治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究.doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页同行评议组别临床内科学项目编号Y205677浙江省自然科学基金申 请 书申报类别:一般项目项目名称:治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究申 请 者:宋欣伟电 话托单位:浙江省中医院通信地址:杭州市邮电路54号 邮政编码:310006E-mail :申报日期:2005-5-26浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息申请者信息姓 名宋欣伟性别男出生日期1962年12月28日最终学位硕士获学位年份1991职称主任医师主要研究领域风湿免疫学科E-电 人网页-依托单位浙江省中医院证件类型身份证证件号请者是否近三年调入在浙单位工作否调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: 项目基本信息项目名称治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究申报类别一般项目研究属性纯基础研究同行评议组别医药科学/临床内科学依托基地名称 预计研究年限2006年01月2007年12月总经费预算10.0万元申请经费10.0万元项目研究目标、内容和意义简介(限400字) TNF-和IL-1是类风湿性关节炎发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子，针对IL-1和TNF-及其抑制剂的新疗法研究目前仍处于摸索阶段。本研究建立佐剂性关节炎大鼠模型，将有效抗风湿中药成分组方，予灌胃治疗，不同时期检测模型鼠中血清及滑膜组织细胞上清液中IL-1和TNF-水平，明确：1.类风关中局部组织中TNF-和IL-1对关节的破坏可能居于更重要作用；2.有效中药成分组方对大鼠佐剂性关节炎模型中血清及滑膜细胞培养上清液中TNF-和IL-1的作用及不同剂量中药成分组方治疗类风关模型鼠的最佳配伍方案。联合用药是目前治疗类风关的方向，具有多层次、多靶点疗效等优点。提高中医药治疗类风关疗效的关键，在目前来看可能在于如何将中药抗风湿有效成分进行有效整合。探索整合治疗类风关中药有效成分以提高类风关治疗效果，以及对类风湿性关节炎鼠细胞因子TNF-和IL-1关系研究国内外尚未见报道。 关键词（不超过4个）类风湿性关节炎；佐剂性关节炎；中药有效成分；细胞因子同行评议分组说明免疫性疾病 重点资助方向重要疾病机理及防治研究申请书版本号：80278651 项目组主要成员编号姓名出生日期性别职称学位单位名称电话项目分工每年工作时间（月）（(月)1宋欣伟1962年12月28日男主任医师硕士浙江省中医责人102钱松洋1957.06.08男主任药师学士浙江省中医物制剂63戴巧定1977.11.23女医师硕士浙江省中医验104杨午鸣1950.10.12男教授博士浙江中医学验85寿旗杨1980.05.06男助教学士浙江中医学物实验96李涯松1969.12.08男副主任医师博士浙江省中医验67关天容1976.12.26女医师学士浙江省中医验6总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数74030001说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第16页个人介绍：宋欣伟： 宋欣伟，男，41岁，内科副主任中医师，浙江省中医院风湿免疫科主任，中国实用医学杂志特约编委，浙江省中西医结合急救专业委员会委员，硕士生导师。1991年7月毕业于南京中医药大学中医系，获医学硕士学位，之后分配在浙江中医学院附属医院工作。