RT-PCR-步骤(精).doc

一、组织抽提：1. 取组织块50-100用液氮在研钵中研磨成粉末2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4. 冰上5分钟5. 离心12,000g 4 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管6. 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上5分钟7. 离心12,000g 4 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管8. 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9. 离心12,000g 4 5分钟 弃去上清液10. 加入1 ml 75%乙醇，震荡11. 离心100mg时分装1ml/每EP管） 颠倒混匀10下，室温5分钟 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） 颠倒混匀10下，室温5分钟 4，离心12000g，15分钟 转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP管中 加等体积异丙醇（约400l），混匀室温10分钟 4，离心12000g，10分钟 弃上清 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml 4离心7500g，5分钟 弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥） 溶于DEPC水中至20l（10l-20l） （可在55-60水中，10分钟助溶） 注： 1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解 2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60放置至少一个月（甚至可一年以上） 3、RNA在75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年 两步法RT-PCR （第一步：逆转录反应） 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23l(11.5l) Oligo(dT)15 0.05g/l 4l(2l) 0.005g/l （稀释10倍后用） 混匀，离心，70 5min 立即冰水浴，稍离心 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5 8l (4l) 1 dNTP 10mM 2l (1l) 0.5mM RNasin 40U/l 1l (0.5l) 20 M-MLV 200U/l 2l (1l) 200U 总体积40l（20l） 混匀，离心，42 60min 95 10min（破坏MLV） 4保存 两步法RT-PCR （第二步：PCR反应） 总体积20l(50l) 试剂 浓度 体积 终浓度 Taq Buffer 10 2l (5l_) 1 MgCl2 25mM 1.2l (3l) 1.5mM dNTP 10mM 0.2l (0.5l) 200uM 上游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmol 下游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmol cDNA模板 X (?) (1-10l) DEPC水 20l-4.3l-XTaq酶 2.5U/l 0.3l (1l) 2.5U/l 混匀 97，5分钟 立即冰水浴 混匀 95 5分 预变性 94 30秒 变性 X 40秒 退火 72 30秒 延伸 72 7分 终末延伸 28-36循环，4保温 三、电泳： 加1-10l PCR产物 溴芬兰（1-2.5l）混匀，加样，电泳。 注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20保存，操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 4. 12000g，4 离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20，30min。7. 12000g，4 离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75乙醇1ml，振荡。9. 7500g，4 离心，10min。10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥510min。11. 沉淀溶于20l DEPC水，取1l加入79l DEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，70保存。 OD26040稀释倍数RNA浓度（g/l） 1000逆转录合成 cDNA 反应体系如下 MgCl2 2l 10RT Buffer 1l RNase Free dH2O 3.75ldNTP Mixture(各10mM) 1l RNase Inhibitor 0.25l AMV Reverse Transcriptase 0.5l Random 9 mers 0.5l Positive Control RNA (1g) 1l混匀快速离心一次反应条件如下 30 10min 42 30min 99 5min 5 5min -20 冰箱冻存 PCR反应摸板cDNA 2.5l5PCR Buffer 2.5l灭菌蒸馏水 7.2l聚合酶 Ex Taq HS 0.1l上游引物 0.1l下游引物 0.1lTotal 12.5l混匀快速离心一次反应条件 94 2min 1Cycle 94 40sec 50-65 40sec 25-35Cycles