高效液相色谱法简介及应用.doc

学习资料收集于网络，仅供参考高效液相色谱法简介及应用摘要：综述高效液相色谱法的分析原理和特点，简介高效液相色谱仪的基本构造，评述高效液相色谱法在食品分析中的应用研究进展，并对其应用前景进行了展望。关键词：高效液相色谱法；食品分析；应用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography）又称为高压液相色谱（High Pressure LiquidChromatography）、高速液相色谱（High Speed LiquidChromatography）、高分离度液相色谱（High ResolutionLiquid Chromatography），是20 世纪60 年代末70 年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断地改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段1。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。本文简要介绍高效液相色谱法的分析原理和特点，高效液相色谱仪基本知识，重点评述其在食品分析中的应用。1 高效液相色谱法的分析原理和特点1.1 高效液相色谱法的分析原理高效液相色谱法是在经典液相色谱法基础上发展起来的。高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程,它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离2。1.2 高效液相色谱法的特点从分离原理上讲，高效液相色谱法和经典液相色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，因而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。经过近30 年的发展，现在高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，都达到了与气相色谱相媲美的程度，并保持了经典液相色谱法对样品适用范围广、可供选择的流动相种类多和便于制备色谱的优点。其优点概括如下：采用高效微粒固定相使色谱分离效能大大提高；采用新型高压输液泵使分离时间大大缩短；采用高灵敏度的检测器使仪器的检测灵敏度大大提高；由于HPLC 具有高柱效、流动相可以控制和改善分离过程的特点，故其选择性高。2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪的主要部件有：贮液罐、高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置。其基本的工作流程是：贮液罐中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。2.1 贮液罐贮液罐的材料应耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）。容积为0.5 L2.0 L。对凝胶色谱仪、制备型仪器，其容积应大些。贮液罐放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。在使用过程中贮液罐应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，还可防止空气中氧气和二氧化碳重新溶解于已脱气的流动相中。2.2 高压输液泵高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵。对高压输液泵的要求是。1）泵体材料能耐化学腐蚀。通常采用普通耐酸不锈钢或优质耐酸不锈钢。2）能在高压下连续工作。通常要求耐压40MPa/cm50MPa/cm 能在8h24h连续工作。3）输出流量范围宽。4）输出流量稳定，重复性高。2.3 色谱柱色谱柱包括柱管和固定相两部分。柱壁材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内壁光滑的聚合材料的其它金属。一般色谱柱长5 cm30 cm，内径为4 mm5 mm，凝胶色谱柱内径为3 mm12 mm，制备色谱柱内径较大，可达25 mm 以上。2.4 检测器高效液相色谱法中的检测器主要用来监视经色谱柱分离后的组分随淋洗液流出的浓度变化，所描记的图形用于进行定性和定量分析，因此，要求检测器应该具有灵敏度高、重复性好、线性范围宽、适应范围广、对流量和温度的变化不敏感等特性。常用的检测器为紫外吸收检测器（UVD）、折光指数检测器（RID）、电导检测器（ECD）和荧光检测器（FD）。在高效液相色谱中没有通用检测器，实际应用时按需要和结合各种检测器的特点进行选择应用。3 高效液相色谱法在食品分析中的应用3.1 在乳品分析中的应用乳及乳制品的质量评价比较复杂，包括营养成分及含量、乳品的风味物质、药物残留和毒物种类及含量等多个方面，HPLC 法可用于乳品中多种质量控制指标的检测。乳及乳制品中富含糖、脂、蛋白质、维生素等营养以及强化的营养物质，HPLC 技术几乎可用于各种营养成分的检测。在低分子糖类的测定中多采用氨基键合柱、糖类分析专用柱进行分离，也有研究者利用低成本非特定色谱柱测定低分子糖，如Mullin 等3通过树脂柱分离，脉冲安培检测器测定奶酪和牛奶中的乳糖等并取得良好的效果。在氨基酸的检测中，苗红等4利用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸脂柱前衍生氨基酸，Nova-Pak C18 色谱柱，乙腈磷酸缓冲液梯度洗脱，紫外UV248 nm 测，可同时准确测定奶粉中Lys、Met、Asp 等16 种氨基酸。