FQ-PCR步骤-20091216.doc

外源性金属硫蛋白对奶牛抗热应激机理的研究1、试验目的和意义金属硫蛋白是重要的生理活性物质，具广泛的生物学功能1,2,3，尤以清除自由基4、抗应激5和调控细胞凋亡作用6甚大，因而在促进动物健康养殖、提高畜产品质量安全等方面具广阔应用前景。热应激一直南方饲养奶牛业的一大难题，一般来说，奶牛具有耐寒怕热的生物学特性，环境温度超过15.6时就会影响奶牛的呼吸频率，超过21.1时，奶牛的直肠温度也将受影响，在严重的热应激条件下则出现热喘息，同时在奶牛泌乳过程中产热量大，从而影响其体热平衡，最终导致奶牛体温的升高，另外环境中湿度的增大会影响奶牛的蒸发散热，再加上高温的影响则会对奶牛造成极大的伤害。见表1表1 环境温度与黑白花牛产乳量的关系7环境温度（）10.015.421.126.729.432.235.037.840.6产乳量（）100.098.489.375.269.653.042.026.915.5湖南一年的气温中，大约在平均有8个月以上是处于20以上，相对湿度较高，一般在75左右。奶牛处于轻度热应激状态时间较长，这也是南方奶牛产量不高、效益不好的主要原因。南方的人口密度比北方要大，致使牛奶的供需矛盾很大。另外我省的耕地面积为0.9亩/人左右，而且多以水田为主，水田一年之中大约有6个月的时间为空闲期，这给种植牧草带来优厚的条件，尤其是豆科牧草的种植，如紫云英等。同时山林的面积较大，大约平均占0.11公顷/每人 ，这也就给我省草食动物的发展带来契机。近年来供肉食的草食动物养殖发展迅速，但奶业的发展却不足，故而要发展奶业，关键在于解决奶牛热应激的问题。通过控制环境的成本太高，育种周期又太长，远水解不了近渴。因此利用某种生物活性物质解决奶牛抗热应激是一种简便而有效的方法，根据这一特性的要求，金属硫蛋白具有抗应激的效果，它也就成为抗奶牛热应激的首选活性物质。这也就是本次试验要选择金属硫蛋白作为抗热应激活性物质的意义所在。金属硫蛋白（metallothionein，MT）的生物学功能探索已成为生命科学研究的热点，MT清除羟自由基、抗氧化、抗应激、提高机体免疫力的作用日益受到关注。 2、国内外研究进展2.1 热应激的概念早在1929年，美国生物学家cannon描述了动物的“战斗逃跑反应”，指出交感神经、肾上腺素分泌增多在这种反应中起着关键作用，这就是“应急学说”（emergency reaction hypothesis），1946年将这类“多种有害因素产生的综合征”反应归纳为“全身适应综合征”（general adaptation syndrome,GAS），并正式命名为“stress”，在物理学上的一个术语，我国刘士豪教授将其译为“应激”8。简而言之，应激就是指机体在受到各种内外环境刺激时所出现的非特异性全身反应（见图1）9，它是生物在长期的进化过程中获得的适应性和防御性反应。而引起应激的刺激因素则被称为应激原（stressor）。应激原的种类很多，大致可分为5类：物理性应激原，如高温、噪音、紫外线、缺氧等；化学性应激原，如CO、H2O2、臭氧、致畸剂、致癌剂、重金属等；生物性应激原，如病毒、细菌、寄生虫等；机体内的病理生理状态，如炎症、高热、缺血、高盐、低盐、高pH、低pH等；行为性应激原，如运输、断奶、去势、短喙、转群、疫苗注射等。应激根据应激原的不同分为多种，如热应激、冷应激、运输应激、断奶应激、去势应激等等，其中热应激在南方奶牛养殖中最为常见。图1 动物应激时的全身反应9机体对热应激原的非特异性防御应答反应是热应激最简单的定义，但这个定义不令人满意。实际上，恒温动物存在一个等热区或等温区（zone of thermoneutrality），在这个等热区内，机体可以借助物理调节作用来维持正常体温；另外，机体在等热区内还有一个舒适区（zone of thermal comfort），在舒适区内，机体的代谢产热刚好等于散热，不必借助物理调节而可以维持正常的体温。确切的热应激概念应该指环境温度超过等热区中的舒适区的上限温度所致的应激反应。一般认为，从舒适区的上限温度到等热区的上限温度，动物机体可以通过舒张外周血管、肢体伸展、被毛竖立、呼吸加快等物理调节方式来维持体温，对动物机能代谢和生产性能影响较小，为轻度热应激。但若超过等热区的上限温度，动物机体必须通过化学调节方式来减少产热量，引起一系列的内分泌变化。严重影响动物的机能代谢和生产性能。从实践角度考虑。热应激是指环境温度超过等热区上限温度的应激反应，这也就是人们通常所说的和人们所关注的内容。动物的等热区和舒适区是不一样的，所以不同动物的热应激含义也是不同的，见表2。