2010CB912200-基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群的功能及作用机制研究.Doc

项目名称：基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群的功能及作用机制研究首席科学家：尹玉新 北京大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容（一）拟解决的关键科学问题面对我国生命和健康科学的重大需求和癌症等重大疾病研究的挑战，结合我们前期的研究基础，本项目将围绕遗传物质稳定性这一中心课题，选择细胞周期调节的各个环节，从蛋白质群入手解决如下关键科学问题：1. 蛋白质群在细胞生长分裂过程中细胞周期各个阶段的调控机制和相互作用。相关的信号传导通路在细胞增殖过程中如何维持遗传物质的稳定性。细胞异常增殖过程中相关蛋白质群的变化规律及其对细胞周期和基因组稳定性的影响。2. PTEN在有丝分裂过程中调节蛋白质群的机制。抑癌基因PTEN与p53通路之间的蛋白质网络群的联系。细胞增殖和凋亡的分子调控机制，Hippo信号通路及微管结合蛋白在其中发挥的作用。（二）主要研究内容1. 研究真核细胞DNA复制及检验点维持遗传物质稳定性的机理，确定DNA复制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及阐明它们的生化功能；大规模确定新的DNA复制蛋白；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理以及Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用；从G1、S期细胞中鉴定新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群，并挑选适当的功能基因或蛋白，在细胞水平和整体水平（动物模型）分析、验证，且探讨其机制及意义。 2. 检测有丝分裂期间PTEN及其调控的蛋白质群的作用机制，鉴定更多PTEN调节的与有丝分裂相关的蛋白质群；检测PTEN与这些蛋白质群的物理性相互作用；通过基因敲除小鼠模型和转基因小鼠模型评价有丝分裂破坏与肿瘤发生的关系；深入探讨PTEN与p53调节的蛋白质群之间的分子网络。3. 以癌症和衰老模型为主要研究对象，对前期已鉴定出的，与癌症发生或转移及衰老密切相关蛋白进行生物学功能及蛋白质糖基化修饰研究，探究其相互作用和信号转导途径，从蛋白质水平上揭示肿瘤或衰老细胞增殖异常的分子机制。研究调控细胞周期G1和M期的新蛋白Mig-2，通过对其所调节蛋白质群的相互作用研究，揭示其调控细胞周期和肿瘤侵袭性生长的分子机制。4. 筛选Hippo通路上游调节蛋白及下游靶基因，探索该通路已知蛋白之间的动态互作及通路激活机制，检测Hippo通路核心蛋白调控细胞增殖与凋亡，进而影响基因组稳定性的分子机制；探索Hippo信号通路与PTEN以及Rassf、EB1和CYLD等微管结合蛋白之间的关系，解析上述各蛋白协同或独立调控细胞增殖与凋亡、影响基因组稳定性的分子机理。二、预期目标（一）总体目标瞄准国家战略需求和国际肿瘤相关科学研究前沿，从与遗传物质稳定性相关蛋白质群这一关键科学问题出发，在细胞周期的各个环节探讨相关蛋白质群的分子调控机制以及相互作用网络。在此基础上，鉴定一批新的与细胞正常、异常增殖调控相关的蛋白质群，建立全细胞水平的细胞周期相关蛋白质数据库；确定一些与维持遗传物质稳定性相关的关键蛋白质群的结构、功能、相互作用和一些重要靶蛋白的动态调控机制，并研究它们的信号调控网络。此外，还将探索一些与细胞周期失调后决定细胞命运的信号通路调控细胞增殖和凋亡的分子机制。通过本课题的实施将使我国在细胞周期调控相关蛋白研究的相关领域达到或领先国际水平。同时，以本项目的实施为契机, 促进蛋白质组学、生物学、医学、生物信息学等多学科研究的衔接和集成，培养一批交叉学科新型研究队伍。（二）五年目标1. 确定DNA复制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及阐明它们的生化功能；大规模确定新的DNA复制蛋白；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理以及Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。鉴定G1、S期细胞中新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群及其机制和意义。2. 评价PTEN及其调控的蛋白质群在控制有丝分裂中的作用并且探讨PTEN对这些蛋白质群的表达调控和物理相互作用，鉴定更多与有丝分裂调控相关的蛋白质群。揭示抑癌基因PTEN与p53之间的分子网络，为临床诊断和化疗提供理论基础。3. 揭示蛋白质群在肿瘤发生和转移及衰老中的生物学功能，着重研究调控细胞周期的新蛋白Mig-2的信号传导通路，通过对其所调节的蛋白质群的研究，揭示其调控细胞周期的分子机制。通过稳定同位素标记建立细胞核蛋白质动态表达分析鉴定的实验方法，并由此获得新的标志蛋白；针对所发现的新的相互作用蛋白，验证其与靶蛋白的相互关系并确定其生物功能并鉴定出关键核蛋白质修饰类型与可用于新药开发的重要靶标，并探讨其在肿瘤治疗、延缓衰老和保护细胞方面应用的可能性。