苏州大学分子生物学结业考试电子版.doc

二、1移动基因：又叫转位因子（transposable elements）,由于它可以在染色体基因组上移动，甚至可在不同染色体间跃迁，故又称跳跃基因（jumping gene）。2断裂基因：真核细胞的结构基因，其核苷酸序列中含有与氨基酸编码无关的DNA间隔区段，从而被分割成不连续的若干区域。将这种编码序列不连续，有间隔区段的DNA片断称为断裂基因4 重叠基因：不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。5 假基因：在珠蛋白基因簇各片段核苷酸序列分析时发现，除了有正常的功能基因之外，还有功能失活的特殊序列片段，它不能行使表达功能。该类核苷酸序列中存在的无表达功能的畸变核苷酸序列片段。7 基因组：表示某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物其配子的DNA总和即为一组基因组不同生物基因组数目不同。问答：1 什么叫做基因？何谓基因的新概念？基因的主要功能是什么?答：基因就是指编码有功能蛋白质多肽链或RNA分子所必须的全部核酸序列。所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。功能：编码蛋白质或者RNA分子基本遗传信息的基本遗传单位，是构成DNA的功能单位。3.何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明？答：四大里程碑：1944年Oswald报道肺炎球菌转化实验，明确遗传物质是DNA；1953年James waston和Francis Crick阐明了DNA双螺旋结构(半保留复制及其中心法则)；遗传密码子的破译；基因转移载体的发现。三大技术发明：工具酶的发明（内切酶、合成酶、连接酶）；基因合成和测序（合成仪、测序仪）；PCR技术（PCR扩增仪）。三、N.1基因表达：是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。2 启动子：是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录。3 终止子：位于一个基因编码区下游提供终止信号的DNA序列，可以被RNA聚合酶识别并发出停止mRNA合成的信号。4 起始密码子：编码多肽链的第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的其实密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用AUGGUG。5 终止密码子：有三个密码子（UAA, UAG，UGA），为终止密码子，只表示链的终止，不表达氨基酸。四、N1 锌指结构：由两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关。 2 亮氨酸拉链：存在与蛋白C末端，为两组走向平行.带亮氨酸的螺旋形成的对称二聚体，约为30个氨基酸，每两个亮氨酸之间隔有六个氨基酸，于是每两圈螺旋就有一个亮氨酸，排成一排，从而在2个-螺旋的蛋白分子之间形成一条拉链。3 RNA编辑：是mRNA转录后因插入，缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白。4增强子：是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，可独立存在与上游区、下游区或基因内部，可进行远距离增强启动作用，而且无方向性。问答1 真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？ 答：顺式作用元件有：启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。作用特点：是能够与DNA结合蛋白质结合的特定序列的DNA片段，决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应。2 真核表达调控的反式作用因子有哪些？其作用特点？答：反式作用元件：主要分为通用转录因子和转录调节因子两大类。作用特点：一，同一DNA序列可被不同蛋白质识别；二：同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系，多通过蛋白质-蛋白质先结合再影响DNA。三：蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA的结合，导致构象上细微的改变，从而发挥调控作用。四：反式作用元件在合成过程中有相当大的可变性和可塑性。五、名词解释：1 限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。2 同尾酶：有一些限制性核酸内切酶识别的碱基顺序不完全恒定，即识别顺序不同，但酶切后产生同样黏性末端的两种酶称为同尾酶，如BamH和Bgl 。 3 同裂酶：识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶 。如:Mbo 和Sau3A共同识别序列GATC ，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。 2 如何实现DNA粘性末端连接?单酶切点的连接如何降低本底和克服自我环化？答：用同一限制性内切酶对载体及外源DNA作相同消化，随后把这两种DNA混合起来，加入DNA连接酶，便可产生出稳定的杂种DNA。上述方法的缺点是限制酶切割产生的具有黏性末端的载体DNA分子 连接反应混合物中会发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构，使得只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大幅度上升。克服这一缺点的方法是：用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶（BAP或CAP），预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5/-P基团，于是在连接反应中，它自己的两个末端就再也不能被连接酶共价连接起来了。这样形成的杂种DNA分子的每一个连接位点中，载体DNA都只有一条链是外源DNA连接上的，而另外一条链由于失去了5/-P基团，不能作此连接，故留下一个具有3/-OH和5/-OH的缺口，尽管如此，这样的DNA分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞内完成缺口的修复工作。 六、名词解释：1.COS质粒，粘性质粒（Cosmid）带有噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用于构建基因文库。2.Cos位点（Cohesive-end site）： DNA为线状双链分子，两端各有几个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。3.COS细胞：用一个复制起始部位缺失的SV40突变种感染猴细胞，由于病毒DNA不能自主复制，便整合到宿主染色体DNA中，病毒DAN?,早期基因表达产生功能性的T抗原，这样的细胞就叫COS细胞。问答：1 基因重组是常用哪几种载体？其共同特点如何？ 答：常用载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、M13）、动物病毒；共同特征：自主复制易于扩增分离纯化有非必需区有单一酶切位点（多克隆位点）单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点；多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点有选择标记基因表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）2 作为理想的质粒载体有哪些基本条件？答：作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。九、名词解释：1 基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分, 通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株, 这种克隆株群体称基因组文库。2.cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA ）建立基因文库（gene library）。