表2 几种动物的等热区和舒适区10,11品种育肥猪小牛成年牛泌乳牛等热区8 23 10 24 9 21 ，025 舒适区15 23 10 20 10 20 10 20 注：等热区和舒适区受多种因素（年龄、体重、饲养水平等）影响，数值只是相对的2.2 热应激对神经内分泌的影响2.2.1 下丘脑垂体肾上腺（HPA）中枢图2 下丘脑垂体肾上腺轴的主要组成示意图8热应激原通过皮肤的热觉感受器触发神经冲动，经过一定的传入系统到达大脑皮层，再下传到下丘脑，引起植物神经系统的交感神经兴奋，产生一系列的反应。一方面，交感神经末梢直接释放去甲肾上腺素进入血液循环；另一方面，交感神经的兴奋，也导致了肾上腺髓质功能的加强，释放大量肾上腺素和去甲肾上腺素进入血液循环。机体出现心跳加快、呼吸加深加快、血糖和血压升高和瞳孔扩大等反应，通过这些变化来动员机体的潜在力量，以保持内环境的相对稳定。如果热应激原继续作用于机体，下丘脑垂体肾上腺皮质轴就会激活。下丘脑垂体肾上腺皮质轴激活及由此引起的糖皮质激素或糖皮质类固醇（GC）分泌增加，是应激最重要的特征8。这一反应的基本过程见图2。下丘脑室旁核（PVN）的神经元首先分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）；CRH再经过垂体门静脉系统到达垂体前叶，并刺激垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）；最后ACTH经血液循环到达肾上腺。刺激肾上腺皮质合成、分泌GC（起主导作用，以皮质醇为主）和盐皮质激素（以醛固酮为主）；同时GC对下丘脑和垂体前叶进行负反馈调节。GC可以促进蛋白质和脂肪分解代谢，加强肝脏的糖异生作用，增加肝糖原的储备，起到提高抵抗力的作用，对机体适应外界环境极为重要，但如果长时间的增多则是有害的，导致机体免疫力的下降，醛固酮的主要作用是促进肾脏远曲小管对Na+和水的重吸收，加强K+的排泄，以维持机体的体液平衡12。2.2.2 促性腺激素轴由于促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）二者都具有维持性腺结构和功能的作用，故统称为促性腺激素。它们由垂体前叶的一种称为促性腺细胞的特殊细胞产生，其合成和分泌受到下丘脑的促性腺激素释放激素（GnRH）的调节。由于LH和FSH都由促性腺细胞合成，因此激活素、抑制素、促滤泡素和性激素类固醇等调节剂存在有多种调节机制，从而能够分别调节这两种促性腺激素的分泌。LH能够促进雌性动物的排卵，并对黄体有营养作用；FSH则可促进保证卵泡成熟，维持卵巢的大小，并刺激雌激素的生成。急性热应激会导致短期的LH分泌增多，但不会引起FSH分泌的变化，而长期的应激则会导致机体促性腺激素的分泌和减弱和生殖障碍。如李建国等（1998）13在热应激对奶牛影响的研究中发现，热应激使奶牛血清中孕酮水平显著增加，而促进黄体素的雌二醇水平均呈下降趋势。机体的促性腺激素轴对环境温度的敏感性已被确认。热应激对促性腺激素的分泌有抑制作用已经被多次验证14。高温度环境能削弱去势后促性腺激素的增加。热环境下机体促性腺激素分泌的减少反映了下丘脑GnRH释放抑制，垂体对GnRH的反应性也被热应激减弱。2.2.3 促乳激素轴大多数的垂体激素是由于释放因子的刺激而释放。但是垂体泌乳素（PRL）分泌的主要调节是受下丘脑分泌的多巴胺的抑制性调节。后者经垂体的门静脉系统进入垂体。PRL已充分证实的功能是刺激乳的合成和分泌，然而也还可能存在其他方面的作用，乳可能在水盐平衡、免疫、生长、发育和新陈代谢中发挥作用。应激对促乳激素轴激活的报道是一致的。促乳素的分泌与环境温度呈正相关，尽管多巴胺可抑制垂体腺对PRL的分泌已被确认，但也有证据表明下丘脑腹正中侧内的多巴胺刺激信号与暴露处理时PRL分泌的增强有关。羊在事先用特异性多巴胺受体（D1亚型）的拮抗剂进行预处理后，PRL对高温的反应被抑制，但不影响在心理性应激时PRL的急性分泌。人暴露于冷环境2h，循环的PRL量也会降低。环境温度短期与长期的升高都会增加PRL的分泌。这一反应在多种动物都存在并且一致。长期热应激时，机体PRL的分泌量增加，而同时垂体腺中准备释放的PRL量也明显的升高。这种反应的内在机理目前还不清楚，但有可能与促乳激素细胞数量的增加有关，类似于雌激素处理后所发生的反应。2.2.4 胰腺和生长激素轴“生长激素轴”通常是指能够控制生长激素（GH）的产生和分泌，以及随后产生的生理反应的整合为一体的神经中枢和内分泌机制。