4. 阐明Hippo通路各组成分子间相互作用机制，鉴定新的靶蛋白及其在Hippo通路中的作用；鉴定Hippo通路上游分子和分析通路激活机制；揭示Hippo信号通路核心分子对基因组稳定性的调控机制；分析CYLD和EB1等微管结合蛋白调节细胞增殖与凋亡的分子机制；探讨Hippo信号通路与微管结合蛋白质群的关系及其在调控细胞分裂和诱发凋亡中的作用。5. 取得具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文50篇以上。其中，在影响因子大于10的刊物发表15-20篇，培养一批从事肿瘤基础研究和转化医学的交叉学科人才。三、研究方案（一）总体研究思路、技术路线及可行性分析1. 总体研究思路在细胞增殖过程中遗传物质的稳定性有赖于细胞周期的系统调节，DNA的精确复制和DNA损伤的修复。蛋白质群在此过程中的相互作用使细胞周期的精密调控成为可能。机体通过细胞周期调控维持基因组稳定性，这一过程是经由细胞周期的各个环节实现的。细胞周期分为G1、S、G2和M期，研究细胞周期的调控应该分解到细胞周期自然过程的各个环节中。细胞周期调控的正常进行以及遗传物质的稳定性与肿瘤的发生以及衰老等生命重大事件密切相关。因此，鉴定参与调控细胞周期各个环节的蛋白质群并且评价这些蛋白质群在调控细胞周期的各个阶段、维持基因组稳定性中所发挥的作用机制以及蛋白质群之间的相互作用对于癌症等重大疾病研究至关重要。对我们认识与了解这些疾病发生的机理，有效防治这些疾病具有重大意义。基于以上思路，本课题重点围绕细胞周期的各个环节相关蛋白质群开展研究，阐明这些蛋白质群在细胞周期各个时期：DNA复制、合成、有丝分裂期的调控机制。评价蛋白质群对于细胞周期调控正常进行，维持遗传物质稳定性中的作用。在此基础上，我们将利用一个大型高通量蛋白质分析平台，大规模鉴定和分析与细胞周期调控和维持基因组稳定性相关的蛋白质群，探究其相互作用蛋白和信号转导途径。此外，我们还将研究多细胞生物如何处理细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况下而对细胞命运进行调节，探讨细胞生存、死亡与遗传物质稳定性的综合关系，即在细胞周期失调、基因组不稳定的情况下通过何种机制调控细胞命运，对细胞生存和死亡进行决断。这将不仅阐释机体清除癌细胞的机制，还将为癌症治疗提供更多的靶向药物选择。附图：主要技术途径流程图2. 技术路线根据我们的学术思路，本项目的总体研究技术途径如附图所示。研究细胞周期的各个时期相关蛋白质群的结构、功能、调控机制和相互作用，并且阐述细胞正常增殖过程中遗传物质稳定性的维持。还将研究细胞异常增殖中蛋白质群的变化和细胞凋亡的程序控制。主要途径为：【课题一】用遗传的方法筛选Sap1温度敏感株的抑制蛋白；直接从细胞内分离Sap1的蛋白复合体；用蛋白亲和层析的方法分离Sap1的相互作用蛋白。并用生化，遗传及荧光单分子技术阐明一些已知及一些新确定的DNA复制蛋白的生化作用机理；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理以及Cds1-Dna2的检验点通路，用基因干扰技术（RNAi）揭示该通路相关的检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。采用基因表达谱芯片或蛋白组学的方法，与课题二和课题三合作，筛选受GSK-3调控的基因或蛋白质群，鉴定G1、S期细胞中新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群并且探讨其机制和意义。【课题二】确定PTEN在维持有丝分裂检验点中的重要地位，利用基因芯片技术鉴定出新的PTEN调节基因群并且深入了解其调控机理。采用染色质-免疫共沉淀（Chromatin-Immunoprecipitation, ChIP）方法确定PTEN与染色质之间的相互作用从而探讨PTEN调控其靶基因表达的机理。利用蛋白质Pull-down分析系统大规模鉴定与PTEN相互作用的有丝分裂相关的蛋白质群。通过传统的蛋白质-蛋白质相互作用实验（IP-western）、定向诱变、荧光素酶分析等方法检测PTEN与这些新鉴定出的有丝分裂相关蛋白质群的物理性相互作用，利用课题组三的蛋白质分析平台鉴定PTEN与这些蛋白质群物理性相互作用的结构域及蛋白质修饰位点。通过建立小鼠动物模型从活体角度综合评价PTEN通路以及相关蛋白质群在调节有丝分裂进程、维持遗传物质稳定性的重要性。最后利用这一动物模型揭示抑癌基因p53与PTEN的分子网络关系及其在抗癌过程中的作用。【课题三】以癌症和衰老模型为主要研究对象，探讨在细胞异常增殖过程中相关蛋白质群，如Mig-2信号通路的变化规律。通过对目的基因进行表达干预（过表达或沉默），从体外到体内深入研究候选蛋白质群对细胞增殖、细胞周期调控的影响。结合信号通路的特异性抑制药物等分析目的基因表达干预后导致的新差异蛋白及所涉及的信号通路。采用TAP技术并结合质谱分析筛选和鉴定出差异蛋白的相互作用蛋白或蛋白复合体。利用稳定同位素标记并结合高灵敏度的生物质谱鉴定技术，研究细胞核蛋白质和DNA片段上的修饰类型、修饰位点，阐明其信号转导机制及其在衰老过程中的功能。