PCR技术及应用ppt课件

PCR技术及应用 生物化学暨分子生物学教研室关亚群 PCR技术的创建 1983年 Mullis发明了PCR技术 使Khorana的设想得到实现 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq 引入了PCR技术1989年美国 Science 杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 1983KaryBMullis 1944 发明1985开始有文章发表1993获诺贝尔奖广泛用于分子生物学研究领域 一 PCR技术的基本原理 一 基本概念Polymerasechainreaction PCR即聚合酶链反应 是以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板5 末端和3 末端互补的寡核苷酸片段为引物 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留复制的机制 使目的DNA片段得到扩增的技术 一 PCR技术的基本原理 二 基本原理无细胞分子克隆法 变性 退火 延伸三个步骤模板DNA的变性 93 95 左右 模板DNA与引物的退火 复性 Ta Tm 3 5 引物的延伸 TaqDNA聚合酶之5 3 DNA聚合酶活性 一 PCR技术的基本原理 二 基本原理 预变性 三 PCR技术的特点 1 高度的灵敏性 2 特异性 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性 同时尽可能减少非特异性扩增 三 PCR技术的特点 4 用途广泛 3 操作简便易行 PCR扩增法 只需要数小时 就可以用电泳法检出1 g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列 生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学 四 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 引物确定了扩增产物的序列和长度反应缓冲液 10 50mmol LTris HCl pH8 3 8 8 20 Mg2 forTaqpolymeraseactivitydNTP耐热聚合酶 1969年 美国黄石国家公园温泉 94KDa 活性 在几种水生栖热菌中活性最高 200000U mg 1988年引入了PCR技术ddH2O 四 PCR标准反应体系 DNA模板 纯化的基因组或质粒DNA 由RNA转化得到的cDNA 未经纯化的粗制生物样品 细菌克隆或噬菌斑 四 PCR标准反应体系 Primerdesign 1 Length 18 30bp 2 G Ccontents 40 60 ATCGrandomdistributed 3 primers nocomplementarysequence 4 3 endoftheprimer nomodification 5 5 endoftheprimer canbemodified 6 Specificity lessthan70 homologywithnon specificamplificationsequence or8bpcontinuouscomplementarybase 四 PCR标准反应体系 PrimerdesignedwiththehelpofcomputerDNAdatabaseconservativeregioncomparisionPrimersorBlast 四 PCR标准反应体系 TaqDNA聚合酶离子需要 对Mg2 单价离子性质和浓度较敏感 最适浓度为50mmol L 忠实性 没有校正单核苷酸错配功能 致命弱点 一般出错率为2 10 4核苷酸 每轮循环 利用PCR克隆 测序时尤应注意 抑制剂 尿素 乙醇 DMSO DMF 甲酰胺 SDS 及许多其他化学药剂 内源DNA 不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA 在使用扩增保守序列的通用引物 会在无模板对照管出现扩增带 保存 在 20 至少6个月 四 PCR标准反应体系 PCRoptimization变性温度和时间 92 95 富含G和C的序列 可适当提高 但过高或时间过长都会导致酶活性损失 退火温度与时间引物中G C含量高 长度长并与模板完全配对时 应提高温度 温度越高 产物特异性越高 通常37 55 1 2分钟 延伸温度和时间温度 72 接近Taq酶的最适75 时间 过长会导致产物非特异性增加 但对低浓度的目的序列 则可适当增加时间 循环次数循环过多 非特异性产物大量增加 五 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板纯度蛋白 多糖 酚类等抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度浓度适当 一般100ngDNA模板 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 引物设计引物3 端为关键碱基 5 端无严格限制 合成质量浓度50uL体系引物加量为10 20pmol 五 反应体系对PCR扩增的影响 Mg2 浓度Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 0 5mmol L 2 5mmol L反应体系 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度会影响反应中游离的Mg2 浓度 dNTPMixturedNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 避免反复冻融 浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 五 反应体系对PCR扩增的影响 反应BufferpH 盐离子 稳定剂 增强剂提供缓冲环境ddH2OpH值适当 避免污染 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 一 目的基因的克隆 二 基因的体外突变 三 DNA的微量分析 四 mRNA含量分析 一 目的基因的克隆 利用特异性引物 以cDNA或基因组DNA为模板获得已知的目的基因片段 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因 与反转录反应相结合 直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段 该方法被称为RT PCR技术 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 一 目的基因的克隆1 反转录PCRRT PCR是将RNA反转录和PCR结合起来建立的一种PCR技术 首先进行反转录产生cDNA 然后以cDNA分子为模板 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留复制的机制 使目的cDNA片段得到扩增 由于PCR反应的高度敏感性 从少量的RNA样品 甚至不用进行mRNA的纯化 就可以获得目的基因 2 巢式PCR巢式PCR nestedPCR 也称做嵌套式PCR 主要作用是提高了目的基因获得的灵敏度和特异性 它是通过设计两对引物 一对引物对应的序列在模板的外侧 称外引物 outer primer 另一对引物互补序列在同一模板的外引物的内侧 称内引物 inter primer 外引物扩增的产物较长 含有内引物扩增的靶序列 首先用外引物进行PCR反应 获得的产物再利用一对内侧引物进行第二次PCR反应 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 一 目的基因的克隆3 cDNA末端快速扩增法cDNA末端快速扩增法 RapidamplificationofcDNAEnds RACE 是一种从细胞基因转录产物获得5 端或3 端未知序列的技术 分别被称为5 和3 RACE RACE使用的一对引物中一个是目的基因序列特异性引物 另一个是通用引物 通用引物通常利用polyA 3 RACE 或者在5 同聚尾 5 RACE 序列设计而成 RACE法的用途是利用已知的部分cDNA序列 获得全长序列 已经被用于克隆许多低丰度mRNA 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 二 基因的体外突变利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌和 缺失 点突变等改造 利用PCR技术构建重组体和突变体的方法称为重组PCR recombinantPCR 利用两对引物可以非常容易的在DNA片段的任何位置进行点突变 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 