GH是由垂体腺前叶的一种名为“亲躯体细胞（somatotroph）”的特殊细胞产生和分泌的。其他一些激素也会对亲躯体细胞产生影响。生长激素释放激素（GHRH）和生长激素抑制素是重要的下丘脑刺激因子，可分别刺激和抑制生长激素的分泌。GH的作用之一是刺激肝脏产生和释放类胰岛素类生长因子（IGF-），机体内多种外周组织的生长和发育依赖于这一生长因子。此外，GH也可对各种外周组织产生直接的影响作用。动物暴露于急性高温环境中显著增强GH的分泌，而降温则降低GH分泌。长期的热应激可增强泌乳母猪GH的基础分泌量及刺激促分泌素的分泌量。胰高血糖素和胰岛素是调节血糖浓度的两种重要激素，胰高血糖素的作用是升高血糖，而胰岛素的作用是降低血糖。热应激时，血液中胰高血糖素逐渐增加，使血糖和游离脂肪酸浓度增高，以供组织氧化利用；胰岛素在血液的含量表现逐渐下降的趋势，以利于血糖升高和糖异生。龚远英（2001）15的试验结果验证上述观点，但高增兵等（1999）16报道，血浆中胰岛素先出现升高，后表现下降至稳定。应激时血液胰岛素水平高低不定，可能与血糖水平等因素有关。2.2.5促甲状腺激素轴促甲状腺激素轴主要组成包括下丘脑的促甲状腺素释放激素（TRH）、垂体的促甲状腺素（TSH）和甲状腺激素（T3和T4）。与其他下丘脑激素一样，TRH被释放到垂体门静脉，然后被输送到垂体前叶。垂体内一种称为促甲状腺细胞响应TRH而合成并释放TSH。作为一种有效的代谢调节剂，甲状腺激素在调节体温的新陈代谢中发挥重要作用。在热应激过程中，血液中的T3和T4含量随时间的延长而出现波动。龚远英（2001）15在肉鸡急性热应激研究中发现，血液中T3呈现出先升后降的趋势，热应激5h达到最高值，10小时又明显低于对照组。血液中T4出现明显的下降，尤其是热应激3h和10h时。宁章勇（2002）17在研究中发现了类似的变化趋势，但随着热应激时间的进一步延长，T3会再次出现升高，但要低于对照组，T4则出现相反的变化趋势。刘凤华等（1998）18在研究中发现，热应激处理的蛋鸡，血浆中T3和T4呈现先显著增加后逐渐下降的趋势。2.3 细胞凋亡与热应激反应细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多种细胞生物生长发育过程中，对于去除不需要的或异常的细胞中起着重要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。当暴露于各种理化及生物性刺激是，任何生物细胞（从细菌、酵母到高等不如动物细胞）都将出现一系列适应代偿性反应。这些反应包括与损伤因素有关的特异性反应与损伤因素关系不大的非特异性反应，统称为细胞应激（cell stress）。在不同应激原作用下，生物细胞都可出现某些类似的反应，如多种生物、理化应激原都可导致热休克蛋白的表达增加。过去不少学者倾向于将此视为“非特异性反应”。但是即使如此，不同应激原作用下热休克蛋白的表达的种类和水平差别很大。热应激反应是所有生物体细胞为适应生存所固有的生理反应。细胞受到不良因素刺激时，均可通过基因表达模式的改变而导致一系列称为热休克蛋白（HSPs）的合成，以维护细胞的结构和功能并起着保护应激结果的作用。HSPs是热应激反应的标志性产物，其中HSP70最为重要，分布在各种细胞中并具有广泛的保护作用。不同的组织细胞对同样的热休克具有不同的反应。如在小鼠整体热休克时（42，15min，恢复24h）心脏组织中的诱导HSP70和HSP90表达为主，而在肝脏组织中则以诱导HSP27/25为主。生物细胞暴露与高温（热休克）时所表现的以基因表达变化为特征的防御适应反应称为热休克反应（HSR）。许多研究表明，机体应激时，受应激因素的刺激引起细胞凋亡、细胞周期阻滞和DNA损伤等多种反应，其中细胞凋亡可最大限度减少机体非生理性细胞坏死，以减轻大量细胞坏死所致的毒副作用。冯建江等（2006）研究表明，热适应处理明显干扰热应激细胞的细胞周期进程。夏季持续高温容易对奶牛的生理机能造成影响，从而导致奶牛产奶量下降。近年来研究表明，热应激会引起细胞周期调控点G1/S或G2/M的阻滞，剧烈的热应激还会诱导细胞发生凋亡。据报道，夏季热应激造成奶牛外周血淋巴细胞的凋亡率显著上升。