微生物的透析培养技术及其应用.doc

微生物的透析培养技术及其应用摘要：微生物的透析培养不仅能显著地提高细胞浓度, 还能获得纯化的细胞与高分子产物。本文主要针对微生物的透析培养技术和应用现状进行了论述，简述了微生物透析培养的特点，培养过程中各因素对其产生的影响以及该技术在实际生产中的应用,详细介绍了微生物透析培养的技术原理，包括透析培养的装置、透析原理、透析膜、工艺策略等，并展望了透析培养技术研究的重大意义。关键词：微生物；透析培养；应用Abstract: Dialysis culture of microbial not only can significantly increase the cell concentration, but also to obtain the purified cells and polymer products. This article mainly discusses the technology and application of microbial dialysis culture. this paper expounds the characteristics of microbial dialysis culture, cultivation in the process of the various factors on the impact of the technology and the application in practical production, detailed introduces the principle of the cultivation of the microbial dialysis technology, including the device of dialysis culture, dialysis principle, dialysis membrane, technology strategy, and prospects for the dialysis culture technology of great significance.Keywords: microbial; dialysis culture; application微生物是一类现实和潜在用途都很大的生物资源，广泛应用于农业、工业、医药、食品及环保等各个领域。然而，自然界中只有极少部分微生物用传统培养方法能够得到培养，严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发1。微生物在培养过程中，根据生长曲线，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要原因2。因此必须改进传统培养方法，采用新型培养技术，提高微生物可培养性及产菌率，更全面、准确地了解微生物细胞的生命规律，两种微生物共同培养时通过其产生物获悉它们之间的动态相互作用和相互协调的规律，对环境微生物工艺进行准确地设计、精细地调控和高效地利用。透析培养技术（dialysis culture）就是满足这一需要而发展起来的一门新兴微生物培养技术。它不仅可以延长对数期的增殖，增大静止期的细胞数，还能获得纯化的细胞与高分子产物，另外通过外液的培养液成分的变化，可使微生物的营养环境慢慢发生改变，同时也可隔着膜培养两种微生物，通过其产生物来了解它们的相互关系。国外对它的研究有近90年的历史，在50年代初至60年代末达到高潮，国内至今尚少见有这方面的专题论述。本文将系统介绍透析培养的原理、特点及应用等着重于细菌方面研究的概况。1 透析培养的概念及特点1.1 透析培养的概念通过半透膜有效地去除培养液中有害的低分子量代谢产物，同时向培养室提供充足的营养物质的培养方式称为透析培养3。在培养单种菌时，只在两液相的一方培养微生物，另一方则作为培养基贮槽，在两者之间进行营养物质和产物的扩散及交换。用这种方法可以进行生长细胞的浓缩，改善孢子形成和毒素产生的条件等。同时培养两种微生物的实验中，可以分别在由透析膜隔开的两个液相中接种不同微生物进行培养，以研究两种微生物间的相互关系。曹小红等4采用透析培养的方法，研究了添加耐盐乳酸菌与酱醪中酵母菌的协同作用以及发酵工艺的控制和对酱油主要风味的影响，表明在酱醪发酵过程中，添加耐盐乳酸菌明显促进T酵母菌的生长，而与S酵母菌存在着相瓦促进的关系。