1992年任主治中医师，1997年任副主任中医师，1998年任浙江省中医院急诊科副主任，2004年主持风湿免疫科工作。主要研究方向为内科风湿免疫病学。已在全国及省级杂志发表学术论文20余篇。部分内容如下：一论著：中西医结合内科急诊学 副主编 上海科技文献出版社 1998年二论文：1宋欣伟.仲景利尿除痹法浅识，辽宁中医杂志 1992年4期（二级杂志 第一作者）2救脱1号对家兔休克模型的作用 南京中医学院学报 1992：8（1）（二级杂志 第三作者）3“救脱1号”注射液对麻醉兔心功能和血液动力学的作用 南京中医学院学报 1992：8（2）（二级杂志 第二作者）4宋欣伟.干燥综合症继发急性弥漫性血管内凝血一例 浙江中医学院学报 1994年2期（二级杂志 第一作者）5山地颗粒剂治疗胸痹心悸30例体会 中国医学研究与临床实践 北京科学技术出版社 1998年151页 第一作者6宋欣伟.参附注射液治疗重度椎基底动脉缺血性眩晕的临床观察 中国中医急症 2001年3期 （一级杂志 第一作者） 7宋欣伟 . 参附注射液治疗重度椎基底动脉缺血性眩晕的疗效观察，中国中医药科技 2000年4期 （一级杂志 第一作者）8宋欣伟 . 参附注射液对65例急性重度疼痛镇痛作用的观察，中国中西医结合杂志2001年4期 （一级杂志 第一作者）9宋欣伟 . 大剂量参附注射液辅助治疗肝硬化食道曲张静脉破裂出血的临床观察，中国中西医结合杂志2002年3期 （一级杂志 第一作者）10心至宝注射液对大鼠急性心力衰竭、心源性休克作用的实验研究，中医药学刊 2005年7期（一级杂志 第一作者）（待发）三.“心至宝注射液对心力衰竭、心源性休克作用的研究”课题获：1）浙江省科技进步奖三等奖（第一作者）2）浙江省中医药科技成果奖二等奖（第一作者）四.干燥综合征患者性激素水平与Th1/Th2漂移的相关性及二仙汤干预作用的研究省中医药管理局 05年01月06年12月 申请经费预算 10.0 万元 计划开支项目名称计算根据及理由金额（万元）1信息费资料查询及资料打印、复印等 0.52专题学术活动费调研，出差1.03仪器和设备购置费主要仪器如超声波细胞粉碎仪、CO2衡温培养箱等租用费3.04能源材料费Wistar大鼠 、弗氏佐剂配制、-、-1、INF-检测试剂盒、中药有效成分等5.05计划管理费按课题管理费50.56人员费 0.0注：开支范围和标准参见浙江省省级科技项目经费管理暂行办法（浙财教字200220号）。 申请者承诺：我保证： （1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章 日期 .申请书正文一、 一般项目、重点项目和重大项目申请书正文报告撰写提纲重要说明：（1） 要求分栏目撰写，条目清晰，标题突出。提纲的斜体字部分撰写后应删除；（2） 正文报告必须附主要参考文献目录；（3） 报告篇幅建议不超过8000字；（4） 报告中不得透露申请者姓名、工作单位及相关信息治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究1、 项目研究意义类风湿性关节炎是一种发病率高、具有高度致残性、严重影响患者生活质量的自身免疫性疾病。如何有效治疗类风关、降低致残率、改善患者生活质量仍是当前中西医学界亟待攻破的难题之一。大量研究表明，细胞因子TNF-和IL-1在类风关发病中具有重要意义，研究和开发针对TNF-和IL-1的抑制剂、筛选有效的治疗类风关的活性成分、寻找理想的治疗类风关药物或有效药物配合使用，始终是医药界的重大课题。一、 细胞因子TNF-和IL-1在类风湿性关节炎发病和治疗中占有重要位置细胞因子是一组存在于细胞外的小分子多肽，是炎症、感染和免疫性疾病的重要介质。