李忠浩等（2007）对不同温度条件下荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞凋亡的关系进行了研究，结果表明：淋巴细胞凋亡率在冬季时最低，为0.44，夏季高温显著提高奶牛外周淋巴细胞的凋亡率，同时显示淋巴细胞的凋亡率并不是在热应激初期立即上升，而有明显的滞后效应，即在热应激初期牛舍温度28.53时凋亡率上升不显著，而牛舍温度33.17时淋巴细胞凋亡率达到最高为17.79（p0.01）在热应激末期（27.03）淋巴细胞的凋亡率有所下降，为5.53（p0.05），但能显著提高41和43热应激心肌细胞线粒体H+-ATPase合成活力，分别达89.9132.10和77.7921.26；37常规培养和39、41、43热应激后，心肌细胞Caspase3活性（Channel/mg pro）分别为22.922.09、25.103.13、101.804.86和405.0420.6，其中41和43热应激后心肌细胞Caspase3活性与常规培养的心肌细胞有极显著性差异（p0.01）。Bcl基因转染后，37、39、41、43条件下，Caspase3活性分别为22.183.60、24.461.18、73.822.36和215.8411.38，表明Bcl-2基因转染对常规培养和39热应激心肌细胞的Caspase3活性无影响，却能显著降低41和43热应激引起的心肌细胞Caspase3活性增高（p0.01），保护心肌细胞线粒体、提高心肌细胞线粒体H+-ATPase合成活力，同时有效地抑制热应激后心肌细胞Caspase3活性，抑制热应激导致的心肌细胞损伤。这可能是Bcl-2降低热应激后心肌细胞凋亡的重要机制之一。2.4.2 p53 p53作为反式转录激活因子，可主要调控三群相关基因出表达：一群是可启动线粒体凋亡途径；另一群是可启动死亡受体凋亡途径；第三群则为磷酸酯酶，可负调控细胞的生存、增值信号途径，增加细胞的凋亡的敏感性。在正常生理条件下，p53因其基因相对处于静息状态和生物半衰期较短，细胞内p53蛋白水平低。一旦细胞受损，细胞内p53蛋白水平因其转录活性和稳定性的增加而增高，p53蛋白首先诱导细胞发生G1期阻滞，抑制细胞增殖，为受损DNA的修复赢得时间。如损伤较轻，损伤DNA得到修复，则细胞周期递次向前推进进入S期。如DNA受损严重，无法得到修复，则p53蛋白水平持续升高，p53诱导细胞走向凋亡。此外，p53还可转位到线粒体，模拟BH3-only样蛋白的功能，直接诱导细胞凋亡。热应激处理可通过p53依赖性细胞凋亡机制提高细胞热耐受性，增强细胞对热环境的适应性，减少热应激所致细胞损伤，冯建江等（2008）将培养有7721的细胞瓶随机分为对照组（A组）、热适应组（B组）、热适应热暴露组（C组）和热暴露组（D组），分别给予不同热暴露，用DAPI荧光显微法观察细胞凋亡，用Westem blot检测p53和p21表达，用克隆形成试验测定细胞增殖。结果如下：细胞存活率：D组C组B组C组A组和B组；C组和D组p53和p21 表达均明显强于A组和B组，C组p53和p21表达均明显强于A组和B组，C组p53和p21表达明显低于A组。2.4.3 热休克蛋白（HSPs）HSPs是指在热休克反应中表达显著增加的一个蛋白质家族，多重HSPs在非应激状态下具有组成型表达，并在正常的细胞生理状态下发挥重要功能。目前认为HSPs的功能包括分子伴侣功能。即能防止应激状态下变性蛋白的聚集，帮助变性蛋白重新正确折叠并复性，在非应激状态下，一些HSPs在蛋白质合成过程中也起到帮助蛋白正确折叠的作用，此外HSPs还能够稳定其他蛋白的结构，从而调节多种细胞生理过程，如细胞周期的调控、类固醇和维生素D受体的代谢和免疫反应中细胞的抗原呈递作用等。调节细胞的氧化还原状态。例如HSP32，也称为血红素加氧酶1（heme oxygenase-1,HO-1），能够催化亚铁血红素衰变为胆绿素和一氧化碳。胆绿素可以进一步转化为胆红素，后者是一种抗氧化剂，具有细胞保护作用。调控蛋白转归。例如泛素是一个使蛋白质降解的分子标签。机体在试图清楚某些异常蛋白质（如变性蛋白、错误折叠蛋白等）之前，先将这些蛋白质标上泛素标签，然后经蛋白酶体将其降解。泛素在正常状态下即可表达，在热休克反应中表达增加。其他功能。如HO-1能够促进神经组织和血管平滑肌细胞中一氧化碳的释放，释放的一氧化碳与鸟甘酸环化酶相互作用使cGMP产生增加，而cGMP具有舒张血管平滑肌的作用。另外有学者发现，细胞外的HSP70通过CD14受体引起人单核细胞TNF-,IL-1和IL-6的释放。这提示当HSP70从受损细胞中释放出来或被免疫细胞分泌出来后具有促炎因子的功能。HSP70是进化上最保守的蛋白质之一，不同生物来源的氨基酸序列有4090的一致性。和其他HSPs表达调控相似，HSP70的表达调控主要在转录和翻译两个水平，且最主要是在转录水平调控上。其中转录水平的调控与热休克元件（HSE）和热休克因子（HSF）相关。