金线莲组织培养的初步研究.doc

着江农林大学本科生毕业设计（论文）本 科 生 毕 业 设 计（论文）（ 2014 届）林业与生物技术学院题 目： 金线莲组织培养的初步研究 学 号： 201001010122 姓 名： 朱光夏 专业班级： 林学101 指导教师： 朱玉球 职称： 副教授 2014年 6 月 25 日11 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）金线莲组织培养的初步研究均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年 月 日金线莲组织培养的初步研究摘要：通过植物组织培养的方法研究金线莲快繁技术。用无菌的金线莲茎段作为外植体，经实验筛选出最适芽诱导培养MS6-BA 4.0mg/L2,4-D 0.4mg/LIBA 0.4mg/L马铃薯汁20g/L,经60天培养，芽增殖5.38倍;芽增殖培养基MSAD 3mg/L6-BA 3mg/LNAA 0.5mg/L蛋白胨3.0g/L蔗糖30g/L香蕉50g/L，经60天培养，每瓶新增芽30.25个;高增殖培养基MSAD 3.0mg/L6-BA 3.0mg/LNAA 0.5mg/L蛋白胨2.0g/L蔗糖30g/L香蕉100g/L，经60天培养，平均增高2.96cm；生根培养基 MSIBA 1.0mg/LNAA 1.0mg/L蛋白胨2.0g/L活性炭2.0g/L香蕉100g/L，培养60天，生根率达3.92。炼苗后移栽到腐殖土珍珠岩树皮泥炭土比例为4132的基质上，成活率达92%。关键词： 金线莲；组织培养；培养基；快速繁殖Preliminary Study on the Tissue Culture of Anoectochilus roxburghiiZHU GuangxiaAbstract：Its rapid propagation by tissue culture method of Anoectochilus roxburghii. Explants are asepsis stem segment of Anoectochilus. The culture mediums are made of MS6-BA 4.0mg/L2,4-D 0.4mg/LIBA 0.4mg/Lpotato 20g/L for the bud inducement, the proliferation rate reached 5.38 average after 60 days. MSAD 3mg/L6-BA 3mg/LNAA 0.5mg/Ltryptone 3.0g/Lsugar 30g/Lbanana 50g/L for bud proliferation, a bottle of new buds at 30.25 after 60 days. MSAD 3.0mg/L6-BA 3.0mg/LNAA 0.5mg/Ltryptone 2.0g/Lsugar 30g/Lbanana 100g/L for rapid growth, average 2.96cm increase in high growth after 60 days.MSIBA 1.0mg/LNAA 1.0mg/Ltryptone 2.0g/Lacticarbon 2.0g/Lbanana 100g/Lsugar 30g/L for rootage, the rooting rate reached 3.92 after 60 days. The surviving percentage of seedling is 92%on the medium of 4shares humus soil, 1 share perlite , 3bark and 2 peat soil. Key words: Anoectochus roxburghih; tissue culture; culture medium; rapid propagation目录前言11.1金线莲简介11.2生物学特性11.3金线莲组培研究现状22.