采用在体鉴定快速肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的实验系统，提高甄别在细胞周期中调控异常增殖蛋白质群的效率。选择调控细胞异常增殖的代表性新蛋白，建立其与肿瘤病人的相关性。【课题四】研究Hippo信号通路调控细胞增殖和细胞凋亡的分子机理，揭示Hippo信号通路核心分子对基因组稳定性的调控机制，分析Hippo信号通路蛋白与微管结合蛋白的关系及其在调控细胞增殖和凋亡中的作用。在全基因组水平上通过干扰基因的表达（RNAi）筛选Hippo调节蛋白质群，并结合微阵列分析鉴定Hippo通路新的靶基因集团；通过上位分析（epistasis）和IP-Western等方法在体内与体外研究Hippo通路组成分子间的动态互作；通过质谱分析鉴定蛋白修饰，特别是磷酸化修饰调控Hippo通路的分子及生物学意义；系统分析Hippo通路蛋白质组群在细胞内的定位情况及转位意义；分析CYLD和EB1等微管结合蛋白与有丝分裂、细胞增殖以及基因组稳定性之间的关系；通过蛋白共定位研究探讨Hippo通路与PTEN调节基因组稳定性的关系，从而探讨多细胞生物在细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况下如何对细胞命运进行调节。各课题组还将充分利用课题组三具备的大型蛋白质鉴定分析技术平台对更多参与维持基因组稳定性的蛋白质群进行大规模鉴定和分析。3. 可行性分析(1) 本项目的科研队伍以从事生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学等国家和部门重点实验室、教育部985创新平台为主体，集中了目前从事基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群研究的优势科研团队。其中，各课题负责人都是本领域的专家，亲自设计各自的课题并将指导项目的具体实施。(2) 本项目着眼于大规模蛋白质组（群）而非单个蛋白的研究。2007年10月召开的国际蛋白质组学组织大会标志着从大规模技术性研究向差异和动态组学研究的趋势。但迄今已有的技术几乎都限于检测和比较蛋白的累积量。课题三近期自主建立的SiLAD 技术对蛋白真正表达水平差异的测定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用稳定同位素同时掺入细胞核蛋白质和DNA上新添甲基的系统研究方法已成熟地用于本课题相关模型的研究中。这些新技术方法都是针对细胞调控中的蛋白质组（群）动态研究而开发的。本研究具备扎实的前期研究工作基础和创新技术平台，以及用于功能研究的基因敲除动物模型和高精确度的质谱分析鉴定蛋白质动态表达和蛋白质修饰平台。良好的工作基础和强大的蛋白质组学技术平台为本课题研究计划的顺利进行提供了有力的保障。(3) 参加本项目研究的各实验室具备优良的研究条件。同时，各课题间早已经形成了紧密的协作关系，各方面的研究相互交叉、组成了一个有机的整体。课题二中建立的基因敲除小鼠模型以及转基因小鼠模型在国际上也具有领先地位，为其他课题顺利实施提供了珍贵的活体动物模型。课题三的高通量蛋白质鉴定和分析平台为其他各个课题组的研究分析提供了可靠、高效的技术平台。（二）创新点1. 本项目瞄准国际前沿，面向国家需求，综合利用多学科优势，集中针对遗传物质稳定性相关蛋白质群的分子调控网络和相互作用，展开多层面更又互相关联的研究。2. 本项目将细胞周期的各个时期有机地整合在一起，通过研究各个环节相关的蛋白质群及其调控和相互作用机理而探讨这些蛋白质群对细胞周期调控的分子机制，评价其作为有机整体和分子网络对遗传物质稳定性的相关性，在此基础上大规模鉴定和分析与细胞周期调控相关的各种蛋白质群，并探索这些蛋白质群之间的相互作用，构建与细胞周期调控和基因组稳定性维持相关的蛋白质组分子调控网络。此外，还进一步研究当细胞周期失调发生遗传物质不稳定后，多细胞生物作为有机整体利用何种机制对细胞命运进行决断，从而综合性评价细胞周期调控与基因组稳定性的内在联系和相关蛋白质群的功能和相互作用。3. 本项目在研究内容方面具有完全创新性：孔道春实验室在裂殖酵母S. pombe发现了DNA复制起始蛋白Sap1，他们证明Sap1是DNA复制起始蛋白Cdc18结合到DNA复制源上所必需的。康铁邦教授在细胞周期和DNA损伤检测点中，发现了一条新的调控通路（GSK-3-Cdc25A），该通路在G1、S期和G1-S期转换中起关键作用。尹玉新课题组研究设想PTEN对细胞周期有丝分裂形成独特的调节，而这种调节在国际上也是全新发现。张宏权课题组发现跨膜受体整合素结合蛋白Mig-2是细胞跨过有丝分裂中期（Metaphase）所必须的，并证明这一作用是通过一个全新的Mig-2ILK信号通路调控的。肖雪媛和纪建国课题组以肿瘤和衰老为实验模型，研究新发现的与细胞增殖异常相关蛋白的生物学功能及组蛋白修饰变化规律。而以此为基础构建靶蛋白表达干预后的交替多轮差异蛋白筛选策略。4. 本项目在研究方法方面也具有独到之处，在国际上处于领先水平。尹玉新课题组在多年的研究基础上，发展了一系列体内、体外活体研究模型，例如小鼠基因敲除模型系统：他们已经成功敲除PAC1基因（p53下游的一个重要基因）并且建立了一系列PTEN条件基因敲除knock-in模型，通过这些模型检测PTEN在肿瘤发生过程中如何调节有丝分裂，研究PTEN与相关蛋白质群作用，而这些作用可与特定小鼠模型的肿瘤发生直接关联，从而更加直观地评价PTEN调控有丝分裂的作用与肿瘤发生有无直接关系。