细胞热应激是，HSP70合成显著增加，而其他蛋白的合成则减少。HSP70在翻译水平的调控，主要由HSP70基因及其mRNA特性决定，HSP70基因不存在内含子，细胞启动转录就能够产生成熟的mRNA，可以适用HSP70大量快速表达的需要。人们还发现热应激是细胞能够选择性的转录HSP70mRNA，而其他蛋白的mRNA并未降解，从细胞中分离后仍可以在体外成功翻译，这可能是与HSP70mRNA5末端富含A的不翻译区有关。热应激是，其他正常蛋白的翻译受到抑制，从而减少了与HSP70mRNA翻译的竞争。 2.4.4 热休克因子（HSFs）热休克因子（HSFs）是一族能够与HSP基因启动子区的热休克元件（HSE）相结合从而调控HSPs表达的转录因子。HSE是HSPs基因启动子区的一段序列，由多个连续的反向重复核心序列（5-nGAAn-3）组成。在哺乳动物及人类细胞中已发现有三种HSFs，即HFS-1，HSF-2和HSF-4。另一种HSF-3则只在鸟类中表达。目前认为，HSF1是参与热休克反应的主要HSF；HSF3在热休克反应中对HSF1具有某些协同作用；HSF2和HSF4则可能参与胚胎发育，而在细胞的热休克反应中不起作用。在正常状态下，HSF1以单体形式存在于细胞质中，胞质中的HSF1与HSP70和HSP90相结合。在应激原的作用下，HSP70和HSP90与HSF1解离，而与其他变性蛋白暴露出的疏水基团相结合，导致HSF1的游离和活化。在各种应激反应中，特别热应激时，HSF1调控HSPs的诱导表达发挥重要作用。Zhang等（2002）采用HSF1基因敲除小鼠模型，进一步证实HSF1是热休克反应抑制小鼠胚胎成纤维细胞和骨髓祖细胞凋亡所必需的。鄂顺梅等（2006）研究表明HSF1可以抑制热应激所致的Raw264.7巨噬凋亡。HSF1对热诱导的细胞凋亡有保护作用，可能的机制涉及两个方面：HSF1通过增加一些热休克蛋白的表达而增加细胞抗损伤能力；HSF1通过调控某些凋亡相关基因的表达，而抑制或促进该基因的转录，从而通过直接干预凋亡信号通路中某些信号分子的表达而发挥其抗凋亡的作用。HSF1对下游基因转录的影响并不一定需要与基因启动子区的直接结合来完成。在中国仓鼠卵巢成纤维细胞中，热休克能抑制血清诱导的c-fos基因的表达。其机制包括对Ras诱导的c-fos和尿激酶基因启动子转录的抑制。HSF1不是通过与DNA的直接结合来抑制Ras介导的c-fos和尿激酶基因的转录。2.5 MT与HSF、NF-B、AP-1和Bax 和Bcl-2 之间的联系HSF、NF-B和AP-1作为重要的转录调节因子可被多种因素激活，参与感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡、休克和某些疾病的病理过程，以及细胞周期控制与分化等。长期应激刺激下，AP-1与NF-B 均可被激活。AP-1被激活后，NF - B是其活化的相关因子之一，可通过磷酸化或促炎症细胞因子活化NF-B；同样NF -B被激活后，也可能通过其产物(如促炎症细胞因子) 而反过来激活自我和AP-1，这样，AP-1与NF - B 之间就可能形成复杂的相互激活网络。Chen Y等通过RNAi技术阻止血管平滑肌细胞中HSF-1表达将加剧血管紧张素诱导炎症损伤，HSP通过抑制炎症转录因子NF-B 和AP-1阻止炎症损伤。Yeo M等报道格尔德霉素（GA）能抑制HSP90磷酸化使细胞外信号调节激酶和NF-KB活性减弱，从而降低炎症。Oszajca K等通过测定人脐血上皮细胞中NF-kB、AP-1和HSF-1的蛋白水平和与氧化应激有关的DNA结合活性，发现该三种转录因子对调控氧化应激有强烈的相关作用。MT 可抑制蛋白激酶C（PKC）-、血管紧张素原（Ang）和 NADPH 氧化酶亚基（p47phox）的表达，由于p47phox磷酸化后可活化NADPH氧化酶，故 MT 对 p47phox 的抑制可直接降低 p47phox 亚基对 NADPH 氧化酶的活化作用，减少 ROS 的产生，通过抑制肾皮质内的氧化应激水平。既然已证明 MT 能抑制氧化应激，减少ROS的产生，而ROS通过激活蛋白激酶C（PKC）及丝裂原活化蛋白(MAPK)，使转录因子NF-B和AP-1活化，诱导凋亡。由此可推测MT 也能抑制NF-KB和AP-1活化。MT 通过抑制NF-kB的表达，还能下调Bax的表达，稳定溶酶体，从而直到抑制凋亡，抗氧化应激，对糖尿病心肌病变起到保护作用。NF-KB活性、表达及信号通路都可调控细胞凋亡调节基因，阻断 NF-KB 激活能下调Bax表达，增加Bcl-2/Bax比率。