材料与方法32.1材料32.2基本培养基配制32.3不同激素水平的芽诱导培养42.4不同添加物对芽、高增殖的影响42.5不同激素水平对根生长的作用42.6炼苗移栽43.实验结果和分析53.1茎芽诱导实验结果分析5表1 不同激素浓度对茎段发芽的影响53.2芽、高增殖培养实验结果分析6表2 不同添加物对苗高增殖的影响6表3 不同添加物对苗高增长的影响73.3生根培养实验结果分析7表4 不同激素浓度对生根的影响73.4组培苗移栽实验分析8表5 不同栽植基质对苗移栽成活率影响84.实验总结与讨论9致谢10参考文献10前言1.1 金线莲简介金线莲是兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)的多年生草本植物。别名金线兰、金丝草、树草莲、金钱仔草、金线虎头蕉、金线入骨消等1。是一种传统珍贵药材, 具有清热解毒、祛风利湿、滋阴润肺、降血压、平肝等功效2。全草均可入药，富含氨基酸、维生素、糖类、生物碱、有机酸、微量元素、黄酮等成分，在保护肝脏，预防癌症、糖尿病、心血管疾病和辅助抗肿瘤等方面有较好的作用3，有“金草”、“神药”、“药中之王”等美称4。金线莲株型小巧，叶形优美，叶脉金黄色，呈网状排列，是观赏价值极高的室内观叶珍品5。其分布于亚洲热带和亚热带地区及大洋洲。主要有中国、日本、印度、尼泊尔及东南亚各国。在我国主要分布在台湾、福建、浙江、广东、广西、江西、云南、贵州、四川、西藏南部、海南等省区6，其中以台湾、闽、浙为主产地。在自然界中，野生金线莲是许多动物喜食的植物以及遭到许多微生物的危害，同时自然条件的恶化，生态环境遭受严重破坏以及人为盲目采挖7，也导致金线莲野生资源日趋枯竭。正因为现存资源稀缺，药用价值极高，金线莲已被列为濒危珍贵药用植物。1.2 生物学特性野生金线莲一般生长在阴湿、遮光，土壤腐殖质丰富，空气相对湿度较大小环境，适宜温度20-25。多数学者认为在海拔300-1200m均有分布，尤以海拔300-600m的中低丘陵区分布较多。但刘贤旺等8发现其在江西的海拔500-1300m分布较多，张铁等9也发现分布于文山的海拔800-1600m的地方。 金线莲为多年生草本植物，高4-10厘米，根茎半匍匐。茎节明显，叶互生;叶柄基部呈鞘状，叶片卵形，长2-5厘米，宽1-3厘米，先端急尖，基部圆，上面有细鳞片状突起，下面暗红色，叶脉为金色。根系较短，根毛多而密。花茎长4-5厘米，具2-3朵花苞片卵状披针形，花淡红色，中警片圆形，先端骤尖，下面被长硬毛，与花瓣半卵圆形，偏斜，长7毫米，先端具长2毫米的骤尖唇瓣下部的爪(柄)长5毫米，爪部具多枚线状裂片，为梳状长5毫米，距囊状三角形，基部前子有2个疣状点起;雄蕊1，长圆形。花期3-6月。种子呈细小的粉状，种子由未发育的椭圆形胚及单层细胞构成的种皮所组成，发芽时必须有某种真菌侵入，将种子胚细胞中的淀粉转化为糖，才促进萌芽生长，是野生金线莲资源稀少、自然繁殖困难的重要原因之一7-9。1.3 金线莲组培研究现状近几年来，金线莲作为中医养生的佳品，其药用价值已受到了国内外研究机构及专家学者的普遍重视，开发研究工作取得一定进展。但是野生金线莲主要分布在福建、台湾浙江等少数省份，且现存的数量稀少，难以满足日益增长的市场需求。为了更好地保护和开发宝贵的金线莲资源，组织培养金线莲大大的提高了金线莲的生产水平，让金线莲能够批量的生产，其研究价值显而易见。随着生物技术的不断进步和成熟,越来越多名贵的花卉植物以及中草药通过组织培养的途径,迅速繁殖,打破原有漫长的自然生命周期,实现了工厂化生产。而合适的繁殖材料，适宜的生长环境和优良的培养基是组培成功的关键。目前，金线莲组培常用的材料是无菌的茎段。王建勤等11。