此外，他们正在建立转基因小鼠模型预测某些重要蛋白过度表达是否可促进肿瘤发生。张宏权课题组首次在斑马鱼模型中建立了在37天内在体鉴定肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的实验系统，为增殖异常的肿瘤细胞进行大规模体内评价提供了快速、经济和方便的最新方法。肖雪媛课题组则首次提出使稳定同位素同时掺入细胞核蛋白质和DNA上新添甲基的系统研究方法，从而可以快速、定量鉴定表观遗传修饰的动态变化，这将有助于组蛋白修饰密码及其作用机制的确定。（三）课题设置课题一：真核细胞DNA复制机理及细胞周期检验点在维持遗传物质稳定性中的作用研究目标：本课题将研究真核细胞DNA复制及检验点维持遗传物质稳定性的机理，确定DNA复制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及阐明它们的生化功能；确定人细胞的Sap1同源蛋白；大规模确定新的DNA复制蛋白；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理；阐明Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。阐明Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持复制叉稳定的作用；鉴定G1、S期细胞中新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群及其机制和意义。研究内容：1. 确定Sap1的相互作用蛋白和人细胞的Sap1同源蛋白并阐明它们的生物功能和生化作用机理。采用下面三种方法确定Sap1相互作用蛋白。一是用遗传的方法筛选Sap1温度敏感株的抑制蛋白；二是直接从细胞内分离Sap1的蛋白复合体；三是用蛋白亲和层析的方法分离Sap1的相互作用蛋白。2. 确定新的DNA复制蛋白在裂殖酵母S. pombe, DNA复制起始蛋白Cdc18的高表达导致DNA重复复制并最终使细胞死亡。如果另一个复制蛋白由于突变使得它的活性降低，该蛋白就能拮抗Cdc18的高表达导致的DNA重复复制从而使细胞能存活。用该方法已经筛选到了几百个突变株，现正确定它们的突变基因，并进一步与课题组三合作，利用高通量蛋白质鉴定分析平台研究新的DNA复制蛋白的相互作用及其生物学功能。3阐明Cds1-Dna2的检验点通路已发现Dna2能防止停顿的DNA复制叉倒转，也发现Cds1调控Dna2和DNA的相互作用，但Cds1和Dna2不直接相互作用。这暗示Cds1通过调控另一个蛋白达到促使Dna2结合到DNA上。采用生化和遗传的方法确定该蛋白，并最终阐明Cds1-Dna2的检验点通路。4鉴定新的GSK-3底物，及其机理和调控机制本课题组最近发现，在DNA损伤时GSK-3在S期的调控中也起重要作用。将用基因表达谱芯片或蛋白组学的方法，鉴定新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群，并挑选适当的功能基因或蛋白，在细胞水平和整体水平（动物模型）进行分析、验证，并探讨其作用机制及意义。同时，本课题组还发现GSK-3可能通过磷酸化Cdh1调节APCCdh1的活性，从而调控有丝分裂的过程。本课题拟鉴定Cdh1在体内、外被GSK-3磷酸化的位点；探讨GSK-3和Cdh1在细胞周期调控、DNA损伤修复中的作用。承担单位：中山大学、北京大学课题负责人：康铁邦，特聘教授，42岁, 中山大学肿瘤防治中心学术骨干：孔道春、张丽君等预算经费： 23.5%课题二：PTEN调节的蛋白质群在细胞有丝分裂中的作用研究目标：本课题旨在探讨PTEN在有丝分裂过程中的地位和作用，首先了解PTEN调控其靶基因集团的机理，然后研究PTEN和有丝分裂相关蛋白质群的相互作用，第三建立活体动物模型以评价PTEN在维持遗传物质稳定性和抑制肿瘤中的作用，最后揭示PTEN与p53通路蛋白质群之间的网络关系。研究内容：1. 检测有丝分裂期间PTEN在维持着丝粒和关卡功能中所发挥的作用。揭示着丝粒中PTEN的精确定位；在体外和体内的Pten-缺陷型细胞中确定PTEN缺失如何导致染色体凝集和集合障碍，着丝粒-微管相互作用受损以及纺锤体关卡应答障碍；观察Pten-缺陷型细胞中过度表达PTEN是否能校正染色体错排和分离错误，以及恢复着丝粒功能和关卡应答。利用基因芯片技术鉴定出新的PTEN调节基因群并且深入了解其调控机理。采用染色质-免疫共沉淀（ChIP）方法确定PTEN与染色质之间的相互作用从而探讨PTEN调控其靶基因表达的机理。2. 鉴定与PTEN相互作用的蛋白质群。我们已建立了成熟的蛋白质Pull-down分析系统，并且成功地发掘出与有丝分裂相关的蛋白激酶，如PLK-1和纺锤体运动相关的马达蛋白，如EG5。本课题将利用这一成熟的系统通过标记PTEN鉴定更多与有丝分裂相关的蛋白质群。通过传统的蛋白质-蛋白质相互作用实验（IP-western）、定向诱变、荧光素酶分析等方法检测PTEN与这些新鉴定出的有丝分裂相关蛋白质群的物理性相互作用并且利用课题组三的蛋白质分析平台鉴定PTEN与这些蛋白质群物理性相互作用的结构域及蛋白质修饰位点。3. 建立PTEN突变的小鼠模型，以评价PTEN在有丝分裂过程和维持基因组稳定性中的重要性。