减小局灶性脑缺血神经细胞的凋亡机制与 NF-B 的活性降低，上调Bcl-2 蛋白表达，抑制 Bax 蛋白表达有关。奶牛外周淋巴细胞的凋亡受HSP70、HSF1、Bax 和Bcl-2 四个基因的调控，在不同日平均气温下，HSP70 mRNA，HSFl mRNA，Bax-amRNA，Bcl-2 mRNA，Bcl-2 mRNA/Bax-a mRNA表达水平发生很大变化，差异显著。2.6 金属硫蛋白对热应激的影响金属硫蛋白（Metallothionein，简称MT）是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含Cys、能被金属结合的蛋白。自从1957年Margoshes等人在马肾中首次发现MT以来，人们对不同来源的MT进行了系统的研究。MT的生物学意义涉及生物机体微量元素储存、运输和代谢、重金属解毒、拮抗电离辐射、清除自由基、以及机体生长发育、生殖衰老、肿瘤发生、免疫、应激反应等各个方面，其研究和开发涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域，MT的理论和应用研究显示了诱人的前景。分子遗传学及发育生物学家一致认为，MT是“看家”基因编码的蛋白，因为MT具有组织和细胞特异表达功能，并受控于激素及免疫调节素的控制。给动物注射糖皮质激素、干扰素、白细胞介素-均能使肝脏中MT合成增加。各种炎症因子及机体的应激状态（如寒冷、过度疲劳、饥饿等）都能增加MT-mRNA的转录，同时伴有血浆中Zn浓度的下降。在胚胎发育过程中，有几种组织的MT基因表达增加，这提示MT在胚胎、生长发育及分化中起着重要作用。这可能是由于参与这些过程的酶是需Cu或Zn的含金属酶，它们所需金属由MT提供有关。研究发现应激在诱导MT合成的同时，循环中激素水平均上升，由此考虑激素可诱导产生MT。进一步实验证实糖皮质激素的诱导发生在转录初始水平，但诱导转录效率不高，在无活性的多甲基化MT基因中无诱导作用。糖皮质激素对MT的诱导模式可能与激素同受体结合成激素受体复合物有关，并直接作用于核DNA序列中的MT基因的激素反应元件（HRE）。MT增强机体的应激能力以及应激保护作用。研究发现，冷、热、禁食、饥饿等应激都可诱导MT的合成，同时循环中的激素水平均上升。Beattie等对冷暴露大鼠BAT中的MT-1基因表达进行研究结果表明：寒冷应激可诱导产热棕色脂肪组织中MT-1大量表达，且还发现敲MT基因后小鼠显示一定程度的肥胖。大鼠禁食24h、48h后肝MT、过氧化物阴离子产生较对照组显著增加。组织创伤和细菌感染同样也可以引起MT含量的增加，大鼠创伤后6h肝MT含量较对照组增加6倍，创伤后24h降至正常。Brady推测应激因素诱导肝脏MT合成可能是肝脏再生锌的结果。此外，体力限制、剧烈运动、过度疲劳等同样也可以食MT的含量发生响应的变化。 应激尤其是热应激一直是困扰我国南方各省奶牛饲养业的一大难题，一般认为，机体氧化及应激的始作俑者是羟基自由基，羟基自由基通过攻击生物膜多不饱和脂肪酸、DNA、蛋白质和其他生物大分子，引发细胞和组织氧化损伤，导致细胞组织的裂解、酶和氧化强化剂的释放，使机体产生应激，生产力下降，出现病变、甚至死亡。金属硫蛋白在动物体内又具有较好的抗应激和抗氧化能力，参与DNA的复制、转录和能量代谢的调节过程，因而自然而然就会将金属硫蛋白的抗热应激作用纳入研究的新的一个亮点。张彬等（2007）将28头奶牛随机分成4组，室温在32.4235.86，每组每头分别按0、6.0、12.0和16.0mg剂量静脉注射Zn-MT，结果表明：外源性MT对提高奶牛抗热应激能力的效果表现出一定的时间效应和剂量效应，较高剂量（如16mg）的效果优于低剂量（如6mg）；随着补给外源性MT时间的延长，抗热应激的效果趋于明显，至30d时到达最佳，而45d时稍有降低。但该试验没有对MT对抗热应激的能力的最佳剂量和最适作用时间做研究。3、研究展望中国荷斯奶牛产奶量高，但耐热耐湿性能差，由于南方夏季高温高湿的气候，致使奶牛表现出普遍且较严重热应激综合症，表现出产奶量明显下降，抗病力降低，乳房炎、腐蹄病、生殖道感染等炎症性疾病增加，热应激已成为限制南方奶业发展的瓶颈。MT 作为一种重要的应激反应蛋白，其表达水平与应激反应程度存在密切联系，它作为一种外源抗氧化剂，具有抗氧化、抗应激、提高机体免疫力、调节自由基参与过程，其调控效果已得到认可。