1.2 透析培养的特点微生物透析培养有下列优点:透析培养可以增加生物量的积累，达到很高的细胞密度，约为其它发酵方法的30倍5；由于透析膜可隔绝培养基中大分子物质进入培养室, 同时细菌的代谢产物亦可通过透析膜扩散到培养基贮存室，因此在培养室中可获得较为纯化的细胞或高分子产物；透析培养的细菌无论是在培养中或者经过洗涤和贮存后都能保持一定活力；透析培养时空气通过膜扩散, 不是直接地接触培养物, 这样可以免去因直接通气而使微生物变性的危险或消泡剂毒性的影响；与微滤和超滤相比，在透析过程中透析膜不会被阻塞，并且可以很长时间维持其渗透性能。但是，由于反应器本身需要内嵌的透析膜或外在的透析组件、辅助泵及其它发酵罐等，透析培养的设备投资较大。2 透析培养的原理与技术2.1透析培养装置透析培养反应器有两种类型：一种是培养室内嵌于透析室内，二者由一半透膜分隔；另一种是培养室和透析室分隔，二者通过外在的透析组件相连。后者又存在两种形式：用于悬浮细胞培养的标准发酵罐和用于固定化细胞（尤其是动物细胞）培养的固定床5。2.2透析当化学膜的两侧物质浓度存在差异时，物质就会从浓度高的一侧向浓度低的一侧渗透, 直到两侧浓度相等。这种被动扩散的平衡受下列因素影响: ( 一) 溶液温度越高, 物质运动速度越快、扩散速度也快, 达到平衡时间越短。( 二) 半透膜的面积越大, 单位时间内通过的物质越多, 达到平衡时间越短。( 三) 浓度越高、扩散越快、而水分子则向反移动, 水从压力高的一侧移向低的一侧。半透漠对于物质的通透性是比较复杂的, 它不仅取决于膜孔径的大小, 而且还和膜中所含液体灼性质、膜本身的化学性质, 粒子的被吸附性以及所带的电荷符号等许多因素存关。例如当大分子被半透膜隔开时, 它会通过半透膜吸引带有和它相反电荷的小离子透过半透膜, 而阻止带有和它相同电荷的小离子透过半透膜。又如高分子的电介膜的微孔壁上含有固定不动的离子化基团, 在膜孔径小到一定程度时, 同这种基团带有相同电肯符号的离子就不能通过这种半透膜。2.3透析膜 用于透析培养的膜片称作透析膜, 或超微孔膜。它能阻挡象酶租毒素之类的大分子但允许糖和盐之类的小分子通过, 孔隙的大小还随水合的程度而变更。透析膜的要求能阻留微生物与大分子物质, 对溶质的扩散有良好的效率, 可高压消毒, 耐久, 不致被细菌酶所分解，且廉价易得。不同的工艺条件对膜的种类要求不同。表1总结了膜透析反应器所用的几种膜的表1膜透析反应器所用各种膜的性能比较（Krahe于1997年测得）特性Cuprophan膜聚醚磺酸膜聚丙烯薄膜聚酰胺薄膜性能无孔扩散性多孔、均匀性多孔、均匀、疏水性多孔、均匀、疏水性材料再生纤维素聚醚磺酸聚丙烯聚酰胺膜厚度（m）20（干），40（湿）10010150180100120截流能力10 kD0.1 m0.2 m0.2 m水压渗透性能ml/(min.cm.bar)0.004352011葡萄糖渗透系a(dm/h)0.0940.12-0.11注：a在膜透析反应器中测定。温度为30；搅拌速度透析腔为1500 r/min，培养腔为1000 r/min。主要性能，其中Cuprophan膜用途最广，将它制成与反应器适配的透明管，可以监控细胞悬液尤其是泡沫的形成6。多孔、不透明的平板状膜不能用作管道，必须事先将它胶合起来。无孔膜和有孔膜的主要差别是水压渗透性能（即由于跨膜压力差产生的水流，可以用水压渗透性系数表示）。但是，在透析中如果不存在跨膜压力差，膜的渗透性能与表1中以葡萄糖渗透系数表示的情况相似。2.4 透析培养工艺策略早期的透析培养是将高浓度的完全培养基通入透析室，一方面将小分子量代谢产物从培养室透析出来，将细胞与高分子量代谢产物留下；另一方面向培养室提供充足的营养物质。这种方式培养基的利用率较低，大部分营养物质混入透析废液中。采取一些工艺策略可以克服此不利因素。1980年Stieber和Gerhardt7利用数学模型研究乳杆菌的连续发酵，他们连续地向发酵罐补给基质并通过膜将有害代谢物透析入水中；1993年Ogbonna和Markl8将以上策略应用于大肠杆菌的分批补料透析培养，发现水分会从透析室渗入培养室，最终导致了细胞浓度的降低。因此他们推荐一种“Nutrient-split”补料策略9，即将培养基分成浓缩营养物溶液和基本上只含有用来平衡渗透压的无机盐溶液两部分。浓缩营养物溶液以分批或连续方式直接注入培养室，无机盐溶液则加入透析室以维持渗透压。采用这种补料策略，不但可以得到高的细胞密度，而且大大降低了营养物质的损失。2.5 透析培养中的活菌率它随所用的菌株和培养条件而不同，如表2所示。在相同条件下，透析培养和非透析培养（即对照培养，用橡胶膜代替透析膜或两室合为一室）得到的活菌所占到的比率也不相同，例如黏质沙雷铁氏菌和卵状假单胞菌等菌在透析培养条件下几乎都是活菌，而蜡状芽孢杆菌则相反，活菌所占比例较非透析培养时少得多10。