兽医微生物学实习.doc

实习报告学 院: 动物医学院 课 程: 兽医微生物实习 班 级: 动物医学82班 学 号: 1718203 姓 名: 王广操 指导教师: 于勇 职称: 实验师 实习时间 2010年 6 月 7 日至 2010 年 6 月12 日 实习地点 逸夫楼微生物教学实验室4048 2010 年 6 月 13 日南京农业大学教务处制实习报告一、目的要求1 了解大肠杆菌和沙门氏菌（变形和产气）形态与染色特性以及主要培养特性； 2 熟悉大肠杆菌和沙门氏菌（变形和产气）常规微生物学诊断法； 3 掌握大肠杆菌和沙门氏菌（变形和产气）生化试验的方法和原理； 4 熟悉大肠杆菌和沙门氏菌（变形和产气）在选择性和鉴别培养基上的生长表现； 二、实验材料1.菌种：大肠杆菌和沙门氏菌混合液，产气肠杆菌和变形杆菌混合液2.培养基：半固体培养基 SS平板 麦康凯平板 三糖铁高层斜面 蛋白胨水 葡萄糖蛋白胨水 3.革兰式染色试剂：草酸铵结晶紫溶液、革兰氏碘溶液、95%酒精，沙黄水溶液 4. 生化管：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、枸橼酸盐、H2S、尿素5. 生化试剂：吲哚试剂， MR 、VP 试剂三、实验内容及其安排（一）、 配培养基：S.S、麦康凯、半固体、三糖铁高层斜面、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水。（二）、 细菌分离培养：将大肠杆菌、沙门氏菌混合肉汤，产气、变形混合肉汤分别接种麦康凯、SS平板，染色镜检（三）、 挑取麦康凯和SS平板上单一菌落做染色、镜检，挑单一菌落接种三糖铁斜面(涂布、穿刺)（四）、观察三糖铁中细菌生长情况。并挑取三糖铁斜面上的细菌分别接种蛋胨水、葡胨水、半固体、微量生化管，37培养48h。（五）、观察结果。第一天、 配培养基（自由分组，5人/组）第一组 S.S培养基：50g SS培养基+800ml蒸馏水，煮沸溶化浇平板（15ml/块平板），无需高压第二组 麦康凯培养基： 44g麦康凯培养基+800ml蒸馏水+1.6g琼脂粉，煮沸，高压15磅，15分钟，浇平板第三组 三糖铁琼脂：30.5g三糖铁琼脂+500ml蒸馏水，煮沸溶化， 装长试管50根（10ml/管）， 高压15磅，15分钟，做高层斜面第四组 葡萄糖蛋白胨水：1.25g蛋白胨+1.25g葡萄糖+1.25g磷酸氢二钾+250ml水，加热溶解，调pH至7.6，分装40根短试管高压（3指半高，约5-8ml）第五组 蛋白胨水：1.25g蛋白胨+0.625gNaCl+125ml水，调pH至7.6，分装40根短试管，捆扎，高压，12115分钟（2指高，约2-4ml）第六组 半固体：分别称取蛋白胨5g、牛肉膏2.5g、氯化钠2.5g、磷酸氢二钾0.5g、蒸馏水500ml，加热溶解，调pH7.6，过滤称琼脂粉2g+肉汤500ml,煮沸，待琼脂粉完全溶化，分装短试管（2指高，约2-4ml）第二天、 分离培养1.在麦康凯平板和SS平板上接种待检材料（大、沙混合菌液;产气、变形混合菌液）2.置37恒温培养箱内培养24小时3.观察每种平板上细菌的生长情况4.比较单个菌落的形态：染色镜检SS琼脂 强选择性培养基1.培养基中的煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、柠檬酸钠抑制非肠道 菌生长2.不能发酵乳糖的细菌，菌落橘黄色3.分解乳糖的细菌产酸，使胆盐呈胆酸析出，形成中心混浊的深红色菌落4.柠檬酸铁使产生硫化氢的菌落中心呈黑色5.硫代硫酸具有缓和胆盐对细菌的有害作用及煌绿、中性红的毒性作用。麦康凯培养基1.用于肠道菌的分离与鉴定2.能分解乳糖的细菌-菌落红色3.不能分解乳糖的细菌菌落灰白色第三天 观察结果 接种三糖铁1.观察麦康凯、S.S平板上细菌生长情况可看到几种菌落，是否圆形光滑凸起透明的菌落实验结果：（1）SS琼脂 强选择性培养基：有橘黄色圆形凸起中心为黑色的菌落，橘黄色为变形杆菌，黑色为产气杆菌。（2）麦康凯培养基：呈红色圆形凸起菌落和呈灰白色圆形凸起的菌落。其中红色菌落为产气杆菌，灰白色菌落为变形杆菌。（3）镜鉴结果：革兰氏阴性杆菌。2.挑取单个的细小透明菌落或者红色菌落的一半作革兰氏染色，镜检，另一半菌落接种三糖铁培养基（接种时，先涂布斜面，后穿刺底层）、接种蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、半固体3.37恒温培养24-48h。三糖铁琼脂1.用于测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的发酵作用及能否产生硫化氢2.能发酵乳糖、蔗糖 培养基呈黄色3.