它包括主要由单核/巨噬细胞产生的炎性单核因子肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1、IL-6、和IL-8等，以及由淋巴细胞产生的IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IFN等。已知单核因子在类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis,RA)的急性滑膜炎症，滑膜纤维化，骨和软骨破坏中起重要作用。其中IL-1（尤其是IL-1）和TNF-在RA发病机制及治疗中起主导地位。TNF-和IL-1（尤其是IL-1）在RA发病机制中起主导地位。TNF-与IL-1均由单核/巨噬细胞产生，许多研究证实RA患者外周血单核细胞（PBMC）和关节滑膜液的巨噬细胞（SFMC）能分泌IL-1和TNF-，使外周血和关节滑液IL-1、TNF-增高。1987年Danis等用生物学方法测定RA的PBMC和SFMC分泌的IL-1，均较正常对照和非RA组明显增多。1988年Nobuywki测定滑膜培养上清液中IL-1活性，这种活性只存在于RA的滑膜中而不存在于非RA滑膜，且RA滑膜中IL-1的增高与关节镜下炎症所见、与免疫组化所测得HLA-DR表现、与X线关节破坏有较好的一致性。目前较一致的认识是TNF-与IL-1主要参与：(1)激活血管内皮细胞、增加内皮细胞粘附分子表达、使中性粒细胞在滑膜腔内集聚；（2）刺激滑膜细胞和中性粒细胞产生前列腺素等炎性介质；（3）刺激软骨细胞和破骨细胞减少蛋白合成、增加糖蛋白降解，并产生胶原酶及其他中性蛋白酸类，释放骨钙等，从而导致RA滑膜、软骨与软骨下骨的破坏，并与RA的发热、贫血、急性期反应蛋白合成等密切相关，因而，TNF-与IL-1在RA发病机制中起主导地位。TNF-与IL-1是RA的有效治疗目标。TNF-成为有效的RA治疗目标的证据主要有三个方面：(1)类风湿性滑膜细胞离体培养试验中，加入抗TNF抗体(抗-TNF)能使培养物中IL-1的生物活性降低，后来发现滑膜中GM-CSF、IL-6、IL-8水平也降低，表明TNF阻断能使其他促炎因子的生成减少；(2)用抗体或TNF受体(TNFR)-Fc融合蛋白来抑制TNF-，对型胶原诱导的关节炎模型动物有明显益处，即使在疾病发作后再开始治疗，多数情况下效果也很显著；(3)免疫组织学方法证实，受LPS刺激后，新冷冻组织中TNF及其受体的表达上调，说明TNF与其受体间的相互作用在体内非常重要，进一步表明TNF可能是很好的RA治疗目标。IL-1则对关节软骨损伤有更密切的关系。曾经有人认为阻断IL-1对控制关节损伤至关重要，因为体内外试验发现IL-1比TNF更容易引起软骨和骨损伤。IL-1对炎性部位的持续性细胞浸润和诱导组织破坏起着更直接的作用，是骨质吸收和骨质破坏的主要细胞因子之一。这一结论目前已广为接受。此外，TNF-和IL-1在许多系统中具有协同作用，有研究表明，一方面IL-1产生过多必促进TNF-产生过多，另一方面TNF减少不仅会减少关节内的IL-1生成，而且会减轻TNF和IL-1的协同效应。在体外向RA滑膜细胞添加抗-TNF可减少IL-1的合成，在抗类风关新药Infliximab、D2E7的体内试验中亦可得到同样的证据。二、 加强对治疗类风关中药有效成分整合的研究是提高类风关治疗效果的希望所在类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病，传统抗炎药物疗效有限，难以治愈，是当今医学研究领域的热点之一。因此，筛选有效的治疗RA活性成分、寻找理想的治疗RA药物或有效药物配合使用，始终是医药界的重大课题。毋用否认，中医药治疗类风湿性关节炎有悠久的历史，具有良好而确实的疗效，在群众中享有较高的信誉。近几十年来，中医药在治疗类风关方面进行了深入的研究，对类风关确有疗效的一批有效中药成分已被研究清楚，如雷公藤多甙、祖师麻甲素、汉防己甲素、乌头生物碱、青枫藤碱、白芍总甙等，而且一部分已被制成新的制剂、作为新药在临床上使用，并取得了一定成效。