将金线莲根状茎接入培养基后一周, 部分材料在根茎连结处的潜伏芽萌动膨大, 培养1315d 可观察乳白色主芽形成。试验结果表明不同浓度的激素对金线莲根状根茎芽的诱导效果不同, 在植物细胞分裂素6-BA与细胞生长素NAA不同浓度配比的培养基上芽的诱导效果有明显差异, 低浓度配比时均不能诱导金线莲根状茎发生芽。范子南5用金线莲茎节段在Ar培养基上进行诱导实验，获得芽增殖率为4.8。较高浓度的2,4-D（如2mg/L）,会引起苗褐变死亡。其组培苗栽植实验结果表明，在5月份进行组培苗炼苗栽植最适合。戴小英，朱恒12 用MS、MS、B5和WPM 4种培养基诱导金线莲茎段，结果表明MS培养基为最适基本培养基。黄德贵等13研究表明在单加NAA时，5个浓度中均以5ppm浓度的叶片、节数、苗高、生根数净增加值为最多，根生长长度最长；而在加0.3%活性炭的培养基中，上述5个项目的净增最高值均在NAA4ppm浓度中。在含有1、2、3、4、5ppmNAA的培养基上，培植体生长及根分化存在差异，五个浓度中均是补加了活性炭后叶片、节、根数净增值减少了，而苗高、最长跟的净增值却增高、增长。另外，活性炭对生长量的影响为：叶片数呈显著减少；节数、生根数为极显著减少；最长根根生长长度显著地增加；苗高度差异未达显著水平。同时，从试管秒的生长观察发现，由于节数的减少，叶片数、生根数相应地减少了。但添加活性炭，培养基培育的植株节间略长、生长较粗壮、叶片较浓绿、根粗长。在4ppmNAA加活性炭0.3%培养配方中苗高、跟生长长度净增值最大。在5ppmNAA培养配方中，叶片、节数、生根数净增值最大。添加IBA1ppm与2ppm，它们对苗生长速率和生根影响无显著差异。添加0.3%活性炭能显著或极显著影响培植体是的生长状况，植物增节数、生根条数显著低减少，并极显著地抑制培植体基部侧芽的萌生，但对gender生长长度却又促进作用。2. 材料与方法2.1 材料材料来自浙江农林大学组培实验室的台湾金线莲组培苗。2.2 基本培养基配制配制MS培养基所需的药品及剂量如下：大量元素(母液)配制1L 20倍的母液 mgNH4NO3 33000KNO3 38000CaCl22H2O 8800MgSO47H2O 7400KH2PO4 3 400微量元素(母液)配制1L200倍的母液KI 166H3BO3 1240MnSO44H2O 4460ZnSO47H2O 1720Na2MoO42H2O 50CuSO45H2O 5CoCl26H2O 5铁盐(母液)配制1L200倍的母液FeSO47H2O 5560Na2-EDTA2H2O 7460有机成分(母液)配制1L200倍的母液肌醇 20000烟酸 100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 20甘氨酸 4002.3 不同激素水平的芽诱导培养基本培养基为MS培养基（母液100 mL，母液、各10mL）,选取优质金线莲的无菌材料，在超净台无菌环境下，用剪刀去除根和叶片，将茎干截成长2.5cm带一个节的茎段。接种在MS6-BA 04mg/L2,4-D 00.6mg/LIBA 00.6mg/L培养基上，调节PH为5.8，添加马铃薯20g/L,琼脂4g/L。实验共设12个处理，每个处理接6瓶，每瓶接种4个节段。将接好的培养瓶放置在恒温室内，保持室温251，光照10h/d，光照强度8001000Lux。每隔一个月对发芽情况度进行统计（分化率= 发芽茎段数/接种茎段总数），及时处理发霉的培养瓶。2.4 不同添加物对芽、高增殖的影响基本培养基为MS培养基（母液50 mL，母液、A和B各10mL）。从茎段芽诱导发芽实验中选取生长势较好的金线莲小苗，在超净台无菌环境下，将小苗接种到MSAD 3mg/L6-BA 3mg/LNAA 0.5mg/L培养基上，调节PH为5.8，添加水解络蛋白胨13g/L，香蕉0100g/L，白糖2040g/L，琼脂4g/L 。