本课题组对MT进行了系列研究：已从小鼠、猪肝和牛肝中成功提取到纯度较高的MT初步得出总180mg Zn诱导犊公牛效果最好；掌握了MT的ELISA检测法；探讨了MT仔猪和奶牛体内代谢动力学研究；抗氧化、调控生殖激素等进行了大量研究，初步得出奶牛注射16mg MT抗氧化效果最好。但是究竟MT对奶牛的垂体激素轴的影响如何，将引起细胞热应激反应又会如何变化，都有待进一步验证，本次试验设计主要是针对这两个方面来进行系统的研究与论证，为MT在奶牛体内的作用机理提供有效的理论依据，同时也为解决南方奶牛抗热应激提供参考思路。4、研究内容及方法4.1 研究内容MT对热应激奶牛状态垂体激素轴影响的研究；MT对热应激奶牛转录因子HSF、NF-B、AP-1和HSP70表达的调控；MT对热应激导致的凋亡调节蛋白Bax、Bcl-2和p53的调控；4.2 技术路线动物试验、采样、分析测定全自动生化分析仪检测ACTH、醛固酮、FSH、 PRL、IGF-、胰岛素、T3和T4神经内分泌激素荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2、p53、NF-B、c-fos、HSP70和HSF1分子的基因表达量用间接竞争型ELISA定量技术测定样品中Zn-MT的含量MT对热应激引起的细胞凋亡调节蛋白及相关因子分子活性和基因表达水平调控的信号转导通路MT与奶牛热应激状态下垂体激素轴的动态平衡规律及剂量效应和时间效应资料整理；数据统计、分析研究MT对奶牛热应激及细胞凋亡调控机理4.3 试验设计饲养试验地点为湖南省畜牧兽医研究所奶牛场和湖南省阳光牧业第一牧场，两个奶牛场各25 头往年7-9月连续三个月内日均产奶量差异不显著的中国荷斯坦奶牛，各随机平分为5 组，每组5 头，阳光一牧场奶牛编为对照组，实验组1-4组，畜牧所奶牛编为对照组，实验组-组。5月初（要求中午12：00温湿指数78，并每天上下午各驱赶运动1h加强应激，于试验进行第1d分别注射MT（采用锌诱导法制备、分离和纯化的Zn-MT) 0、16、20、30、40mg，溶于2ml 生理盐水中肌肉注射，阳光一牧场的奶牛第10d用同剂量再加强一次。表3 热应激试验设计 组别处理对照组1（或）组2（或）组3（或）组4（或）组THI7878787878第1d全部奶牛注射量2ml生理盐水16mg MT20 mg MT30mg MT40mg MT第10d阳光牧场奶牛注射2ml 生理盐水16mg MT20 mg MT30mg MT40mg MT在距地面1.5m 高处挂置干湿球温度计，并计算奶牛场的THI，按公式THI=0.72(Td+Tw)+40.6计算（Td和Tw分别指干球温度和湿球温度的读数）111。测定时间为每天上午12：00。4.4 测定内容及方法4.4.1 MT在血液与乳汁中含量与时间效应于实验进行第1、5、10、15、20d各头牛尾静脉取血10ml，取牛乳10ml，同时测量直肠温度和温湿指数，分离血清于-20保存备用。MT的含量采用本课题组建立的定量检测MT的间接竞争型ELISA技术（已获授权的国家发明专利“一种金属硫蛋白的检测方法”，专利号：ZL200410061265.9）。ACTH、醛固酮FSH、 PRL、IGF-、胰岛素、T3和T4神经内分泌激素采用全自动生化仪测定。采用荧光定量PCR技术测定奶牛外周血淋巴细胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、p53 mRNA、HSP70mRNA和HSF1mRNA、-B mRNA、和c-fos mRNA表达量。GAPDHmRNA为看家基因，采用荧光定量PCR。4.4.2 试验步骤4.4.2.1 总RNA提取1、实验试剂 Trizol RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，DEPC水（1：1000 DEPC溶液高温灭菌）。2、实验方法(1)1.5ml 样品离心管中，加入1ml Trizol试剂。(2)静置5分钟 或 马上-70保存。(3)12000 rpm 离心15分钟,分相为三层，取上清液至新1.5ml管。(4)加入200ul氯仿，振荡混均30秒。(5)室温静置3-5分钟分层。(6)12000rpm离心15分钟，取上清液至新1.5ml管，中间层和红色下层4保存，便于提 取 DNA和蛋白质。(7)上清液加入约0.5ml的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟。(8)12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。