但总体而言，与现代医学治疗效果近似，中医药的疗效仍不能较完满地满足类风关治疗的需要，即使是目前在临床上应用最广泛、公认为疗效最显著的雷公藤多甙，综合各家文献报道，其临床治疗显效率亦仅50左右，且存在性腺抑制、血液系统、肝功能损害等副作用，因此尚期待中医药治疗有进一步突破性提高。由于类风关病情复杂多变，目前现代医学认为任何一种药物都不能阻止其对骨质的破坏，对其治疗采用联合用药可以提高疗效。滑膜组织的过度增生和免疫细胞的功能紊乱是积极联合治疗的理论基础，当今医学大量研究结果显示，单用甲氨蝶呤不能认为是治疗RA的金标准，即使在早期积极使用甲氨蝶呤，其单独使用的临床效果也无法与联合治疗效果相比。对甲氨蝶呤单一给药与联合给药治疗早期RA患者的结果进行比较，除X线进展在两种药物联合治疗组与三种药物联合治疗组未显示差异有显著性外，其余结果均显示差异有显著性，提示联合治疗优于单一用药。另外，联合治疗往往可以避免单一药物治疗过程中常常发生药物抵抗现象，如研究显示环孢素和羟氯喹联合使用可以竞争性地抑制耐药基因以及基因产物的产生，从而在药代动力学方面阐述了联合治疗效果优于单一药物的机制。多数学者在治疗类风关临床实践中，认识到早期积极给予联合治疗，即所谓的“下台阶”治疗策略可以明显提高疗效。总之，联合治疗是RA 治疗的一个亮点，其精髓是利用药物的不同药理作用或作用部位以增加疗效，或分别用较小剂量以减少副作用，希望通过联合用药以诱导缓解，然后逐渐减少药物的种类和药物剂量，最后选取副作用较少而有效的药物长期维持。 借鉴现代医学的研究方法、结果，我们认为寄希望于开发出卓有成效的中药新的有效成分和制剂可能是一种奢望，提高中医药治疗类风关疗效的关键，在目前来看可能在于如何有效地将中药抗风湿有效成分进行有效整合。就象著名的艾滋病治疗的“鸡尾酒疗法”一样，将目前治疗类风关有效的几种或更多中药有效成分加以整合，通过整合提高疗效，通过整合出新效果。具体而言有三：1.类风关的中西医结合研究已经历漫长道路，药物研究不断深入，单一的药物有效成分正不断被发现、提取，而这确实能够提高治疗疗效；2.现代医学已从单一药物治疗向联合用药治疗发展。认为单一用药易于产生耐药性，药物作用靶点单一，往往副作用明显，而联合用药并不一定增加药物副作用，而且药物作用靶点丰富、不易产生耐药性。依照如此思路，我们认为有必要按照中医学方剂的配伍原则，对相关中药有效成分进行进一步整合，以提高临床治疗效果。3.治疗类风湿关节炎有效的中药成分较西药有一定的优势，如副作用较小，复方药物有多层次、多靶点疗效等特点。若能吸取前人治疗经验，并应用科学研究方法把从中筛选出的对滑膜细胞有抑制作用的有效药物成分进一步整合，则对类风湿关节炎的治疗将会起到巨大的推动作用。4. 由于中药作用的特殊性，较之西药的二、三联用药，中药可能需要更多的有效成分组合使用，并按照中药方剂的君、臣、佐、使原则配伍，方能达到较理想的目的。总之，TNF-和IL-1是类风湿性关节炎发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子，针对IL-1和TNF-及其抑制剂的新疗法研究目前仍处于摸索阶段。探索整合治疗类风关中药有效成分以提高类风关治疗效果，以及对类风湿性关节炎鼠细胞因子TNF和IL-1关系研究尚少报道，本课题希望能从这一方面进行一些探索，若能向前前进一步，将有助于类风关治疗效果的提高。2、 项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系；本项目研究目标：明确在类风关中局部组织中TNF-和IL-1对关节的破坏可能居于更重要作用；有效中药成分组方对大鼠佐剂性关节炎模型中血清及滑膜细胞培养上清液中细胞因子TNF-和IL-1的作用及不同剂量中药成分组方治疗类风关模型鼠的最佳配伍方案。