半乳糖操纵子双启动子详解

第八章原核生物基因的表达及其调控 生物体的每个活细胞都含有相同的一整套基因 基因表达具有高度的时空专一化 如肌红蛋白基因 肌细胞 基因表达的调控 生物有机体对其基因表达的时空程序 表达速率等所进行的调节和控制 本底水平表达 调控处于关闭状态 只翻译极少量的蛋白质 第一节原核生物基因的转录和翻译 原核生物的DNA 单个裸露的DNA不编码占5 转录和翻译同一时间 地点进行转录水平调控 主 兼有翻译水平调控 根据基因表达产物可划分 组成型蛋白 基因表达不受时期 部位 环境影响 组成型表达 调节型蛋白 适应型蛋白 基因表达受时期 部位 环境影响 非组成型表达 一种生物的整套遗传密码可以比作一本密码字典 该种生物的每个细胞中都有这本字典 为什么基因只有在它应该发挥作用的细胞内和应该发挥作用的时间才能呈现活化状态 结论 必然有一个基因调控系统在发挥作用 基因调控主要在三个水平上进行 DNA水平 转录水平 翻译水平 一 转录的起始转录是原核生物基因表达的主要调控点 主要涉及两个方面 1 RNA合成的酶系 2 RNA合成起始和终止信号 即DNA分子上的特定序列 通过RNA聚合酶 转录因子和启动子的相互作用实现转录调控 改变细胞的表型 从而实现细胞生理状态和环境的变化 一 RNA聚合酶 RNApolymerase 大肠杆的的RNA聚合酶 由5个亚基组成 即 2 有时还有2个 亚基 以 2 组成的酶称全酶 亚基与其他亚基结合较松弛 易从全酶上解离 其余部分 2 称为核心酶 coreenzyme 在大肠杆菌中还发现一种新的 因子 称为 因子 因此将含有 亚基的全酶称为全酶I 含有 亚基的称为全酶 二者的不同在于 全酶 可以利用双链DNA为模板合成po1y A 亚基作用 参与启动子的识别和结合以及转录起始复合物的异构化 细胞内哪条DNA链被转录 转录方向与转录起点的选择都与 亚基有关 离体实验表明 全酶所转录的RNA和细胞内所转录出的RNA 其起始点相同 序列相同 若仅用核心酶进行转录 则模扳链和起始点的选择都有很大的随意性 而且往往同一段DNA的两条链都被转录 由此可见 亚基对识别DNA链上的转录信号是不可缺少的 它是核心酶和启动子之间的桥梁 因子的取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用 如在枯草杆菌中就有不同相对分子质量的 因子 P227表9 1 核心酶的 亚基作用 对RNA聚合酶的功能至关重要 参与RNA合成 终止信号的识别 由于 亚基与RNA的前体核昔三磷酸具有很高亲和力 推测它可能参与底物的结合 以及催化磷酸二酯键的形成 亚基作用 可使聚合酶结合到模板DNA上 亚基作用 游离状态 常以二聚体的形式存在 参与全酶同启动子的牢固结合 RNA聚合酶体积很大 横跨近60个碱基 而解旋的DNA区域可能不到17个碱基 当聚合酶按5 3 方向延伸RNA链时 解旋的DNA区域也随之移动 靠近3 端的DNA不断解旋 同时在5 端重新形成DNA双链 不断将RNA DNA杂合链中的RNA链挤出 二 启动子 promoter 转录的起始是基因表达的关键阶段 启动子就是连接在基因3 端上游的DNA序列 其长度从100bp到200bp不等 是转录起始时RNA聚合酶识别 结合的特定部位 但其本身并不被转录 在启动子与终止子之间是一个转录单位 通常将mRNA开始的一个核苷酸定为o点 即 1 由此向右常称为下游 downstream 其核苷酸依次编为正序号 起始点左例称为上游 upstream 其核苷酸则依次以负号表示 紧接起始点左侧的核昔酸为 1 原核生物启动子结构含有同源序列 整个启动子包括两个部分 其上游部分是CAP cAMP结合位点 下游部分是RNA聚合酶的进入位点 二 转录的终止 一 终止子及其结构 1 