在前期研究中已成功地建立了条件性PTEN189 knock-in小鼠模型，这些PTEN突变的小鼠以极高的频率发生肿瘤。将利用这些模型评价PTEN在活体中调控细胞周期，有丝分裂及其维持基因组稳定性的作用，并且衡量基因组不稳定性与肿瘤发生的因果关系。4. 揭示PTEN与p53调节的蛋白质群之间的分子网络。本课题组的前期研究结果显示：PTEN对p53形成负调节，即失去PTEN可激活p53通路，如Apalf-1、PUMA和PAC1等，导致自发性细胞死亡。我们将利用已建立的组织特异性PTEN基因敲除小鼠模型研究p53通路及其凋亡靶基因群如何对PTEN的功能失调产生应答，以此评价抑癌基因之间的分子网络联系及对化疗药物敏感性的影响，为临床化疗、药物的筛选提供理论依据。承担单位：北京大学、中山大学课题负责人：尹玉新，教授，49岁, 北京大学医学部基础医学院学术骨干：张辉等预算经费： 29.5%课题三：细胞增殖异常模型中的相关蛋白质群及其调控网络研究研究目标：本课题以肿瘤和衰老模型为主要研究对象，对前期已鉴定出的，与癌症发生或转移及衰老密切相关蛋白进行生物学功能的研究，鉴定新的参与细胞周期G1和M期的蛋白并研究其在细胞异常增殖过程中的作用。从蛋白质群调控网络水平上揭示细胞增殖调控失常的分子机制。研究内容：1、对已初步选定的一些与异常增殖特异相关的关键蛋白，如S100A家族、Mig-2、和PHP14等，利用基因干扰技术和课题二中所建立的转基因小鼠和条件性基因敲除等平台，从体外培养细胞到体内动物模型验证并研究其在肿瘤发生与转移以及衰老过程中的生物功能及其变化规律。2、利用SiLAD等动态蛋白质组学方法，筛选鉴定肿瘤或衰老相关蛋白的相互作用蛋白及其在干预靶蛋白情况下的动态变化规律。结合信号通路特异性抑制剂等手段探索和确定其所参与的信号转导通路，特别是与PTEN和p53 通路的关系。阐明其导致调控异常的分子机制。3、利用前期研究所建立的体内快速检验异常增殖的与肿瘤相关的蛋白质群的斑马鱼技术平台，鉴定出调控肿瘤细胞异常增殖的重要蛋白质群，并在临床病人中建立相关性验证，以明确其在肿瘤诊断、预防和治疗中的意义，以及作为潜在药物靶标的可能性。4、进一步改进和优化已初步建立的，可对组蛋白基因调控区的甲基化等修饰及修饰位点进行系统性定量鉴定的新技术，进而探索特殊修饰在细胞增殖调控异常中的作用。力求发现和鉴定个关键核蛋白质修饰类型及有可能用于新药开发的重要靶标。承担单位：北京师范大学、北京大学课题负责人：张宏权，教授，46岁，北京大学学术骨干：肖雪媛、纪建国等预算经费： 23.5%课题四：调控细胞增殖与细胞凋亡的分子机制研究研究目标：本课题将主要研究Hippo信号通路调控细胞增殖和细胞凋亡的分子机理；分析微CYLD和EB1等微管结合蛋白调控细胞有丝分裂进程的分子机制。研究内容：1、Hippo信号通路组成蛋白间的动态互作。通过上位分析（epistasis）和IP-western等方法全面调查Hippo信号通路各组成蛋白间动态的互作及其对Hippo信号传递的意义；通过质谱分析鉴定Hippo通路蛋白的修饰类型，特别是激酶Hpo和Wts底物及其磷酸化位点的鉴定及其分子与生物学意义。2、鉴定新的靶蛋白。利用已有的Yki转基因动物模型，通过micro-array比较表达谱的差异，鉴定新的Yki靶基因，并通过上位分析（epistasis）确定其在Hippo信号通路中的作用。3、鉴定Hippo通路调控分子及分析通路激活机制。与课题组三合作，利用高通量蛋白质分析平台和已制备的Hpo磷酸化Wts的磷酸化抗体，通过小分子RNA干扰基因表达检测Wts的磷酸化水平的变化，鉴定新的Hippo通路调控因子、特别是上游调控分子并分析其功能，分析通路的激活机制。4、系统分析Hippo通路蛋白质组群在细胞内的定位与转位。高速离心分离细胞组分，确定Hippo通路蛋白在细胞质膜、细胞质、细胞核以及细胞器的定位；在细胞整体水平上观察通路蛋白的定位与转位，分析引起蛋白转位的因素与意义；Wts、Mats和Wts为中心体定位蛋白，均可以调控中心体的复制与染色体的分离，从而影响基因组的稳定性。我们将与课题组二合作，探讨三者之间的相互关系，为Hippo信号通路影响基因组稳定性提供分子水平上的证据。5、探索Hippo信号通路与Rassf、EB1、CYLD等微管结合蛋白之间的关系，解析上述各蛋白协同或独立调控细胞增殖与凋亡的分子机理。承担单位：南开大学课题负责人：吴世安，教授，40岁，南开大学生命科学学院特聘教授学术骨干：周军、朱玉山等预算经费： 23.5%（四）各课题间的相互关系，以及与项目总体目标和五年目标的关系根据总体目标的要求，本项目的中心思想是维持细胞增殖与分裂过程中遗传物质的稳定性，而这一稳定性的维持有赖于细胞周期的精细调节，在此过程中不同蛋白组群相互作用、相互影响和相互调节。本课题组将根据这个原则进行分解、设计，了解与探索在细胞周期各个阶段蛋白质活动的规律，探索信息传导在细胞周期调节过程中的重要作用，评价细胞生存和死亡调控机制的价值。各个项目围绕细胞周期的不同阶段或不同检验点，选择特定的研究渠道进行机制研究和探索。各个课题之间相互联系、互相促进，旨在实现本项目的总体目标，即从与遗传物质稳定性相关蛋白质群这一关键科学问题出发，在细胞周期的各个环节探讨相关蛋白质群的分子调控机制以及相互作用网络。