2.6 生长量的数据处理透析培养和非透析培养时菌的生长浓度之比可以用下式表示：Xd/Xnd=Sd/SndVr/Vt这里Xd、Xnd分别为透析培养和非透析培养（即对照培养）时的细胞浓度（g/ml）；在透析培养装置的上室中加入Vt（ml）体积的蒸馏水，下室（即培养基贮槽）用限制底物浓度为Sd（g/ml）的培养基Vr（ml）装满。在非透析培养中，所用培养基的底物浓度一般用Snd来表示。当用前述橡胶膜进行对照培养时与Sd相同。如果假定相当于一定量限制底物的细胞收获量在透析培养和非透析培养中没有表2 透析培养时生长细胞的活菌量菌株培养基活菌数/总菌数/%透析培养非透析培养蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）葡萄糖-酵母膏6.160巨大芽孢杆菌（B. megaterium）KM蛋白胨7880拟杆菌（Bacteroides sp.）巯基乙二醇8072大肠埃希杆菌（Escherichis coil）K12胰化胨-大豆6475感冒嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）蛋白胨-血红蛋白8589卵形假单胞菌（Pseudomonas ovalis）胰化胨-大豆10728啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）糖蜜-尿素9467黏质沙雷铁氏菌（Serratia marcescens）8UK葡萄糖-柠檬酸9417金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）胰化胨-大豆7052乳链球菌（Streptococcus lactis）乳固形物-蔬菜汁9195逗号弧菌（Vibrio comma）胰化胨-大豆8349变化，而且限制底物顺利地透过膜供给，那么，上式所示的Xd/Xnd之比就表示生长的理想浓缩效果（理论值）。由于用橡胶膜作对照进行透析培养时Sd= Snd，所以上式可以改写成：Xd/Xnd= Vr/Vt 由此可见，此时的生长浓缩率取决于上下室液量之比。3 影响透析培养的因素微生物要通过透析培养技术得到理想的细胞获取量，需要优化一系列相关的工艺参数来对培养过程进行严格的控制。通过解决这些问题，设计出合适的培养方案达到理想的菌体浓度。3.1 培养开始前膜内外液相的平衡 一般在透析袋内（培养槽中）加入食盐水或蒸馏水，而培养基则完全加在袋外（培养贮槽）。因此，在接种前需放置一定时间，室内外液扩散而达到平衡。所需放置时间随所用透析膜的不同而不同，可以由4h到24h。在透析膜质地相同时，扩散速度达到理论最高值的1/2浓度时所需的时间（ET50）取决于膜的孔径。3.2培养基浓度 在透析培养时，培养槽中培养基的浓度可以看作是由培养基贮槽（下室）通过膜提供给上室的营养物总量和下室液量的比。因此，如果不改变下室培养基的液量和浓度，而改变上室的液量，则上室培养基的浓度就会发生改变。也就是说，培养基贮槽和培养槽的液量比可以作为培养槽培养基浓度的指标。改变这个比值便可以改变菌体的收获量。 3.3透析膜的质地 在选材时，除了要考虑前述的ET50外，还必须考虑透析膜的强度，透析膜要能耐受微生物分解和真气灭菌，并且廉价易得。目前，再生纤维素制成的透析膜是最常用的。3.4搅拌和Kd（氧吸收速度常数） 关于透析培养时搅拌对微生物生长影响的研究工作，一般都是将透析膜、培养槽以及培养基贮槽分开，再用导管和泵把它们联接在一起来进行的。因为这样的体系既不会影响透析膜，又可以随意改变培养槽内的搅拌速度。在某些实验中，一般的非透析培养，用550r/min和875r/min的搅拌速度，其生长量没有什么差异。而透析培养时，在后一种搅拌速度下，生长量却增大了1.5倍。透析培养中，要得到和非透析培养时间的Kd值，就必须加强搅拌。3.5 温度的影响温度是影响细胞生长和代谢活力的重要因素。最是温度随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段变化而变化，不同的微生物最适生长温度范围存在一定的差异。培养温度低于最适温度，细胞生长缓慢；而温度高于最适温度，生物体或者培养基的重要组成部分可能会被破坏。因此，严格保持细胞的生长繁殖和生物合成所需的最适温度，对稳定培养、缩短培养周期、提高培养单位和产量具有重大意义。3.6 pH值的影响在培养过程中，pH值的变化决定于所用的菌种、培养基和发酵条件。在细胞的代谢过程中，细胞本身有建成其生长最适pH值的能力，但外界条件发生较大变化时，pH值将会不断的波动，如果pH值的波动导致其偏离细胞所需的最适范围，将会引起各种酶活力的改变，影响细胞对基质代谢的速度，甚至改变细胞的代谢途径和细胞结构，最终影响产物的得率。