概念 DNA上提供转录停止信号的一段序列称为终止子 terminator 是一个基因的末端或是一个操纵子的末端的一段特定序列 2 类型 强终止子和弱终止子强终止子 不依赖于Rho蛋白质辅助因子而能实现终止作用 这类终止子属于强终止子 弱终止子 依赖于Rho蛋白糖助因子才能实现终止作用 这类终止子属于弱终止子 蛋白质辅助因子称为释放因子 通常称为 因子 所有原核生物的终止子共同的序列特征 即在转录终止点之前有一段回文结构 因而所产生的mRNA可形成茎环状的发夹结构 它可使RNA聚合酶的移动停止或减缓 回文结构中富含GC对 在回文序列的下游常有6 8个AU对 因此这段终止子转录后形成的RNA具有与A相对应的寡聚U 是使RNA聚合酶脱离模板的信号 依赖子 因子的终止子其回文序列中GC对含量较少 回文序列下方没有固定结构 其AU对含量也较低 因而是弱终止子 必需有 因子存在时才发生终止作用 这也就是说依赖于 因子的终止子由于其茎环结构常较短 在没有 因子时这种茎环结构不稳定 即如果没有 因子存在 RNA聚合酶会继续转录下去 这就称为通读 readthrough 当 因子存在时 转录才能终止 在强终止子中 由于其DNA模板上富含GC而使转录出的RNA上富含C和G 于是RNA与模板之间可以形成较强的氢键 成为DNA RNA杂合分子 从而阻碍DNA聚合酶的前进而有利于终止 二 因子辅助终止作用的机理 三 基因表达的极性现象在正常情况下原核基因表达时 其转录出来的mRNA随即进行翻译 这时整个mRNA都覆盖着核糖体 因子无法接近mRNA 而RNA聚合酶早已越过前面的基因的依赖 因子的终止子 所以转录实际上并不停止 而是继续转录后续基因 如果在某一基因的依赖于 的终止子之前发生无义突变 核糖体便从无义密码子上解离下来 翻译停止 核糖体不再进入到mRNA上无义密码子以后的位置上 于是 就可以自由进入RNA并移动 直到赶上停留在终止子上的RNA聚合酶 结果使RNA聚合酶释放 不能再转录下游基因 概念 基因表达的极性现象 在某些情况下同一转录单位里 由于一个基因的无义突变 阻碍了其后续基因表达的效应 就称为基因表达的极性现象 除了无义突变可以导致极性现象外 插入序列IS1 IS2等DNA片段插入到操纵子的基因中也会发生极性现象 因子也可发生突变 其效应的基本性质是使终止作用出现故障 突变常可抑制极性效应 这是因为其突变很可能减弱了 对无义密码子后面的中间终止子的作用 这样翻译的终止并不会使转录也停顿 且远离无义突变的DNA区段还可以被重新覆盖的核糖体继续翻译 四 抗终止作用 因子的作用可以被抗终止因子所抵消 这样 RNA聚合酶便可通过终止子 依赖于 因子的 继续转录后面的基因 这种现象称为抗终止作用 anti一termination 抗终止作用最有代表性的例子见于 噬菌体的时序控制 噬菌体基因在裂解过程中的表达分前早期 晚早期和晚期3个阶段进行 其早期基因与晚期基因以终止子相隔 噬菌体侵入敏感细胞 首先借助宿主的RNA聚合酶转录前早期基因 由此获得的表达产物N蛋白是一种抗终止因子 它与RNA聚合酶作用使后者越过左右两个终止子继续转录 实现晚早期基因表达 三 原核生物RNA的加工四 SD序列与翻译效率核糖体结合保护降解法 测定mRNA上核糖体起始蛋白质合成的部位 在抑制多肽链伸长的条件下 当翻译起始时 核糖体与mRNA的结合位点已形成稳定的复合体 于是加入核酸酶使未与核糖体结合的mRNA的区段降解 而有核糖体结合区域则受到保护 在细菌中受核糖体保护的起始序列约35 40个碱基长 其中包含起始密码子AUG 在起始密码子上游约4 7个核苷酸之前还有一段富含嘌吟的5 AGGAGG 3 短小序列 它可以与16SrRNA3 端的3 UCCUCC 5 区段完全互补 mRNA上的这段序列称为ShineDalgarno序列 