实验共设9个处理，每个处理接种4瓶，每瓶接种7株（同一瓶接种的小苗长势尽量接近）。将接好的培养瓶放置在恒温室内，保持室温251，光照1012h/d，光照强度15002000Lux。每隔一个月对芽高度进行统计，及时处理发霉的培养瓶。2.5 不同激素水平对根生长的作用基本培养基为MS培养基。从增殖培养实验中选取长势良好的金线莲，在超净台无菌环境下，将苗的基部下端（约2cm长）切去，再转接到MSIBA 11.5mg/LNAA 0.51.5mg/L培养基上，调节PH为5.8，添加蛋白胨2g/L,活性炭2g/L,香蕉100g/L。实验共设6个处理，每个处理接种4瓶，每瓶接种6株。将接好的培养瓶放置在恒温室内，保持室温251，光照10h/d，光照强度1800Lux。培养60d后统计发根数和根生长状况。2.6 炼苗移栽金线莲移栽基质由腐殖土、珍珠岩、蛭石、树皮、泥炭土按照不同比例混合制成。在移栽一周前，将生根培养60d的组培从恒温组培室中拿出来，放到阳光不能直射的自然环境下炼苗。经710d的适应性炼苗后，用清水将培养基洗净，再用稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡10min，沥干后立即移栽（毛根暴露在空气中过久容易失水死亡）。栽植后用稀释1000倍的多菌灵溶液作为定根水浇透。每天喷雾3次，每隔2d浇水一次，2周后每周浇水一次，并用遮阳膜遮阴。3. 实验结果和分析3.1 茎芽诱导实验结果分析不同激素浓度下，金线莲茎段的发芽率和芽的生长情况有明显的差异。由表1可知，在不添加激素的MS培养基上金线莲茎段的发芽数明显偏少，且新芽的生长状况不佳。10号培养基的芽增殖数最高，经60d培养后达到了5.38。9号培养基次之，达到了5.08。其中，5号、8号和10号培养基诱导的芽长势较好，芽粗壮饱满，颜色墨绿，并有丛芽形成。空白对照组中茎段的芽分化率较低，添加了激素2,4-D和IBA后，茎段的芽分化率明显提高，甚至达到100%。并且发现在茎段接种时，选择基部24cm的茎段为材料诱导结果较优，茎段竖着斜插比横插发芽更快。本次试验总的污染率较低，说明此次金线莲无菌系建立的实验操作是规范有效的。综合以上分析，认为10好培养基为金线莲茎段芽诱导的最适培养基。表1 不同激素浓度对茎段发芽的影响培养基（mg/L）有效接种数发芽总数 分化率增殖倍数污染率芽生长状况6-BA2,4-DIBA （段） （个） （%） （%）CK000204173.62.0516.7(1)2.0 0.20166092.83.7533.3(2)2.0 00.2248888.33.670(3)2.0 0.20.424831003.460(4)2.0 0.40.6241061004.420(5)2.0 0.60.2208598.54.2516.7(6)3.0 0.20.6241041004.330(7)3.0 0.40.2241111004.630(8)3.0 0.60.42411495.64.750(9)4.0 0.20.2241221005.080(10)4.0 0.40.42412990.85.380(11)4.0 0.60.62411694.24.830注：表1为接种90d时发芽情况。表示芽细小，颜色黄绿；表示芽细小，颜色墨绿；表示芽粗壮，颜色墨绿；表示芽粗壮，颜色墨绿，有丛芽生长。3.2 芽、高增殖培养实验结果分析不同添加物对金线莲组培苗的增殖生长作用有所不同。由表2可知，培养30d后，7号、8号和9号培养基的苗芽增殖明显。其中8号组芽增殖最多，平均每瓶增殖新芽20.5个，9号次之，平均每瓶增殖新芽17.3个。2号和3号培养基的苗高增长快。其中，3号培养基高增长最快，平均增高1.44cm，2号培养基次之，平均增高1.33cm。经60d培养后，8号和9号培养基的芽增殖较明显。其中，8号培养基芽增殖最多，平均每瓶增殖新芽30.25个，9号次之，平均每瓶增殖新芽25.25个。2号和6号培养基的苗高生长量较大。