三 DNA的微量分析原位PCR InsituPCR 是由Haase等于1990年首创 它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段 在不破坏细胞的前提下 利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行 扩增 可进行细胞内定位 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 三 DNA的微量分析原位PCR的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 ISH 但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下 该方法的敏感度就明显下降 而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列 敏感度很高 但却未能与细胞形态学研究相结合 IS PCR则可把这两者结合起来 成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术 该法在检测细胞内病毒感染 细胞内基因重排 以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用 在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 三 DNA的微量分析操作步骤1 细胞或组织固定 细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂 包括引物和Taq酶 进入 2 PCR扩增细胞内目的片段 3 原位杂交检测扩增产物 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析1 反转录PCR RT PCR 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析1 反转录PCR RT PCR RT PCR用于对表达信息进行检测或定量 另外 还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA 模板 总RNA或带poly A 的mRNA 酶 逆转录酶和DNA聚合酶引物 随机引物 oligo dT 或基因特异性的引物 GSP 起始 RT PCR可以一步法或两步法的形式进行 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析2 竞争性RT PCR竞争性定量PCR competitivequantitativePCR 技术是在反转录反应前 在反应系统中加入外源性标准品RNA作为内参照 这一标准品RNA与样品RNA同时经历RT PCR反应 根据已知浓度的标准品RNA的反转录和PCR反应效率 计算出处于同一反应中的样品RNA含量 内参照RNA必须使用与样品RNA同样的引物识别序列 但是产物的大小不同 可以在电泳时区别开 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析3 荧光实时定量PCR realtimePCR 根据PCR反应动力学特点设计 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测 从而实现对起始模板定量及定性分析的方法 荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪 通常配有电脑系统及相应的分析软件 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析3 荧光实时定量PCR荧光定量PCR标记方法 荧光标记 内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes FRET 引物特异性探针Amplifluor Intergen 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析3 荧光实时定量PCR5 核酸酶法 PCR反应系统中设计了一个探针 探针的序列与正向和反向引物之间的基因序列互补 Taqman探针3 端Q荧光分子能够吸收5 端R荧光分子发出的荧光 因此 正常情况下该探针检测不到5 端荧光分子发出的荧光 只能检测到3 端荧光分子的荧光信号 但当溶液中有PCR产物 模板 时 探针与模板退火 即产生了适合于核酸外切酶活性的底物 从而激活Taq酶的5 至3 外切酶活性 将探针5 端连接的R荧光分子从探针上切割下来 破坏了两个荧光分子间的FRET 从而发出荧光 切割的R荧光分子数与PCR产物的数量成比例 因此 根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析 RQ PCR方法优点 灵敏而特异起点定量闭管化学 污染的风险低 没有PCR后处理 无需走胶 拍照等 高度自动化定性 单数据点测定定量 多数据点测定能做基因分型及SNP鉴定 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 四 mRNA含量分析荧光实时定量PCR与普通PCR的比较实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控 能够实时地观察到产物的增加 直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合 提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性全程监控 准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便 无需跑胶 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法大规模平行实测法 DNA芯片法 经典方法 新技术方法 Sanger双脱氧链终止法 Sanger和Coulson1977 Maxam GilbertDNA化学降解法 Maxam和Gilbert 1977 DNA测序 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 DNA序列测定末端终止法待测单链DNA 模板 引物 四种dNTP 其中一种用32P 35S标记 终止剂 ddNTP DNA聚合酶Sanger发明 两次获得诺贝尔奖分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 DNA序列测定测序过程 1 模板与引物杂交2 引物的延长和合成阻断四个试管分别加入DNA聚合酶 dNTP标记底物终止剂不同ddA ddG ddC ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3 电泳 A C G T次序 高压电泳4 放射自显影得到直读图象 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 DNA序列测定 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 DNA序列测定自动测序仪 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳 初始数据获取 碱基阅读等步骤自动化 ABIPrism 3100遗传分析仪 二 PCR技术的主要用途及其衍生技术 PCR技术的应用领域 三 增加PCR特异性 一 引物设计 二 引物退火温度 三 引物浓度 四 热启动 五 镁离子浓度 六 扩增长目的片段 三 增加PCR特异性 一 引物设计1 典型的引物18到24个核苷酸长 2 选择GC含量为40 到60 的引物 3 设计5 端和中间区为G或C的引物 4 避免引物对3 末端存在互补序列 5 避免3 末端富含GC 6 避免存在可能会产生内部二级结构的序列 三 增加PCR特异性 二 引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度 Tm Tm对于设定PCR退火温度是必需的 在理想状态下 退火温度足够低 以保证引物同目的序列有效退火 同时还要足够高 以减少非特异性结合 合理的退火温度从55 到70 退火温度一般设定比引物的Tm低5 三 增加PCR特异性 三 引物浓度引物的浓度会影响特异性 最佳的引物浓度一般在0 1到0 5 M 较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增 四 热启动 五 镁离子浓度DNA聚合酶的活性 会影响产量 引物退火 会影响特异性 dNTP和模板同镁离子结合 降低了酶活性所需要的游离镁离子的量 六 扩增长目的片段 四 RT PCR基础 一 增加RT PCR灵敏度 二 增加RT PCR特异性 四 RT PCR基础 一 增加RT PCR灵敏度1