简称SD序列 SD序列与16SrRNA序列互补的程度以及从起始密码子AUG到嘌呤片段的距离也都强烈地影响翻译起始的效率 不同基因的mRNA有不同的SD序列 它们与16SrRNA的结合能力也不同 从而控制着单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目 最终控制着翻译的速度 第二节大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控 一 操纵子与操纵子模型操纵子学说 操纵子模型 F JacobJ Mond 1960 E colilacoperon 1965诺贝尔医学生理学奖 操纵子 核酸分子上调控基因转录活性的基本单元 由结构基因 操作子 O 和启动子 P 组成 转录 翻译 合成蛋白结合调节蛋白结合RNA聚合酶 操纵子 operon 模型 调控蛋白的作用机制 注 R RegulatorP PromoterO Operator正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白 apoinducer 负调控系统中的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白 repressor 二 正调控与负调控调节基因RNA调节蛋白正调节蛋白 操作子结构基因转录 表达基因失活 结构基因不表达 正控制 正调节 负调节蛋白 操作子结构基因转录 表达基因失活 结构基因组成型表达 负控制 负调节 根据调节蛋白基因突变失活所产生的后果 可分 隐性的组成型表达 负控制系统结构基因处于不可诱导状态 正控制系统根据辅因子 小分子 结合后调控效果 可分 开启调控系统中结构基因的转录活性 诱导关闭调控系统中结构基因的转录活性 阻遏 操纵子调控系统的基本类型 可诱导负控制系统可诱导正控制系统可阻遏负控制系统可阻遏正控制系统 正调控与负调控并非互相排斥的两种机制 而是生物体适应环境的需要 有的系统既有正调控又有负调控 原核生物以负调控为主 真核生物以正调控为主 降解代谢途径中既有正调控又有负调控 合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身的合成 如 大肠杆菌乳糖代谢的调控需要三种酶参加 半乳糖酶 将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖 渗透酶 增加糖的渗透 易于摄取乳糖和半乳糖 转乙酰酶 半乳糖转变成乙酰半乳糖大量乳糖时 大肠杆菌三种酶的数量急剧增加 几分钟即可达到千倍以上 这三种酶能够成比例地增加 乳糖消耗完 这三种酶的合成也即同时停止 三 大肠杆菌乳糖操纵子的负调控 可诱导 乳糖操纵子的组成 1个启动子 promoter 2个操作子 operator 3个结构基因诱导因子 异乳糖 半乳糖苷 异丙基硫代半乳糖苷IPDG 乳糖操纵子突变类型 无诱导因子 组成型表达 突变位点位于调节基因和操作子上 乳糖操纵元表达受阻状态 缺乏诱导物 Thelactoseoperonintherepressedstate intheabsenceofaninducer A 乳糖操纵子组成部分 B 野生型基因型 I O Z Y A 无乳糖时 基因不表达 C 野生型基因型 I O Z Y A 有乳糖时 基因表达 D 调节基因突变 I O Z Y A 无乳糖时 基因组成型表达 E 操纵基因突变型 I OcZ Y A 无乳糖时 基因组成型表达 顺式显性 cis dominant 显性效应只对处于同一染色体上它所调控的结构基因才起作用的现象 称为 如O P240表9 2 乳糖操纵子的负控制 可诱导机制 异乳糖等诱导物 阻遏蛋白单体 阻遏蛋白四聚体 