合表位进行确定。4） 中和抗体的体内抗H5N1禽流感病毒的实验研究46周龄的Balb/C小鼠，采用鼻腔内感染途径感染30L的H5N1病毒（Shenzhen/406H/06）， 感染后24小时，腹腔注射不同剂量的单克隆抗体（50g ，200g），对照组注射无中和作用无交叉反应的抗体，观察小鼠的体重改变和生存情况。考虑到病毒变异因素和对交叉免疫保护的研究，除了观察中和抗体对Shenzhen/406H/06的体内抗病毒作用外，我们还将比较中和抗体对香港分离株A/hongkong/213/03的作用。5） 恢复期血清治疗H5N1感染的临床研究和H5N1禽流感感染者中和抗体谱及其滴度的分析采用3）建立的中和抗体结合表位分析的抗原系统检测供者和受者血清中的中和抗体种类及其滴度，比较两者抗体谱的差别。对接受治疗的禽流感患者不同时间点（恢复期血清输注前及输注后不同时间）的血清标本中和抗体谱的进行测定，分析接受被动免疫治疗后的血清中和抗体滴度。通过与各中和抗体的IC50比较，获得中和抗体体内抗病毒治疗效果的实验室依据。通过分析供者恢复期血清中和抗体的滴度与治疗效果的关系（治疗后病毒载量和临床症状的变化），为禽流感免疫血清治疗提供指导意见。技术线路：H5N1禽流感假病毒的构建和制备H5N1禽流感假病毒的测定中和抗体方法建立和优化重叠序列H5HA重组蛋白的表达改良的EBV转化技术筛选分泌中和抗体的B细胞克隆B细胞克隆分泌的中和抗体的抗原结合表位的分析确定H5N1禽流感感染者恢复期血清中和抗体谱及滴度测定B细胞克隆分泌的中和抗体的抗原结合表位的初步定位采集分离H5N1禽流感康复者外周血PBMC采用MACS CD22磁珠分选和FACS负分选技术，分选IgG+ B细胞H5N1禽流感病毒RNA抽提及HA，NA基因的克隆H5N1禽流感病毒重叠序列多肽的合成单克隆抗体（或克隆B细胞上清）体内抗病毒效果的研究恢复期血清治疗人禽流感的抗病毒效果可行性分析：1) 尽管目前还没有从人体筛选克隆分泌H5N1禽流感病毒中和抗体的报道。但采用项目相同技术从SARS康复者B细胞中克隆筛选抗S蛋白的中和抗体已有成功的报道。本项目的合作者中国科学院上海健康科学研究所是本项成熟技术的提供者,他们采用该项技术筛选克隆了T细胞疫苗免疫后产生的抗独特型抗体（参见文献Hong J， J. Immunol, 2000，165.68566864）。因此，从技术可以保障。2) 本项目的另一关键技术是H5N1禽流感假病毒的制备及其测定中和抗体的方法的建立。目前，项目的合作者中科院上海巴斯德研究所，已经建立从不同病人分离的H5N1病毒HA/NA基因的假病毒，以假病毒测定中和抗体的方法也已经建立，并对接受H5HA基因疫苗免疫的小鼠血清中和抗体进行测定。具体在本项目中，我们只需要将原来构建的假病毒的HA和NA置换成深圳株的HA和NA基因即可。因此，这一技术也得到很好的解决。3) 在征得患者的同意下，我们已经获得了H5N1康复者的PBMCs和血清，而且还可以继续从他们采集全血标本，因此，可以保证本项目的关键标本的来源。此外，从SARS患者的随访研究中发现，尽管随着病后时间的延长，抗体谱可能缩减，但中和抗体的B细胞克隆却相对稳定。这使得比较恢复期血浆治疗的供者和受者的中和抗体谱不会因为时间的差别而产生太大的影响。4) 本项目需要的H5N1禽流感病毒株（包括深圳分离株和香港株），我们已经获得。5) 本项目中病毒中和试验和动物实验需要的生物安全三级实验室已经落实。项目依托单位与香港大学微生物系是长期合作的单位，早期中和试验和病毒分离就是在香港大学完成的。与香港大学微生物系的合作可以保障本试验要求的硬件设施（见附件协议）。6) 项目依托单位，广东医学院附属深圳市第三人民医院在2006年采用恢复期血浆治疗成功的救治了1例重症H5N1感染者，通过实时动态观察血浆治疗前后的病毒载量的变化，显示恢复期血浆具有显著的体内中和病毒作用。