本课题申请者长期致力于风湿性疾病的基础和临床研究，该课题是有关于治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究，是申请者长期研究工作中的一个主要子课题。3、项目研究内容，研究方案和进度安排1实验材料1.1动物选择：选择Wistar大鼠，雌性，68周龄，170200g，清洁级，由浙江中医学院实验动物中心提供。1.2主要试药不完全弗氏佐剂，Sigma公司。冻干注射用灭毒卡介苗(BCG)，50mg/瓶，上海生物制品研究所。小牛血清：美国Hyclone公司，临床用前56，30min灭活补体活性。完全培养液：低糖DMEM培养粉，Hyclone公司。加入25mmol/L Hpes，1mol/L丙酮酸钠，20mmol/L L-谷氨酰胺，50mmol/L二硫基乙醇，青霉钠100KU/L，硫酸链霉素100mg/L；并按说明书要求，加入碳酸氢钠3.7g/L。使用时加入小牛血清，浓度为15%，最后以1mol/L碳酸氢钠调节至pH7.27.4。 中药有效成分乌头碱、青藤碱、马钱子碱、商陆皂甙、山茱萸多甙、汉防己甲素、祖师麻甲素市售或浙江中医学院中药系提供。雷公藤多甙片，市售。检测试剂盒：-、-1、INF-检测试剂盒，均购自北京邦定生物医学公司。1.3主要仪器体积测量仪（自制）；MicromSeriesSA-300V高压灭菌器；KS-250超声波细胞粉碎仪；超静工作台，SW-GJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司产品；CO2衡温培养箱，HWO301T-VBA型，美国HARRIS公司产品；常温低速离心机，LDFZ4-OB型，上海医用离心机厂；倒置相差显微镜，DMIRB型，德国LEICA公司产品；计数仪，BECKHAN DP5500型；80度低温冰箱2实验方法21 大鼠佐剂性关节炎模型的建立： RA的动物模型有多种，弗氏完全佐剂(FCA)诱导的大鼠佐剂性关节炎(AdjuvantArthritis,AA)是最为经典、最为常用的RA实验模型。弗氏完全佐剂是一种在弗氏不完全佐剂(FIA),基础上，加入灭活卡介苗溶液(BCG)制成W/O乳剂，采取皮内注射，目的是为延缓机体对BCG的吸收，造成BCG对机体的不断刺激而产生继发的自身免疫应答反应。其原理为BCG作为抗原进入机体使T细胞致敏(称急性炎症反应)，当再次接触抗原，致敏T细胞分化增殖，释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞，引起单核细胞浸润，同时由抗原抗体形成的免疫复合物激活补体，导致白细胞趋化激活，释放一系列致炎因子产生局部和全身性炎症反应(称继发反应)。我们通过改良后（增加佐剂浓度）解决了这一模型在具体操作中存在的造模成功率低、病变程度个体差异大等一系列问题。211弗氏完全佐剂的制备取不完全弗氏佐剂和冻干注射用灭毒卡介苗(BCG)，BCG用少量注射用水溶解，与FIA混匀，用一次性注射器乳化10min，配成含BCG10mg/ml的W/O完全弗氏佐剂，备用。212AA大鼠模型的制备原发病变属急性应激反应，表现为致炎侧的关节、足跖红肿，致敏后即可出现，1824h达峰值，持续5d后逐渐减轻；继发病变属自身免疫应答反应，表现为造模89d后再度出现的致炎侧、非致炎侧(对侧)及双前肢的关节和足跖肿胀，耳、尾“关节炎”结节，变应性角膜翳以及体重下降等。具体操作步骤：对所选择雌性90只Wistar大鼠，第一天于左后脚底区注射0.1ml完全弗氏佐剂。注射的第一天，记录大鼠体重和两侧脚掌的体积，代表这一时期的原发病变和治疗性药物作用前情况，随后用体积描记器测量非注射脚掌的体积（继发性病变），代表诱导的佐剂性疾病的严重程度。第21天，再次称重，继发性病变的严重程度通过观察和根据下列程序分级来评价。正常对照组注射0.1ml 生理盐水。