四 大肠杆菌乳糖操纵子的正调控葡萄糖效应 培养基中有葡萄糖存在时 即使有乳糖存在 不诱导靶基因表达 这样的操纵子称葡萄糖敏感操纵子 这种效应由一种正控制机制决定 葡萄糖抑制操纵子的原理 葡萄糖腺苷酸环化酶活性降低ATP无法转变成cAMP不能形成CAP cAMP复合蛋白RNA酶无法结合在DNA上结构基因不表达 无葡萄糖时 ATPcAMPcAMP CAP复合物结合CAP乳糖操纵子 两个开关第一 cAMP CAP复合物 受葡萄糖影响第二 异乳糖复合物 受乳糖影响 第三节其他类型的操纵子 一 具有双启动子的半乳糖操纵子半乳糖 gal 操纵子组成 2个互相重叠的启动子galP1和galP2 3个操作子 CAP位点 2个阻遏蛋白位点 galOe galOi 3个结构基因 galP1依赖cAMP CAP转录始于S1galP2阻遏蛋白调节开启转录始于S2 位于CAP位点内 位于galE内 正控制可诱导系统 第一系统 galP1 cAMP CAP复合物 cAMP CAP位点S1无葡萄糖时 ATPcAMPcAMP CAP复合物结合CAP有葡萄糖时 系统关闭负控制可诱导系统 第二系统 galP2 阻遏蛋白 半乳糖复合物 galOe galOiS2无半乳糖 阻遏蛋白结合操作子 阻遏有半乳糖 复合物构象改变 开启 从S2开始转录 CAP位点 激活gal操纵子 转录从S1开始 结构基因表达 galEgalTgalK P2 S1 P1 S2 a 半乳糖操纵子结构示意图 cAMP CAPgalactoserepressor 双启动子的半乳糖操纵子 有G 有gal 1 阻遏2 诱导无G 无gal 1 诱导2 阻遏 cAMP CAP与阻遏蛋白竞争无G 有gal 1 诱导2 诱导 高水平表达有G 无gal 1 阻遏2 阻遏 二 阿拉伯糖操纵子的双向控制Ara操纵子是控制分解代谢途径的另一调控系统 特点 调节蛋白既可起正调控作用 又可起负调控作用 组成 araC基因编码调节蛋白AraC蛋白 O1不参与调控 O2 AraC蛋白负调控结合位点 调节位点 CAP cAmP复合物结合位点 AraC蛋白正调控结合位点 调控 诱导物阿拉伯糖和cAMP同时存在 Ara与AraC蛋白复合物结合在 位点 CAP cAmp复合物结合I位点 基因转录开启 在没有诱导物阿拉伯糖和cAMP时 AraC蛋白同时与I和O2结合 DNA构型发生改变 形成一个紧密的环结构 抑制表达 三 色氨酸操纵子的转录调控及衰减作用1 色氨酸操纵子模型 由雅各布 JacobF 和莫诺 MonodJ 提出 具有合成代谢途径典型的操纵子模型 操纵子 包括色氨酸合成有关的5种酶的结构基因 大量色氨酸时 大肠杆菌5种酶的转录同时受到抑制 色氨酸不足时 这 种酶的基因开始转转录 色氨酸 作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构基因的转录 trp操纵子是一个典型的可阻遏操纵元模型 repressibleoperon 色氨酸操纵子模型结构 5种结构基因 trpE D C B A 调控结构 启动子 操纵子 前导序列 弱化子 阻遏物trpR基因 与trp操纵子相距较远 2 色氨酸操纵子的负调控 阻遏调控 trpR基因编码无辅基阻遏物与色氨酸结合形成有活性的色氨酸阻遏物与操作子结合阻止转录 色氨酸不足 阻遏物三维空间结构发生变化 不能与操作子结合 操纵元开始转录 色氨酸浓度升高 色氨酸与阻遏物结合 空间结构发生变化 可与操作子结合 阻止转录 弱化子调控 当有色氨酸存在而trp操纵子受抑制时 仍有一段前导序列发生转录 可能存在另一种的机制来抑制trp操纵元的转录 色氨酸高浓度存在时 转录的前导序列140bp长 其中有一28bp的弱化子区域 形成发夹结构 为内部终止子 RNA酶从DNA上脱落 不能转录 