本项目五年目标的完成则具体表现在以上所述四个课题的研究计划中：课题一、着重研究DNA复制过程中蛋白质群的相互作用和调节，同时研究DNA复制期检验点在维持遗传物质稳定性中的作用；课题二、了解有丝分裂过程中PTEN调节的蛋白质群的相互作用和调节机制，还将进一步探讨PTEN与p53的分子抑癌网络。以上两个课题主要探讨细胞正常生长分裂过程中的两个重要事件：DNA复制和有丝分裂中相关的蛋白质群及其作用机制。课题三则利用现有的蛋白质分析技术平台来对细胞异常增殖中涉及的各种蛋白质群进行系统的大规模的鉴定和分析，以达到全面理解细胞周期调节中各个系统蛋白质相互作用的机制和形式。此外，细胞周期的完善与精细调节体现在遗传物质稳定性的保持。如果细胞周期不能进行正确调节，多细胞系统将通过信号传递及细胞生长调控来实现细胞的存亡。课题四将研究不同细胞信号通路如何对细胞的生存和死亡进行精细调控。因而，以上四个课题相互关联，层次递进，从作为中心的遗传物质稳定性，到细胞周期各阶段的精确调节，到细胞周期失调导致细胞异常增殖，再到异常增殖导致的细胞信号通路的改变对细胞生物学功能的影响。这些从细胞周期衍生出来的变化，让细胞必须做出抉择：生或死；正常增殖或发生肿瘤。课题组间在技术平台层面还存在广泛的联系和互助。课题一的高精度蛋白分离技术将会用于所有课题所面临的蛋白质纯化和分析的需求；课题二的基因敲除小鼠模型系统和课题三的斑马鱼肿瘤转移模型系统可为其它课题组提供珍贵的活体动物模型，同时课题三建立的快速鉴定调控细胞异常增殖蛋白质群的动物在体技术平台，将大大加速对四个课题研究的与遗传物质稳定性相关蛋白质群的功能研究，并结合不同信号通路的在体研究，有助于快速揭示这些蛋白质群的作用机制；课题四的果蝇细胞快速增殖模型和转基因小鼠模型可用于测试各个课题组鉴定出的新的蛋白质群的功能。四、年度计划第一年：研究内容1. 筛选与Sap1、Cds1和Dna2相互作用的蛋白，并且大规模鉴定和DNA复制有关的蛋白。2. 建立稳定高表达GSK-3或RNA干扰GSK-3的Hela细胞系。3. 确定TAP的最佳条件，以便最大限度地纯化出GSK-3相互作用蛋白。4. 基因芯片法筛选出差异基因群，该基因群可能在转录水平直接或间接受GSK-3的调控。5. 着手研究GSK-3磷酸化Cdh1的具体位点，及其意义。6. 创建一系列GFP-PTEN质粒，以使其在结构上具有AcGFP1编码序列。将这些pAcGFP载体转染Pten+/+ MEFs或HeLa细胞。对细胞周期中不同时期的细胞进行分析以获得PTEN动态定位的足够信息。7. 在含有野生型PTEN和PTEN缺陷型的不同细胞系中对动粒功能进行分析。8. 建立PTEN敲除MEFs系统和PTEN诱导表达系统。通过Western Blot和Northern分析检测PTEN缺失和PTEN诱导表达的细胞中p53蛋白及其mRNA的水平。9. 通过基因表达干预等方法从体内外系统研究与肺癌发生和转移密切相关蛋白S100A7、S100A11和PHP14等的生物学功能。10. 建立神经细胞衰老和衰老模型，制备不同发育或分化阶段的样品材料，进行亚细胞器分级实验，提取关键蛋白质组分。11. 在mRNA和蛋白质水平核实鉴定Mig-2上调的促肿瘤生长和侵袭转移的蛋白质群，并在肿瘤病人标本上建立相关性。12. 利用微阵列方法鉴定Hippo通路靶蛋白集团。13. 合成双链RNA，构建果蝇RNAi文库。14. 完成Hippo通路主要已知组成蛋白如Hpo、Sav、Wts、Mats、Yki等及微管结合蛋白蛋白Rassf、CYLD、EB1等GFP融合蛋白表达载体的构建，分析上述蛋白的细胞内定位、共定位与转位情况。15. 分析微管结合蛋白对细胞周期进程的影响，检测微管结合蛋白在肿瘤和对照组织中表达水平的变化及其表达对反映细胞生长或死亡的克隆形成率的影响，并通过BrdU整合实验等，分析微管结合蛋白表达对细胞增殖的影响。16. 制备并纯化Wts磷酸化抗体。预期目标1. 质谱确定和Sap1相互作用的候选蛋白。筛选得到一些和Cds1和Dna2相互作用的蛋白。筛选得到100个突变株。并开始突变株的形态分析、开始突变株突变基因的确定。2. 分别得到3株以上稳定高表达GSK-3或干扰GSK-3的Hela细胞系。3. 初步确定TAP的最佳条件.4. 筛选出干扰GSK-3后表达差异的基因群。5. 确定GSK-3磷酸化Cdh1的具体位点，初步确定GSK-3磷酸化Cdh1的意义。6. 揭示动粒中PTEN的精确定位。7. 确定PTEN缺失是否会导致染色体凝集和集合障碍，动粒-微管相互作用受损以及纺锤体检验点应答障碍。8. 完成不同PTEN状态下p53蛋白及其mRNA水平的测定分析，确定PTEN如何控制p53转录。9. 确认S100A7、S100A11和PHP14在肺癌发生和/或发展中的生物学作用。10. 获得不同发育和衰老阶段的亚细胞器样品。11. 选择2-3个Mig-2上调的与肿瘤增殖和侵袭有关的转录因子，阐明其调控机制。12. 得到Yki过量表达后靶蛋白表达增加与减少的顺序列表，分析得到3-5个候选蛋白用于进一步分析。13. 完成约5，000个果蝇基因双链RNA的制备。14. 获得Hippo通路主要组成蛋白细胞内定位、共定位和转位情况，完成对Hippo通路与微管结合蛋白相互作用分子网络的解析。15. 获得微管结合蛋白对参与调控细胞增殖与凋亡机制的了解。16. 得到Wts磷酸化抗体。第二年：研究内容1. 用体外生化方法，验证和Sap1相互作用的蛋白。着手开展这些蛋白基因的突变株的筛选。