课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

微生物的培养与应用 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 尿素分子的立体结构 两个主要目的 1 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 2 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 土壤中的细菌之所以能分解尿素 是因为它们能合成脲酶 课题背景 一 筛选菌株 水生耐热细菌Taq Thermusaquaticus 耐高温的TaqDNA聚合酶美国微生物学科布鲁克 T Brock 1966年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现Taq耐热细菌 一 研究思路 原因 热泉中70 80 的高温条件淘汰了绝大多数微生物 使耐热的Taq细菌被分离出来 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基 从物理性质看此培养基属于哪类 固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源 氮源 碳源 葡萄糖 尿素氮源 尿素 培养基的氮源为尿素 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 以尿素作为氮源 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素 缺乏氮源而不能生长发育繁殖 而受到抑制 所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物 培养基选择分解尿素的微生物的原理 二 统计菌落数目 当样品的稀释度足够高时 培养基表面生长的一个菌落 来源于样品稀释液中的一个活菌 因此 恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键 统计菌落数目的理论依据 稀释涂布平板法 通过统计平板上的菌落数 就能推测出样品中大约含有多少活菌 为了保证结果准确 通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上 培养后再选择菌落数在30 300的平板进行计数 1 显微镜直接计数 不能区分死菌与活菌 2 间接计数法 活菌统计 设置重复组 第一位同学只涂布了一个平板 没有设置重复组 因此结果不具有说服力 第二位同学考虑到设置重复组的问题 涂布了3个平板 但是 其中1个平板的计数结果与另2个相差太远 说明在操作过程中可能出现了错误 因此 不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值 这个实例启示我们 在设计实验时 一定要涂布至少3个平板 作为重复组 才能增强实验的说服力与准确性 在分析实验结果时 一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致 结果不一致 意味着操作有误 需要重新实验 设置重复组的重要性 注意 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 这是因为当两个或多个细胞连在一起时 平板上观察到的只是一个菌落 因此结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示 显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法 每克样品中的菌株数 C V MC 某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V 涂布平板时所用的稀释液的体积 ml M 稀释倍数 三 设置对照 目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响 提高实验结果的可信度 究竟是哪个原因 可以通过实验来证明 实验方案有两种 一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验 如果结果与A同学一致 则证明A无误 如果结果不同 则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题 另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养 作为空白对照 以证明培养基是否受到污染 通过这个事例可以看出 实验结果要有说服力 对照的设置是必不可少的 一是由于土样不同 二是由于培养基污染或操作失误 或者是混入了其他的含氮物质 原因分析 二 实验设计 包括对实验方案 所需仪器 材料 用具和药品 具体的实施步骤及时间安排等的综合考虑和安排 从肥沃 湿润的土壤中取样 先铲去表层土3cm左右 再取样 将样品装入事先准备好的信封中 一 土壤取样 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 二 样品的稀释 样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目 在实际操作中 通常选用一定稀释范围的样品液进行培养 以保证获得菌落数在30 300之间 适合于计数的平板 测定土壤中细菌的数量 一般选用104 105和106倍的稀释液进行平板培养 测定放线菌的数量 一般选用103 104和105倍的稀释 测定真菌的数量 一般选用102 103和104倍的稀释 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量 选用的稀释范围相同吗 这是因为土壤中各类微生物的数量 单位 株 kg 是不同的 例如在干旱土壤中的上层样本中 好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万 放线菌数约为477万 霉菌数约为23 1万 因此 为获得不同类型的微生物 就需要按不同的稀释度进行分离 同时还应当有针对性地提供选择培养的条件 如果是第一次做这个实验 可以将稀释范围放宽一点 如可以将103 107倍的稀释液分别涂布到平板上培养 以保证能从中选择出菌落数在30 300间的平板进行计数 最终目的 保证获得菌落数在30 300之间 适于计数的平板 应在火焰旁称取土壤10g 在火焰附近称好的土样倒入锥形瓶中 塞好棉塞 特别注意 在稀释土壤溶液的过程中 每一步都要在火焰旁进行 实验时要对培养皿作好标记 注明培养基类型 培养时间 培养样品的稀释度 培养物等 三 微生物的培养与观察 不同种类的微生物往往需要不同的培养温度和培养时间 细菌 30 37 下培养1 2d放线菌 25 28 下培养5 7d霉菌 25 28 下培养3 4d 在菌落计数时 每隔24h统计一次菌落数目 选取菌落数目稳定时的记录作为结果 以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 一般来说 在一定的培养条件下 相同的培养基 温度及培养时间 同种微生物表现出稳定的菌落特征 这些菌落特征包括菌落的大小 形状 隆起程度和颜色等方面 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 300的平板 则说明稀释操作比较成功 并能够进行菌落的计数 如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大 表明试验不精确 需要重新实验 通过对照实验 若培养物有杂菌污染 菌落数偏高 若培养物混入其他氮源 则菌落形态多样 菌落数偏高 难以选择出分解尿素的微生物 结果分析与评价 四 课题延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中