其中6号培养基的苗高增长最快，平均增长量为2.96cm，2号培养基次之，平均增高2.82cm。从增殖系数看，8号培养基增殖系数最大，为4.32。综合分析，8号培养基为金线莲芽增殖培养最适培养基，即添加蛋白胨3g/L,白糖30g/L,香蕉50g/L最适合金线莲芽增殖；6号培养基为高增殖培养最适培养基，即添加蛋白胨2g/L,白糖30g/L,香蕉100g/L最适合金线莲高增殖。添加物蛋白胨对金线莲芽增殖的作用明显，而香蕉作为能量营养物质，对金线莲高生长作用显著。除此之外，增殖培养前期无论是高增长还是芽增长都较为缓慢，后期相同长度时间内，生物量大幅增加，甚至是前期的好几倍。表2 不同添加物对苗高增殖的影响 培养基添加物（g/L）接入时平均高度30天平均增长高度 60天平均增长高度污染率苗生长状况蛋白胨香蕉白糖 （cm） （cm）（cm）（%）(1)1.0 0302.550.611.925茎细，叶黄绿(2)1.0 50402.201.332.920茎粗，叶墨绿(3)1.0 100202.341.432.6112.5茎粗，叶墨绿(4)2.0 0402.610.992.250茎细，叶绿(5)2.0 50202.441.032.400茎粗，叶绿(6)2.0 100302.690.992.966.25茎粗，叶墨绿(7)3.0 0202.370.952.120茎细，叶黄绿(8)3.0 50302.521.042.590茎粗，叶墨绿(9)3.0 100402.130.892.8212.5茎粗，叶墨绿表3 不同添加物对苗高增长的影响 培养基添加物（g/L）30天平均发芽数 60天平均发芽数污染率增殖系数蛋白胨香蕉白糖（个）（个）（%）(1)1.0 0308.7522.33253.19(2)1.0 50401023.2503.32(3)1.0 100207.511.512.51.64(4)2.0 04012.7523.7503.39(5)2.0 502010.2524.7503.54(6)2.0 1003010.67296.254.14(7)3.0 02015.523.7503.39(8)3.0 503020.530.2504.32(9)3.0 1004017.325.2512.53.613.3 生根培养实验结果分析金线莲根生长缓慢，植株的发根情况和根的生长状况受激素的作用比较大，不同激素水平下，经60d培养后，生根总数在50100条之间，存在明显差异。由实验结果表4可知，接种在2号培养基上的组培苗发根条数最多，总数为94条，生根率达到了3.92。实验还发现低浓度激素条件下，金线莲苗的根系细长，根毛较多，根颜色为乳白色。随着激素浓度增加，根系变得粗壮，根长度伸长慢，根毛减少，跟颜色为黄绿色明显老化。除此之外，金线莲根尖容易坏死影响根的生长，加入活性炭有明显的改善作用，可能与改变根所受光照强度有关，或者与改变培养基理化性质有关。当培养瓶内的苗根系相互盘结，根伸长和茎叶生长速度明显比单株苗生长的速度快。因此，培养金线莲丛状根系可以加快植株的生长。表4 不同激素浓度对生根的影响培养基 60d每瓶生根数 生根率 根生长情况 （mg/L） （条） （%） MSIBA 1.0NAA 0.5 78 3.25 根细、长，根毛多 MSIBA 1.0NAA 1.0 94 3.92 根较细长，根毛多 MSIBA 1.0NAA 1.5 73 3.04 根较粗长，根毛多 MSIBA 1.5NAA 0.5 75 3.13 根粗、长，根毛少 MSIBA 1.5NAA 1.0 70 2.92 根粗、短，根毛少 MSIBA 1.5NAA 1.5 55 2.29 根粗、短，根毛少3.4 组培苗移栽实验分析将生根培养的组培苗经过炼苗后移栽在3种不同配制的基质上，存活情况和生长效果如表5所示。结果表明，2号栽植基质的苗存活率最高，苗生长快速，茎叶生长正常，明显优于1号和3号。3号基质中植株细长、基部叶子枯黄，可能与营养供给不足有一定关系。