开始筛选人细胞的Sap1同源蛋白。2. 对第一年筛选的突变株进行形态分析，确定突变株的突变基因。DNA序列分析确定突变基因的突变位点。序列对比分析这些基因表达的蛋白及可能的功能域。3. 体外验证和Cds1及Dna2相互作用的蛋白。研究Cds1和 Dna2通路的中间蛋白。着手开始筛选这些蛋白的突变株并开始功能分析。4. 利用生物信息学找出其中与细胞周期、DNA损伤监测点的调控或与肿瘤发生发展相关的基因群。5. 利用RT-PCR在翻译水平验证该基因群；利用Western blot在蛋白水平上验证。6. 以TAP大规模纯化GSK-3高表达细胞Hela细胞系与对照Hela细胞系裂解蛋白，SDS-PAGE检测差异蛋白群，LC-MS以及生物信息学鉴定出差异蛋白群。7. 深入探讨GSK-3磷酸化Cdh1的对细胞周期的影响及其意义。8. 将pcDNA3/PTEN转染Pten-/- MEFs并且通过Western分析证实异位PTEN表达，通过免疫荧光法和活细胞成像对上述细胞中的染色体排列和分离进行监测。9. 采用epitope-tagging策略从人类乳癌MCF-7细胞中分离纯化在核内与PTEN存在特异性相互作用的新的有丝分裂因子。对所得蛋白进行质谱分析后搜索蛋白数据库进行鉴定。10. 采用染色质免疫共沉淀法（ChIP）检测PTEN与p53启动子DNA物理上的关联。荧光素酶分析法检测PTEN对p53启动子的转录调控。进行Dnase I指纹图谱分析，通过核心指纹图谱系统精确限定PTEN与p53启动子的结合区域。在p53启动子区域构建一系列的缺失来缩小PTEN结合的最小的必需序列。11. 在第一年工作的基础上，采用TAP技术对S100A7、S100A11和PHP14等相互作用蛋白或蛋白复合体组分进行筛选，并对获得的候选蛋白进行质谱鉴定。通过免疫共沉淀等方法对其中感兴趣的候选蛋白进行验证。12. 对不同阶段细胞进行稳定同位素定量标记研究，收集研究材料进行亚细胞器分级，初步分析标记效率和蛋白质表达情况，利用质谱鉴定部分蛋白质。13. 通过免疫共沉淀并结合质谱技术，发现新的Mig-2相互作用蛋白质、制备抗体，揭示mig-2本身调控肿瘤细胞增殖和侵袭的分子机制。14. 通过免疫组化分析的方法在体内验证Hippo通路调控新靶蛋白的表达并确定其参与的生物学过程。15. 合成双链RNA，构建果蝇RNAi文库。16. 利用果蝇RNAi文库、通过western blotting方法观察Wts磷酸化水平的变化筛选Hippo通路调控蛋白。预期目标课题一：1. 确定和Sap1相互作用的蛋白。得到1或2个和Sap1相互作用的蛋白的基因条件突变株。得到和人细胞Cdc6蛋白相互作用的候选蛋白。2. 完成突变株的形态分析。 完成突变株的突变基因的确定。 完成序列对比分析及蛋白功能域的确定。3. 确定Cds1及Dna2相互作用蛋白。敲除它们的基因。完成突变株的形态分析。4. 验证出3-5个与细胞周期、DNA损伤监测点的调控或与肿瘤发生发展相关受GSK-3直接或间接调控的基因。5. LC-MS鉴定5-10个TAP纯化的差异蛋白。6. 确定GSK-3磷酸化Cdh1的对细胞周期的影响及其意义。7. 确定在Pten缺陷型细胞中过度表达PTEN是否能校正染色体错排和分离错误，以及恢复动粒功能和检验点应答。8. 分离纯化若干个与PTEN相互作用的有丝分裂相关蛋白，并查询其基本生物功能。9. 确定PTEN调节p53转录的分子机制。10. 获得若干个S100A7、S100A11和PHP14的相互作用蛋白或蛋白复合体组分。将其中一些蛋白将申请专利。11. 将稳定同位素标记进入细胞各亚细胞器，获得蛋白质的动态表达数据。12. 获得Mig-2调控的新信号通路并建立相关信号通路与肿瘤病人的相关性。13. 确定3-5个候选靶蛋白在Hippo通路调控细胞增殖与凋亡中作用。14. 完成另外约5，000个果蝇基因双链RNA的制备。15. 完成Hippo通路调控蛋白的筛选，分析选择3-5个候选基因用于下一步分析。16. 培养研究生8名，培养博士后4名。发表IF10的论文4篇，IF5的论文16篇。申请专利4项。第三年：研究内容课题一：1. 开始Sap1相互作用蛋白的功能分析。验证和人细胞Cdc6相互作用的蛋白。2. 研究这些蛋白在细胞生长过程中的动态变化。研究它们是否是DNA复制必需的蛋白。研究它们是作用于DNA复制起始阶段还是DNA合成延长阶段。3. 着手开展研究Cds1及Dna2相互作用蛋白在维持DNA复制叉稳定性中的作用。4. 研究3-5基因芯片筛选的个蛋白在翻译水平上受GSK-3调控的方式及其机理（直接调控还是间接调控）。5. 评价该3-5个蛋白对细胞周期调控、DNA损伤监测点调控的作用，或对肿瘤的发生、发展中的作用。6. 细胞水平验证TAP-LC-MS发现的GSK-3相互作用蛋白的相互作用（免疫共沉淀实验、GST pull-down实验等）7. 从PTEN+/+ MEFs和PTEN-/- MEFs中提取RNA，逆转录为cDNA，采用生物素标记探针对芯片进行杂交。比较整体基因表达谱与PTEN功能的关系。8. 采用细菌表达的蛋白（GST-PTEN，GST和候选蛋白）进行体外GST pull-down分析。建立HA-标记的鉴定蛋白细胞系，在该细胞系中，或瞬时转染PTEN表达载体及HA-标记的鉴定蛋白的细胞中进行体内免疫沉淀和western blot分析。9. 