耳朵：无小结、不红评分为0，有小结、红评分为1；鼻：结缔组织不肿胀评分为0，结缔组织严重肿胀评分为1；尾：无小结评分为0，有小结评分为1；前爪：无炎症评分为0，至少一个关节有炎症评分为1；后爪：无炎症评分为0，轻度炎症评分为，中度炎症评分为2，严重炎症评分为3。注：1.原发性病变：在第5天测定被注射脚掌体积，并与溶剂对照组比较计算抑制百分率。2.继发性病变：在第21天测定非注射侧脚掌体积，并与溶剂对照组比较计算抑制的百分率。3.据上述积分数计算每只动物的关节炎指数，处理组的平均值与对照组的平均值比较。4.如下相加计算总变化的百分比：第5天被注射侧脚掌抑制的百分比第21天非注射侧脚掌抑制的百分比关节炎指数的百分比.213成功率评判指标继发反应达峰值时(一般在第15d左右)，分别对各组大鼠按上述分级进行逐一测量和目测评分，结果采用“双样本异方差t-检验”分析方法，组间均需有非常显著差异(P0.01)。无非常显著差异或只出现前足、耳、尾继发反应，均属淘汰范围。 22 中药有效成份组方及实验分组、给药：221中药有效成份组方 中药有效成份组方（以下简称组方）：根据文献资料，选择对类风关细胞因子、滑膜细胞等具有抑制作用的中药有效成份（其中部分有效成分已是上市药品的主要成分）组方。与之相应的中药材（如有效成分青藤碱的相应中药材为青枫藤）已经组方在本院使用，已对相应中药进行了临床筛选，初步证实疗效的确定性。组方由乌头碱、青藤碱、马钱子碱、商陆皂甙、山茱萸多甙、汉防己甲素、祖师麻甲素组成。222 实验分组、给药 将大鼠佐剂性关节炎模型造模成功后的148只大鼠分为：(1)对照组30只；(2)阳性药物对照组20只；(3) 实验组256只：以组方中的七种味药物有效成分为因素，每个因素设高剂量、低剂量两个水平，依L8（27）正交设计表进行实验。低剂量组给药量相当于临床用药的等效剂量，高剂量组为低剂量组的2倍。对照组给予等体积的蒸馏水；阳性药物对照组灌胃给予雷公藤多甙12-1-1(临床用量为70-1-1)，实验组给予按正交试验设计的组方，均于致炎当天给药，连续8W。3血清细胞因子的检测：于大鼠致炎后0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、56等不同时期，进行病情观察，累计关节炎指数。对照组于实验第0d、28、56d，阳性药物对照组于实验第28、56d，分别将大鼠断头取血，每次10只大鼠；实验组于实验第28 d、56d，分别将大鼠断头取血，每次148只大鼠。大鼠断头取血后分离血清，0.45滤膜过滤除菌，-20保存，待测细胞因子。采用酶标法测定技术，按照试剂盒说明书要求测定细胞因子TNF-、IL-1、INF-的水平。4大鼠滑膜细胞培养上清的制备4.1 滑膜组织的获取于致炎后第28、56d，断头处死大鼠，使血流尽。浸泡于10%强力消毒净溶液中10min，移入超静工作台，仰位固定，常规碘酒、酒精消毒。沿膝关节正中纵形切开皮肤直至暴露出膝关节为中心约33cm2的区域，以有齿镊提起髌骨，沿髌骨上沿约0.30.4cm处向下切割直至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了膝关节腔，可见有髌骨下级向上延续有一层平滑光亮成淡黄色的滑膜组织。完整剥离滑膜组织（注意避免混杂关节囊的纤维层），最后以眼科镊轻轻夹往其游离端，用刀片完整切下。同法采集另一侧膝关节滑膜组织，每一大鼠可采集双侧滑膜组织约15mg20mg。4.2 滑膜细胞培养上清的制备按文献方法略作改进，用D-hanks缓冲液洗涤大鼠滑膜组织3次，用眼科剪剪成约23mm3的小块，加入含15%小牛血清的DMEM完全培养液1mL和0.2%胶原酶1mL(使胶原酶中浓度为0.1%)，移入25%培养瓶，在37，5%CO2培养箱中消化2.5h后，反复吹打，将未粘附的细胞移入离心管中，1000r/min离心10min，弃上清液，加入0.25%胰蛋白酶4mL，移入25cm2培养瓶中，在37、5% CO2培养箱中消化30min，去上清。