分析认为，金线莲栽植生长对基质的肥力、保湿能力、松软程度要求较高。适量增加腐殖土、树皮和泥炭土比例对其生长有利。其次，用蛭石的效果明显比珍珠岩好。在移栽初期，不定时对苗进行喷雾，使叶面保持湿润，能有效的提高植株移栽存活率。表5 不同栽植基质对苗移栽成活率影响基质 移栽成活率（%） 苗生长状况 3A2B3D2E 86.6 高生长快，茎绿色细长，基部叶子枯黄 4A1B3D2E 92 高生长快，茎墨绿粗壮，叶子正常 4A2C2D2E 54.8 高生长慢，茎页发黄，叶片曲卷注：A表示腐殖土；B表示蛭石；C表示珍珠岩；D表示树皮；E表示泥炭土4. 实验总结与讨论本次实验用无菌金线莲茎段作为外植体，通过不同激素浓度培养实验，得出金线莲茎段芽诱导最适培养基为：MS6-BA 4.0mg/L2,4-D 0.4mg/LIBA 0.4mg/L马铃薯汁20g/L。实验发现激素6-BA的浓度对芽诱导的作用明显。这与魏翠华，秦建彬等14用金线莲顶芽进行诱导，发现激素6-BA对金线莲芽诱导的作用最大的结论一致。孟志霞, 肖培根等15用3中不同细胞分裂素进行实验，认为6-BA 对金线莲芽作用较KT和ZT作用要强, 芽苗健壮。由表 1可知，激素2,4-D低浓度时，茎段发芽数量不断增加，随着浓度升高，茎段发芽数下降，并且开始出现愈伤组织。张宗良，王莉16在2,4-D黄独带芽茎段生长影响的研究中也有类似阐述。相同激素条件下，增殖培养实验的所选择的材料对实验结果有一定影响。未长叶的幼嫩植株更容易进行芽增殖，而已经开始分化茎叶和根芽的植株则更容易进行高生长。由表4可知，最适芽增殖培养基添加物为蛋白胨3.0g/L蔗糖30g/L香蕉50g/L;由表3可知，最适高增殖培养基添加物为蛋白胨2.0g/L蔗糖30g/L香蕉100g/L。添加了蛋白胨对芽增殖的效果明显。陈亚鸿，洪磊17等在秋石斛组培研究过程发现，添加一定量蛋白胨可以减少原球茎的褐化。从增殖培养基中3号、6号和9号的平均高生长量大，可以说明香蕉的作用高于蛋白胨和白糖。适当增加香蕉的量，可以提高金线莲植株的高生长速度。但是，王丽芳8在不同培养基添加物对金线莲生长影响研究中认为，高盐高糖环境添加香蕉对金线莲生长更有利。李艳冬，叶红霞18等认为添加20%以上香蕉，可以极大提高金线莲的生长。实验表明低浓度的IBA和NAA对金线莲根生长作用明显，高浓度会抑制根的生长。随着浓度增高，根系由细长变得粗短，并且根毛有所减少。除了不同激素对金线莲根生长有影响外，环境因素的影响也很大，如光照强度、培养基的理化性质等。适当的遮光处理可以促进根根的萌发。范子南等19等研究表明，培养基内添加活性炭能有效的促进根的生长。金线莲组培苗移栽一般在四、五月左右合适。从栽植实验存活率结果看2号优于1号和3号，1号优于3号。移栽基质中腐殖土和树皮对提高苗的存活力作用明显。主要原因是腐殖质和树皮配制的基质接近野生金线莲原生态生长环境。陈宗杰20的生根培养研究结果也证实了这点。除此之外，栽植组培苗前期要控制好环境的湿度，防止幼嫩叶片失水萎焉。金线莲嫩叶容易被蜗牛、毛毛虫等动物啃食，栽植后要定期喷洒除虫剂。致谢本次实验课题研究在导师朱玉球老师的精心的指导下完成。从论文立题，试验方案的设计，到论文写作和修改，每个环节都离不开朱老师的合理建议和耐心指导。老师严谨的治学精神，渊博的组培知识，宽容友好的态度和勤劳忘我的研究工作，这些无不让我对朱老师发自内心的尊重和敬佩，并将不断的激励我以后的学习和工作。导师不仅在学习研究上给了我很大帮助，在日常生活中也给予我无微不至的关心和帮助。在这毕业课题即将完成之际，我首先向朱老师表示我深深的感激之情，感谢导师在四年里对我倾注的大量心血和汗水。其次，感谢实验过程中一直协助我的高永霞学妹以及每一位帮助过我的老师和同学。是你们的帮助和支持，让我能够克服各种困难，顺利的完成毕业论文的实验研究。感谢浙江农林大学的亚热带植物实验研究重点实验室为我课题研究提供了优越的实验条件。最后