丁晖等5用YWG C18 色谱柱，甲醇乙酸胺为流动相，紫外检测器230 nm 处测定了AD 奶和活性乳中的山梨酸和苯甲酸含量。张春燕等6 采用ORH-801 型有机酸专用色谱柱，以浓度0.01 mol/L 硫酸溶液为流动相，用折光检测器对全脂奶粉和酸奶中乳酸与乳酸盐进行测定，最低检测限可达1.5310-10 kg。随着分离柱的不断改进高灵敏度的检测仪器的引入，HPLC 法已深入到乳品分析中的方方面面。相信在不久的将来HPLC 法将在乳品工业中发挥更大的作用。3.2 在肉制品分析中的应用HPLC 法可以测定肉制品中的兽药残留、致癌物质含量等。腌腊肉品中常添加硝酸盐或亚硝酸盐作发色剂用，由于添加量过大或自身的还原作用在肉品中生成N-亚硝胺。N-亚硝胺可诱发肝癌、结肠癌等。过去采用气相色谱法测定食物中挥发性亚硝胺，其中仅色谱测定一步便需耗时1 h 之多，而采用高效液相色谱法则只需要13 min 左右。张辉7应用岛津LC-4A 高效液相色谱仪测定肉类抗生素残留量，对色谱分离实验参数，包括色谱柱、流动相配比、缓冲液、pH、温度、检测波长等，进行了系统的试验，使肉类食品中的四环素、土霉素和金霉素能够同时分离和定量测定。乔坤云8建立了用HLPC 测定鸡肝中土霉素、金霉素、四环素方法。中国农业大学动物医学院赵思俊等9通过研究建立了同时检测动物肌肉组织中环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸、氟甲喹7种喹诺酮类药物的HPLC-FLD 检测方法。河南农业大学牧医工程学院张素梅等10建立了牛肉中替米考星残留的HPLC 检测方法,结果可靠。3.3 在其它食品分析中的应用HPLC 可以广泛地用于检测食品的农药残留，食品中过量的食品添加剂，食品中违禁成分；也可用于食品中营养成分的分析。沈向红等11建立了用HPLC 测定保健食品中人参皂甙的方法。彭锦峰12建立了用高效液相色谱测定食用香菇中甲醛的方法。许龙福13建立了用HPLC 同时测定饮料中对羟基苯甲酸乙(丙) 酯及咖啡因的方法。王帆等14建立了保健食品中大豆异黄酮的高效液相色谱检测方法。叶赛等15应用高效液相色谱-串联质谱法测定海水中的氯霉素残留量, 流动相为V（甲醇）V（水）=8020。樊金玲等16利用高效液相色谱与质谱联用技术研究了牡丹花中的花色苷类化合物，分离检测了5 种花色苷，结合紫外吸收光谱和质谱信息分别确定了具体类型。广东省深圳市疾病预防控制中心仲岳桐等17建立了应用高效液相色谱-质谱联用技术测定蛋类食品及蛋制品中的苏丹红四号的方法，测定结果准确。国家大豆深加工技术研究推广中心李丹等18利用高效液相色谱电喷雾质谱联机技术准确的分析了黑豆中异黄酮的种类和含量。HPLC 可测定氨基甲酸酯农药、有机磷农药、百草枯、杀草快、草甘膦及氨基膦酸、苯并咪唑类杀菌剂、利谷隆(linuron)、灭草隆(monuron)及敌草隆(diuron)、三嗪类农药等。苯并咪唑类杀菌剂残留的多残留分析亦可采用HPLC 方法。韩灏等19建立了高效液相色谱法测定饮料类食品中的类雌激素的方法。4 小结高效液相色谱法是吸纳了经典液相色谱法和气相色谱法的优点进行改进和发展起来的现代分析方法，具有分离速度快，测效率高，重现性好的特点。近年在食品分析上应用后，扩大了检测范围，提高了分析水平，尤其对食品中残留的微量、痕量有毒有害物质能快速准确地分析出来，进一步提高了食品卫生质量，保障了食品安全和人民身体健康，促进了食品出口。随着食品工业的发展，人们对食品安全的关注，以及高效液相色谱分析技术的进一步完善，相信其在食品分析中的应用将会更加广泛。参考文献：1 于世林.高效液相色谱法及应用M.北京:化学化工出版社,2000：3-102 黄国宏.高效液相色谱技术在食品分析中的应用J. 食品工程,2006(4):47-513 MULLIN W J，EMMONS D B. Determination of organic acids andsugars in cheese,milk and whey by high performance liquid chromatographJ. Food Res Int,2009,30(2):147-1514 苗红,杨涛,霍君生,等. 柱前衍生高效液相色谱法测定食物中的氨基酸含量J.分析化学，2008,28(9):1091-10955 丁晖, 刘艳琴.HPLC 测定含乳饮料中的山梨酸和苯甲酸含量J.现代科学仪器，2008(20) :32-336 张春燕，房玉国，鄂来明.乳品中乳酸及乳酸盐的测定J.中国乳品工业,2001,29(2):31-337 张辉. 高效液相色谱法测定肉类食品中四环素的抗生素残留J.理化检验-化学分册,2009,40(10):609-708 乔坤云. HPLC 分析测定鸡肝中土霉素、金霉素、四环素方法J.中国卫生检验杂志,2009,13(5):610-6119 赵思俊,李存,江海洋,等.高效液相色谱检测动物肌肉组织中7 种喹诺酮类药物的残留J.2007,35(2):786-79010 张素梅,杜向党,吴宁鹏,等. 牛肉中替米考星残留的高效液相色谱检测方法研究J. 黑龙江畜医,2010(7):82-8411 沈向红,任一平,陈翊.HPLC 法测定保健食品中人参皂甙的研究J. 中国卫生检验杂志, 2009,13(5):600-60112 彭锦峰,刘景富,吕爱华,等.HPLC 法测定食用香菇中的甲醛J.分析试验室,2005,24(4):57-5913 许龙福.HPLC 同时测定饮料中对羟基苯甲酸乙(丙) 酯及咖啡因J.预防医学文献信息,2009(9):59-6014 王帆,胡小钟,匡建军.高效液相色谱法检测保健食品中大豆异黄酮含量J. 分析测试学报, 2010,22(6):66-6915 叶赛,胡莹莹,张奎文,等.高效液相色谱-串联质谱测定海水中氯霉素残留量J. 分析试验室,2007,26(2):22-2516 樊金玲,朱文学,沈军卫,等