医院是全市人禽流感收治的唯一指定单位，更重要的是医院的各项设施、技术平台（病毒载量、免疫学指标检测等）、人员配置能够满足开展免疫血清治疗H5N1禽流感的的临床试验和实验研究。4. 本项目的特色与创新之处1） 本项目首次对H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位进行分析研究，目前国内外还没有相似的报道。这些信息对人禽流感的防治至关重要。2） 本项目采用改良EBV转化技术直接从接受恢复期血浆治疗的H5N1患者及血浆提供者记忆型B细胞群中克隆、筛选分泌中和抗体的B细胞克隆。该技术需时短，而且能最大限度的保证阳性克隆得率，所获得的单克隆抗体是H5N1禽流感病毒自然感染诱导产生结果。3） 本项目采用构建制备的H5N1禽流感假病毒替代微量中和试验测定中和抗体测定，用于克隆筛选。假病毒的使用克服了H5N1禽流感病毒高致病性带来的缺点，而且还可以通过对H5基因的基因突变，对抗原结合表位进行深入分析。4） 本项目对H5N1禽流感患者恢复期血清中和抗体谱及其滴度测定，在国内外属于首次，抗体谱的信息既是H5N1禽流感被动免疫治疗的实验室依据，同时也是评价疫苗免疫诱导中和抗体产生效果的重要参照。5） 项目完成获得的分泌中和抗体的B细胞克隆，是制备中和抗体的重要物质基础，与从动物免疫血清或鼠源性抗体比较，这些抗体无需复杂的人源化过程。目前还没有从H5N1感染者或疫苗免疫者分离制备单克隆抗体的报道。5. 年度计划与预期研究结果 2008.012008.12H5N1禽流感假病毒的构建和制备及其假病毒测定中和抗体的方法的建立从H5N1禽流感康复者外周血B细胞中，克隆、筛选分泌中和抗体的B细胞克隆2009.012009.12重叠序列的HA截断蛋白的真核表达载体构建及其在真核细胞中的表达，B细胞克隆分泌的中和抗体的抗原结合表位的分析及中和效价的测定2010.012010.12克隆B细胞分泌的中和抗体的体内抗病毒治疗效果（动物试验），H5N1禽流感恢复期血清中和抗体谱及其抗体滴度的测定，免疫血清中和抗体滴度和剂量与体内抗病毒治疗效果的临床研究预期结果：1） 制备出H5N1禽流感假病毒，建立以假病毒为基础的测定中和抗体的方法。2） 明确H5N1禽流感中和抗体的抗原结合表位，对于线性表位可以明确具体的氨基酸序列，对于结构性表位可以明确结合位点的组成及其关键氨基酸序列。3） 获得分泌中和抗体的B细胞克隆及其中和抗体的体内外中和病毒效价的参数。4） 明了H5N1禽流感恢复期血清中和抗体谱，获得免疫血清治疗的效果及其影响因素第一手资料。二、研究基础和工作条件 （一）工作基础：a) 恢复期血清治疗人禽流感的临床观察。2006年6月，采用恢复期血浆治疗H5N1禽流感重症肺炎1例，取得成功。以从患者分离的H5N1禽流感病毒株进行微量中和试验，测定治疗前后的血清中和抗体的效价，发现输注后中和抗体上升至1：80，并持续至观察的两周时间（图1）。 在输注血浆后32小时内，病毒载量从3.94 log copies/mL降至低于检测下限水平，下降近10，000倍。连续监测病毒载量显示患者体内病毒量已得到有效的控制和清除（图2）。伴随病毒的清除，临床症状有显著改善。相关结果发表在中华传染病杂志，2007，25(1):2934，和 Zhou B, Zhong N， Guan Y. Convalescent Plasma Therapy of Influenza A (H5N1) Infection, N Engl J Med, 2007, Revision submitted.(修稿中)图1 血清（浆）治疗前后患者血清中和抗体效价图2.恢复期血浆治疗后气管分泌物中病毒载量的变化b) 与香港大学微生物系合作，分离培养了H5N1病毒，并对病毒的全基因进行序列测定，对HA基因