色氨酸低浓度或不存在时 RNA聚合酶能通过弱化子区域 转录完整的多顺反子mRNA序列 问题 弱化子如何进行调控 前导序列可翻译出一段14个氨基酸的短肽 在该短肽的第10 11位置上是两个色氨酸密码子 两个密码子之后是一段mRNA序列 该序列可分为四个区段 区段间可互补配对 形成不同的二级结构 原核生物为边转录边翻译 前导序列中核糖体位置决定形成哪种二级结构 从而决定弱化子是否可形成终止信号 当有色氨酸时 完整翻译短肽核糖体停留在终止密码子处 邻近区段2位置阻碍了2 3配对使3 4区段配对形成发夹结构终止子RNA酶在弱化子处终止 不能向前移动 如缺乏色氨酸 核糖体到达色氨酸密码子时由于没有色氨酰tRNA的供应停留在该密码子位置 位于区段1使区段2与区段3配对区段4无对应序列配对呈单链状态RNA聚合酶通过弱化子 继续向前移动 转录出完整的多顺反子序列 衰减作用的生物学意义从衰减机制的分析来看 它不仅能够把几种水平如DNA和RNA的构象变化 mRNA上内部终止 衰减 子的重建以及核糖体上tRNA对终止密码的识别等统一起来 严格控制表达 而且衰减子还可依细胞内某一氨基酸水平的高低而行止 所以它是一种应答灵敏 调节灵活的多重调控方式 就像在色氨酸操纵子中 阻遏作用与衰减机制一起协同控制其基因表达 显然比单一的阻遏负调控系统更为有效 一方面 当有活性的阻遏物向无活性阻遏物的转变速度极低时 衰减系统能更迅速地作出反应 使色氨酸从较高浓度快速下降到中等浓度 另一方面 若外源色氨酸浓度实在太低 细菌本身又没有其他的内源性色氨酸合成体系 以致细菌难以支持自身的生长时 就需要有衰减体系加以调节 通过不终止mRNA的合成来增加Trp酶的合成从而提高内源色氨酸的浓度 可见 衰减机制在控制基因产物的量和产物种类的配比上起着快速灵敏的调节作用 使操纵基因表达更为精密 高效 第四节 噬菌体基因组的表达调控 第五节DNA重组对基因表达的调控 在某些细菌中 特定基因的表达与基因组内DNA重排有关 如沙门氏菌具有运动鞭毛 它是由许多相同的鞭毛蛋白亚基装配而成 沙门氏菌含有两个不同的结构基因H1和H2 它们编码不同的鞭毛蛋白 H1基因表达则产生Hl型鞭毛蛋白 这时细菌就处于I相 Phasel 若是H2基因表达就产生H2鞭毛蛋白 细菌处于 相 Phase 处于I相的细菌生长时 其中少数细菌以103 每次细胞分裂的频率而自发转变为 相细菌 处于 相的细菌也以同样的频率转变为I相细菌 这一过程称为相变 phasewariation H2基因与另一个基因rH1紧密连锁 同属于一个操纵子 并协同表达 rHl编码Hl基因的阻遏蛋白 当H2和rH1表达时 由于rHl阻遏物阻止了H1基因的表达 就只合成H2鞭毛蛋白 如果H2基因和rHl基因被关闭不表达 这时H1基因便表达 合成Hl鞭毛蛋白 相变的控制取决于含H2和rHl基因操纵子的启动基因所处的状态 含有启动基因在内的上游DNA长995核苷酸对 两边各有一段长14核苷酸对的重复 即IRL和IRR H2基因的起始密码子开始于IRR右边的第17核苷酸对处 IRL和IRR之间的序列含有基因hin 它的产物是相变酶 可催化这段995核昔酸对序列发生包括hin基因在内的倒位 另外 在倒位前这段序列的第950一983核昔酸对区还含有一个促进下游基因转录的启动子 p 它使H2和rH1基因表达 于是细胞处于 相 当发生倒位以后 这个启动子便被移到序列的另一方 且方向改为朝左 H2和rH1失去启动子而失活 这时细胞内没有rH1阻遏蛋白 因而H1基因表达 细胞转变成I相 一旦这段DNA倒位依复原状 细胞又将转变为 相 沙门氏菌H1或H2基因选择性表达及其调控 这种鞭毛相的变化为何不能用基因突变来解释 因为第一这种变化只发生在两种鞭毛蛋白类型的相互转变 而沙门氏菌的鞭毛蛋白类型有十几种之