构建含有PTEN磷酸酶活性失活的哺乳动物表达质粒，检测p53的产生是否依赖于PTEN磷酸酶活性，同时检测存在或缺失PTEN时p53是否发生活化。利用免疫沉淀（IP-Western）检测AKT和p53之间的物理相互作用。10. 采用免疫共沉淀等方法对候选的相互作用蛋白进行验证，从中选取1-2个感兴趣蛋白或是功能未知蛋白，通过基因转染等方法对其进行生物学功能分析。11. 利用多种质谱系统如MALDI TOF/TOF MS和LC-MS/MS系统鉴定不同衰老阶段的蛋白质动态表达和修饰，鉴定修饰位点和修饰类型，进行氧化修饰和组蛋白质及和蛋白质修饰分析。12. 通过蛋白质相互作用技术，结合使用抑制剂和细胞实时图像技术，揭示Mig-2调控细胞周期M-entry和Spindle assembly的分子机制。13. Hippo通路候选调控蛋白体内外功能分析。构建候选蛋白转基因和敲基因动物模型，观察其表型特点；利用免疫共沉淀等方法确定候选蛋白与Hippo通路已知蛋白之间的相互作用。14. 通过细胞共转染、蛋白分离纯化和质谱分析鉴定Hpo磷酸化Sav的关键磷酸化位点，构建关键位点突变的转基因和敲入（knock-in）果蝇模型，分析磷酸化位点的功能。15. 分析Hippo信号通路主要蛋白与线粒体功能的相互关系，如Hippo通路蛋白与线粒体蛋白的共定位情况、Hippo通路对线粒体功能的影响、线粒体对Hippo通路激活机制的影响。16. 整理分析数据，撰写论文。预期目标1. 确定Sap1相互作用蛋白是否在DNA复制起始中起必需作用。 验证和确定人细胞Cdc6相互作用的蛋白，即人细胞Sap1的同源蛋白。2. 确定这些和DNA复制过程相关蛋白在DNA复制过程中的作用阶段。3. 确定Cds1和Dna2之间的通路。4. 初步阐明5-10个基因在翻译水平上受GSK-3调控的方式及其机理。5. 初步阐明3-5个受GSK-3调控的基因对细胞周期调控、DNA损伤监测点调控的作用，或对肿瘤的发生、发展中的作用。6. 验证出3-5个与GSK-3相互作用的蛋白。7. 完成基因芯片筛选分析，鉴定出若干由PTEN调节的靶基因。8. 验证第二年通过分离纯化鉴定的若干PTEN相关蛋白与PTEN的相互作用是否为直接的。9. 完成PTEN磷酸化与p53活性的相关性分析以及AKT与p53相互作用的分析，确定PTEN是否间接调节p53通路。10. 初步探究S100A7、S100A11和PHP14对肺癌发生和/或发展的分子机理。11. 获得细胞核蛋白质动态修饰、修饰类型、修饰位点信息，为进一步功能分析打下基础。12. 阐明Mig-2调控细胞周期和基因组不稳定性的新分子机制。13. 得到3-5候选调控蛋白转基因与敲基因果蝇动物模型，根据表型初步判断其生理功能；确定候选蛋白与Hippo通路蛋白的相互作用。14. 确定Hpo磷酸化Sav的关键位点与磷酸化的生物学意义。15. 确定Hippo通路蛋白特别是Hpo与线粒体功能的相互关系。16. 培养研究生12名，培养博士后4名。发表IF10的论文4篇，IF5的论文16篇。申请专利4-8项。第四年：研究内容1. 开始研究Sap1相互作用蛋白在DNA复制起始中的机理研究。 研究人细胞Sap1在DNA复制起始中的作用。2. 开始新确定的DNA复制蛋白在DNA复制起始及延长阶段的作用机理研究。3. 开展研究Cds1及Dna2相互作用蛋白在维持基因组稳定性中的作用。4. 进一步研究受GSK-3调控的基因对细胞周期调控、DNA损伤监测点调控，或对肿瘤的发生、发展中的作用、意义及其机理。5. 鉴定各个蛋白与GSK-3相互作用的肽段或GSK-3对各个蛋白磷酸化的位点。6. 研究各个与GSK-3相互作用蛋白对细胞对周期调控、DNA损伤监测点调控，或对肿瘤的发生、发展中的作用，以及与GSK-3对该蛋白功能的影响。7. 采用染色质免疫共沉淀法（ChIP）检测PTEN与染色质物理上的关联，随后以荧光素酶分析法检测PTEN对靶基因启动子的转录调控。进行Dnase I指纹图谱分析，通过核心指纹图谱系统精确限定PTEN与靶基因启动子的结合区域。基于指纹图谱分析数据，在启动子区域进行一系列的缺失来缩小PTEN结合的最小的必需序列。8. 利用课题组三的蛋白质分析平台鉴定PTEN与有丝分裂相关蛋白质群的物理性相互作用的结构域及蛋白质修饰位点。进一步通过RNAi等分析已验证蛋白的功能特性。9. 建立条件性PTEN knock-in小鼠模型。10. 在不同PTEN和p53状态的乳腺癌细胞株中，通过Western 分析检测p53、 Apaf-1、PUMA和PAC1的基本表达水平。在PTEN siRNA以及PTEN189突变的细胞株中再次检测p53、Apaf-1、PUMA和PAC1的表达水平。11. 采用基因表达芯片和/或双向电泳等技术筛选S100A7、S100A11和PHP14基因沉默后，对其所调控的基因或蛋白群表达的影响。12. 分析关键蛋白质表达和修饰变化，激起涉及关键生物学机制和信号传导途径，对关键蛋白质通过基因表达干预、利用RNAi和小分子化合物进行抑制和/或活化进行功能研究。13. 研究Mig-2调控的多重细胞信号通路及其协同整合调控肿瘤侵袭性生长的分子机制，特别要关注Mig-2信号通路与Wn、Hedgehog及生长因子信号通路中的交互作用。14. 利用构建的转基因以及敲基因果蝇模型，通过上位分析（epistatsis）探讨候选调控蛋白与已知Hippo通路蛋白的遗传学关系，并结合前述所得体外相互作用分析通路