分离的滑膜细胞经无D-hanks缓冲液冲洗3次，重悬于含小牛血清15%的DMEM培养液中(内含55mg/L LPS)。台盼蓝排斥实验检测其活力大于95%，Giemsa染色，高倍镜下计数300个细胞，其纯度为95%。根据所测的细胞浓度，再用上述DEME配制成滑膜细胞悬液(5105/L),加入24孔培养板内，每孔1mL，于37、5% CO2培养箱中培养48h,800r/min离心10min，收集上清，经0.22m微孔滤膜过滤，滤过液-40保存，待测TNF-、IL-1、INF-水平。5 滑膜取材及病理观察：于灌胃后4W(每组10只)、8W(每组10只)和12W(每组10只)分别处死动物，对类风湿性关节炎动物模型组取踝关节，于10%中性Formalin 中固定，经脱钙包埋，制成厚度为5的石蜡切片，并应用组织学HE染色和组织化学甲苯胺兰染色，由专人观察各组标本病理。 6 统计学处理：用SPSS10.0统计软件包对实验数据进行统计学处理，两样本均数之间的差异显著性用独立样本均值比较的t检验，应用方差分析对变量之间的相互关系进行检验。P0.05为差异有统计学意义。进度：2006.12006.12 进行预实验，动物造模，给药，检测细胞因子2007.12007.12 继续实验，病理观察，数据统计，完成论文4、项目创新之处TNF-和IL-1是类风湿性关节炎发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子，针对IL-1和TNF-及其抑制剂的新疗法研究目前仍处于摸索阶段。联合用药是目前治疗类风关的方向，具有多层次、多靶点疗效等优点。提高中医药治疗类风关疗效的关键，在目前来看可能在于如何将中药抗风湿有效成分进行有效整合。有效整合就是联合用药，整体可以大于局部。探索整合治疗类风关中药有效成分以提高类风关治疗效果，以及对类风湿性关节炎鼠细胞因子TNF-和IL-1关系研究国内外尚未见报道。创新之处主要体现以下几点：1.与阳性药物雷公藤多甙比较，有效中药成分组方对类风关模型鼠的治疗效果；2.明确有效中药成分组方对大鼠佐剂性关节炎模型中血清及滑膜细胞培养上清液中细胞因子TNF-和IL-1的作用；3.不同剂量中药成分组方治疗类风关模型鼠的最佳配伍方案；4. 在类风关中局部组织中TNF-和IL-1对关节的破坏可能居于更重要作用。5、工作基础与工作条件1本课题组成员对大鼠佐剂关节炎造模进行深入研究，改良后的方法（增加佐剂浓度）解决了这一模型在具体操作中存在的造模成功率低、病变程度个体差异大等一系列问题，相应论文已发表。2根据文献资料，选择了对类风关细胞因子、滑膜细胞等具有抑制作用的中药有效成份（其中部分有效成分已是上市药品的主要成分）进行组方研究，而与之相应的中药材（如有效成分青藤碱的相应中药材为青枫藤）早已经组方在本院使用，已对相应中药进行了临床筛选，初步证实疗效的确定性。3本研究组成员具有扎实的理论、科研基础、丰富的临床经验，造模技术成熟，实验所需试剂，材料，仪器等均具备。6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路本课题研究可为临床工作提供基础研究支持及指导，结果以论文形式发表；有效重要成分整合后可能对类风关治疗显示良好的疗效，可能形成一种新药。若能得到上述两种结果，可通过横向联系等方式进一步加深基础研究，包括发病机理研究和药理作用研究。7、参考文献1. Danis VA, Marchi LM, Nelson DS, et al. Interleukinl secretion by peripheral blook meonocytes and synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. JRheum, 1987;1