稳定pH值是使微生物细胞保持最佳生长状态的必要条件4 透析培养的应用4.1胞外酶的高浓度生产用膜透析反应器以Staphylococcus carnosus(肉葡萄球菌)发酵生产胞外脂酶11，其生产工艺是一种通过膜补给高浓度基质的间歇性模式，因为只有这样才能避免脂肪酶因接触到在含有大豆胨和酵母提取物的专门营养液中的杂质而被破坏。如果用透析腔不断更新高浓度的基质，46 h内可产出60 g/L的干细胞和227 mg/L的脂肪酶。脂肪酶的生产和生物量的形成直接相关。4.2大肠杆菌的高密度透析培养要达到大肠杆菌的高密度培养，通气条件的维持和抑制性副产物的转移非常必要，乙酸就是一种重要的代谢产物。第一种方法Markl等12采用完全培养基作为透析液来透膜供给，收获的细胞干重为174 g/L，接近最大理论值，但是大量的基质（主要是甘氨酸）流失于排放液中。Ogbonna和Markl8采用“Nutrient-split”补料策略（将甘氨酸直接供给发酵腔并用盐溶液透析），不但降低了营养损耗，还获得了相近的收率160 g/L。引起细胞密度差异的原因主要是发酵后期供氧量（搅拌速度）。Nakano K等13在控制溶氧水平的前提下，以不同碳源透析培养大肠杆菌K12h取得了极高的细胞密度。当用葡糖糖作碳源时，所得细胞量为190gDCW/L；当用甘油作碳源时，所得细胞量为180gDCW/L4.3 极端环境型微生物的透析培养作为一类重要的生物研究对象，能在高温、极端pH值和高压环境下生长的极端环境型微生物日益受到重视。但至今它们仍只能从发酵中少量制备，这就使得对这类微生物及其酶的进一步研究造成了困难。利用透析技术可以提高了极端环境型微生物的产率。Krahe等14对几种极端环境下生存的微生物进行透析培养。这些微生物分别是：嗜高温的P.furiosus（激烈热球菌9生长在深海火山口热水环境中，90）、嗜热酸的Sulfolobus shibatae（75，pH3.5）、嗜盐的Marinococcus M52（35，pH7.5, 10%NaCl）。培养的结果分别为：2.6gDCW/L、114gDCW/L、132gDCW/L。4.4 乳酸杆菌培养 多株乳杆菌都可用于牛奶的发酵，但其高密度发酵却受到积聚之乳酸的抑制。由于发酵中产生了大量的乳酸，所以要进行pH，需加入大量碱液，这样就导致了营养培养基的稀释；而且，若以葡萄糖为主要基质，由于浓缩程度有限，在高细胞密度补料时也会发生培养基的稀释。这些问题都影响了细胞的高密度生长。1977年Osborne15首次将透析用于乳酸杆菌培养，获得了10*1010cfu/ml的菌体密度，相当于30-40gDCW/L。1997年Krahe16报道了在膜透析反应器（0.1m的聚醚磺酸膜）和连有外部透析模块（0.2m的聚酰胺膜）的实验室规模反应器中应用分批投料透析的经验。多孔膜的作用是透析分离乳酸以及从补给的溶液和调pH所用的碱液中除去水分。连有外部透析模块的反应系统可产出的细胞密度高达100 g/L，产率为1.45 g/(L.h)。4.5 其它应用据国外报告透析培养应用于培养条件复杂, 营养要求严格的淋球菌的浓缩培养, 培养哺乳动物细胞的悬浮液生产病毒, 毒素和酶的生产, 产气荚膜梭菌的抱子生产。在南非每年采用透析培养法大量生产C、D 型肉毒梭菌类毒素。用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。作为哺乳细胞的发酵实例，杂交瘤细胞的单克隆抗体生产是在一个有内置式径向流固定床的膜透析反应器中进行的。1964年,世界卫生组织指出，双相透析培养系统应该有助于细胞自身按一定比例增加。这种方法在疫苗的发展和生产领域提供了希望, 因为它在接近那些活体的优势条件下保留遗传的稳定性，同时提高了微生物的产量。5 结语与展望微生物透析培养的原理虽很简单, 但它因涉及的间题较为复杂。有的微生物在透析培养中一点也不比常法好, 可能每个微生物的生长都有它的特定条件, 这也正是需要我们加以探索的。 随着市场需求的日益扩大，微生物透析培养技术广泛地应用于各种微生物（乳酸菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中， 它不仅可以改进发酵工艺， 提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。参考文献1 鲁智林， 王策， 苏维强. 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