(9)如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清。(10) 加入1ml 75%乙醇（预冷），温和震荡悬浮沉淀。(11) 8000 rpm离心5 min,弃上清。(12) 短暂快速离心（5秒），吸弃上清。(13) 室温放置2分钟晾干。(14) 沉淀加入15ul DEPC处理水，轻弹管壁溶解。(15)少量样品55-60水浴中孵育1015分钟。(16)测量ODA260/A280值后，样品放置70保存(保存时间不应超过一星期)。4.4.2.2 反转录1、实验试剂 TIANScript RT Kit，DEPC水。 2、实验方法 (1)0.2ml离心管加入1l总RNA，1l随机引物oligo(dt)，10l DEPC处理水。 (2)混匀，瞬时离心5秒。 (3)70水浴5min。 (4)迅速冰浴2min。 (5)瞬时离心，加入4 ul 5 Buffer, 2 ul 0.1M DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。 (6)混匀，温浴2min。 (7)加入1 ul 反转录酶，42温育50min。 (8)70孵育10min灭活。 (9)-70冰箱保存。4.4.2.3 FQ-PCR条件优化步骤根据下表中GenBank登陆序列，以奶牛的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogease gene，GAPDH）mRNA作内参，Primer Premier 5.0设计引物。表4各种目的基因合成引物序列扩增基因登录号上游（5-3）下游（5-3）产物长度（bp）HSP70BTU09861TGTCGCTGGGACTGGAGCCCTCGTACACCTGGAT140HSF1FJ358599CCGACCACCCTTATTGACGACGCTGAGGCACTT136GAPDHBTU85042ATGCTGGTGCTGAGTATGTAATCTTGAGGGTGTTGTTAT166NF-KB p65DQ355511GCACGGACACCACCAAGACGACCAGGGAGATGCGGACT80C-FOSAY322482CGAAGGGAAAGGAATAAGAGCCGCTAGGATGAACT171BaxBTU92569GAGTGGCGGCTGAAATGCCTTGAGCACCAGTTT91Bcl-2BTU92434GATGACCGAGTACCTGAACCGAGACAGCCAGGAGAAATCA122P53BC102440.1CTTTGAGGTGCGTGTTTCAGTGCTCGCTTAGTGC118（1）引物和模板稀释 按照引物说明书将引物稀释到10M，将模板按体积分别稀释到2倍、3倍、4倍、5倍。（2）构建反应体系 SYBR Premix Ex Taq 10l PCR Forward Primer 0.4l PCR Reverse Primer 0.4l ROX Reference Dye 0.4l DNA模板 2.0l dH2O 6.8l Total 20l（3）反应条件Stage 1：预变性 Reps：1 95，30sStage 2：PCR反应 Reps：40 95 5s 60 30s (3) 条件优化 表51 96孔板反应最佳条件，即模板（cDNA）浓度和不同目的基因引物浓度abc1/21/31/41/5HSP701/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.81/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.8HSF11/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.81/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.8NF-KB p651/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.81/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.8GAPDH1/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.81/2*0.4l1/2*0.6l1/2*0.81/3*0.4l1/3*0.6l1/3*0.81/4*0.4l1/4*0.6l1/4*0.81/5*0.4l1/5*0.6l1/5*0.8为了