发酵葡萄糖不发酵乳糖、蔗糖 底层呈黄色、斜面部分为红色(少量酸接触空气而氧化 细菌生长利用含氮物质,生成碱性化合物)4.能产生硫化氢 培养基呈黑色5.能产气的细菌 底层琼脂内有气泡第四天 观察结果 做生化试验1.观察细菌在三糖铁斜面/底部的生长情况：是否产酸产气，培养基是否变红。实验结果：（1）三糖铁斜面变红，底层呈黄色，培养基呈黑色，底层琼脂内有气泡。即细菌能发酵葡萄糖不发酵乳糖、蔗糖并能产生硫化氢和气体。（2）半固体培养基穿刺线周围培养基变混浊。即细菌有运动能力，可由穿刺线向四周扩散生长。2.挑取三糖铁斜面上的细菌分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、尿素、硫氨基酸、枸橼酸盐培养基，37培养24h，观察结果，记录。实验原理：（1）糖发酵试验。多糖单糖丙酮酸酸性产物(或产酸产气)pH 指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现)。（2）枸橼酸盐利用试验。某些细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯一碳源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是指示剂呈碱性反应。（3）硫化氢试验。细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色的硫化铅或硫化亚铁。（4）尿素酶试验。产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。第五天 生化结果判定1 靛基质试验（吲哚试验）原理：细菌若含有色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。操作：取出试管（蛋白胨水）乙醚1ml，振荡，静置，待分层后沿管壁加入对二甲基氨基苯甲醛3-5滴，在分界处出现红色玫瑰吲哚为阳性。2葡萄糖蛋白胨水一分为二（1）甲基红（MR）试验：取出试管加入甲基红3-5滴，摇匀，培养基变红色为阳性，不变色为阴性原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。（2）VP试验：取出试管VP甲液0.6ml，摇匀再加VP乙液0.2ml，15min后看结果，变红为阳性，不变为阴性，橙色为结果不可信，需重做。原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。细菌生化反应结果表三糖铁糖发酵MRVP吲哚尿枸运动性斜面底层H2S葡乳麦甘蔗大黄黄+产黄黄+变红黄+兔沙红黄+本次实习本班做变形杆菌的小组VP与甲基红检验均为阴性，但甲基红应为阳性实验结果不准确，经PH测量大约在6左右与空白葡萄糖蛋白胨培养基PH相近。经镜检培养基中含有细菌，但细菌浓度不高，现分析原因如下：1、 葡萄糖蛋白胨的PH应为7.6而本班所做的培养基为6偏酸性，可能对变形杆菌的生长存在影响。2、 VP与甲基红实验是接种细菌两天后才进行的实验，而据课本细菌生长曲线20至24小时为稳定期，24小时候已经进入衰亡期，这也可能是造成细菌数量较少的原因之一。3、 变形杆菌属于兼性厌氧菌，在试管中不通气培养48小时对培养基的氧浓度及PH会有较大影响，同样可能会对细菌增长不利。大肠杆菌与沙门氏菌在三糖铁琼脂斜面与底部生长表现有何不同？简述原理。三糖铁培养基有如下作用：可以用来测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的发酵作用及能否产生硫化氢能发酵乳糖、蔗糖 的细菌使培养基呈黄色发酵葡萄糖不发酵乳糖、蔗糖的细菌使培养基底层呈黄色、斜面部分为红色(可能原因1.葡萄糖发酵生成酸暴露在空气中氧化生成碱性物质 2.细菌生长利用含氮物质,生成碱性化合物)能产生硫化氢的细菌使培养基呈黑色（硫化氢与培养集中的铁结合形成硫化亚铁黑色物质）能产气的细菌底层琼脂内有气泡（若产气过多会出现培养基断层现象）大肠杆菌在三糖铁培养基中生长良好，能发酵葡萄糖，乳糖，不发酵蔗糖，培养基黄色，产气不产硫化，氢形成圆形凸起，光滑，湿润，半透明，灰白色菌落，有些地方长成粘稠菌苔；沙门氏菌在三糖铁培养基斜面红色，中间黑色，下面黄色，菌落较小，不发酵乳糖，无色，有些地方长成粘稠菌苔。学生自我鉴定：在实习过程中，我进一步熟悉细菌的培养的方法，分离以及鉴定的方法，增强了实验操作水平和动手能力，并且巩固了微生物的理论知识。虽然实习只有短短的五天时间，但在这五天里是对兽医微生物实验的一个系统的认识，并且和同学们协作完成实验，增强了相互间的交流合作，这对于我们每个人来说都是有益的。当然在实验过程中也会有不如人意的地方，例