2.构建基因组文库的意义及构建过程如何？答：意义：提供全套遗传信息, 即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5端控制基因转录的调控序列, 内含子的分布和作用, 以及重复序列的数量分布及大小 过程： 分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA； 制备全部基因组的DNA片断。机械断裂法:用超声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端，因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoR,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。 DNA片断与载体的连接包装 常用载体：粘性质粒 噬菌体 酵母人工染色体基因组DNA +粘性质粒重组DNA转化细菌菌落 基因组DNA +噬菌体重组DNA包装成噬菌体感染细菌噬菌斑1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。3 构建cDNA文库的意义？常用载体及构建过程如何？答：意义：通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。它是发现新基因和研究基因功能的工具。常用载体是质粒（噬菌体）。过程：1.制备mRNA 1)取材：mRNA约占总RNA的15，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料；2)从总的RNA中分离mRNA：将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸 oligo(dT) 纤维素中进行亲和层析 2.第一股 cDNA合成 1）以Oligo(dT) 为引物：从模板3末端开始，沿模板的35方向合成, 对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA ；2）随机引物：以68个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）3.第二股cDNA的合成 自身引导法； 置换合成法； 外加引物合成法 4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞4 采用单酶切点法克隆基因时有什么缺点？如何克服？答：（1）高背景：载体经单一限制性核酸内切酶切割后，载体分子易于自我环化，既不利于目的基因的重组连接，大大降低阳性克隆效率，又可使非重组性载体造成高背景。应对方法：通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5-p以抑制DNA的自我环化。（2）双向插入：经单一限制核算内切酶切割的目的基因和载体，因两者的粘性末端是相同的，因此在连接反应中，目的基因可发生双向插入。载体对目的基因的表达是有方向的，而目的基因可双向与之连接，这种连接如以克隆目的基因片段为目的则没有影响，若以表达为目的，就要对插入的片段进行方向鉴定。应对方法：若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以使定向克隆。 十、1 转染：病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。2 转导：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。3 转化：以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化，常见的转化方法有：原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法2如何利用抗体标记基因筛选阳性克隆？答：大多数质粒载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄西林基因，抗四环素基因等，当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌能在相应抗生素的琼脂平板上生长，并形成菌落，而未被转化的原宿主菌则不能生长，据此可筛选携带外源基因的重组DNA转化子。在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA片段插入其中一个抗性基因，就会导致该抗性基因的功能失活，用两个分别含不同抗生素药物的平板进行对照筛选，可筛选出阳性重组子克隆菌体。3、如何从所克隆到的基因重组体载体中鉴定基因的存在和正确性？答：（1）重组子大小鉴别筛选：重组子中装有一段较大分子量的外源性基因，其分子量明显比原载体大很多，因此可将提取的重组载体和原载体，用一种限制性内切酶消化后，直接进行凝胶电泳，从而据其电泳特性而初步筛选重组子中是否插入外源基因片段。（2）酶切鉴定：对于筛选出的具有重组子的菌株，经小量培养后，再分别提取原载体或重组载体DNA，根据已知重组时外源基因两端的酶切位点，用相应的两种内切酶进行酶解，经琼脂糖电泳后，就可以看出载体中是否含有目的基因片段，以及有DNAmarker条带对比分析可得知插入基因片段的大小。（3）PCR筛选法：利用能与插入基因片段两端互补的特异引物，以少量抽提的重组子DNA为模板进行PCR分析，能扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子（4）原位杂交：在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置原位不变的转移到滤膜上，并在原位溶菌裂解，DNA变性和用特异探针进行杂交，从而鉴定出含有重组子的菌落或噬菌斑。十一、1.基因突变：是基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变（通常它只涉及基因中部分序列的变化），并引起个体表型的改变, 而使生物体发生遗传性变异。2.同义突变：是指碱基被替代后, 没有改变产物氨基酸序列, 这是与密码子的简并性相关, 如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位碱基互相替代后其编码表达的产物均为亮氨酸,因此这种突变不产生突变效应。 3.错义突变：是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的序列改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全失去活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变。 4.无义突变：某个碱基的改变可使某种氨基酸的密码子突变为终止密码子。如赖氨酸的密码子AAG突变为终止密码子TAG,使肽链合成过早终止, 因而蛋白质产物一般没有活性。若是发生在基因DNA的3末端处, 它所表达产生的多肽常有一定活性或有部分活性, 这种突变又称为渗漏变型（leaky mutation）。 二十、1、基因置换(gene reptacement)：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。但操作难度大，有伦理学问题。2、基因修正(gene correction)是指将致病基因的突变碱基序列得以纠正，而正常序列部分予以保留，使突变的致病基因恢复正常功能。即使致病基因的突变序列纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。 3、基因修饰(gene augmentation)则是指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。 4、基因失活(gene inactivation)就是应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制或阻止某些有害基因的表达。SiRNA的基因干扰可造成靶基因（异常基因）的失活（或沉默）。二十一、1、转基因动物：就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的子宫内, 使之发育成具表达目的基因的胚胎动物, 并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体。 3、动物克隆：动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。4、基因敲除：是向正常生物个体内引入某个突