CR引物设计及相关软件使用.ppt

PCR引物设计及相关软件使用 重庆大学生物工程学院杨应斌 主要内容 背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件PrimerPremier5 0介绍Oligo6 22介绍在线Primer3介绍 PCR 聚合酶链反应 PolymeraseChainReaction PCR 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出优点 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 使肉眼能直接观察和判断 可从一根毛发 一滴血 甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定 PCR 引物设计是PCR技术中至关重要的一环 使用不合适的PCR引物容易导致实验失败 表现为扩增出目的带之外的多条带 如形成引物二聚体带 不出带或出带很弱 等等 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行 可以直接提交模板序列到特定网页 得到设计好的引物 也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应 即错配 影响因素 如引物长度 primerlength 产物长度 productlength 序列Tm值 meltingtemperature 引物与模板形成双链的稳定性 internalstability 用 G值反映 形成引物二聚体 primerdimer 及发夹结构 duplexformationandhairpin 的能值 在错配位点 falseprimingsite 的引发效率引物及产物的GC含量 composition 等等 必要时还需对引物进行修饰 如增加限制性内切酶位点 引进突变等 一般原则 引物的长度一般为15 30bp 常用的是18 27bp 但不应大于38 因为过长会导致其延伸温度大于74 不适于TaqDNA聚合酶进行反应 引物序列在模板内应当没有相似性较高 尤其是3 端相似性较高的序列 否则容易导致错配 引物3 端出现3个以上的连续碱基 如GGG或CCC 也会使错误引发机率增加 一般原则 3 引物3 端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响 不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率 末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基 因此应当避免在引物的3 端使用碱基A 另外 引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 5 端序列对PCR影响不太大 因此常用来引进修饰位点或标记物 一般原则 4 引物序列的GC含量一般为40 60 过高或过低都不利于引发反应 上下游引物的GC含量不能相差太大 5 引物所对应模板位置序列的Tm值在72 左右可使复性条件最佳 Tm值的计算有多种方法 如按公式Tm 4 G C 2 A T 在Oligo软件中使用的是最邻近法 thenearestneighbormethod 一般原则 6 G值是指DNA双链形成所需的自由能 该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性 应当选用3 端 G值较低 绝对值不超过9 而5 端和中间 G值相对较高的引物 引物的3 端的 G值过高 容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应 一般原则 7 引物二聚体及发夹结构的能值过高 超过4 5kcal mol 易导致产生引物二聚体带 并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行 一般原则 8 对引物的修饰一般是在5 端增加酶切位点 应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定 常用的引物设计软件 Oligo6 引物评价 PremierPrimer 自动搜索 VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 在线服务 PrimerPremier5 0的使用技巧简介 主要功能 1 即引物设计2 限制性内切酶位点分析3 DNA基元 motif 查找4 同源性分析 简并引物设计 根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1 纤毛虫大核 CiliateMacronuclear 2 无脊椎动物线粒体 InvertebrateMitochondrion 3 支原体 Mycoplasma 4 植物线粒体 PlantMitochondrion 5 原生动物线粒体 ProtozoanMitochondrion 6 一般标准 Standard 7 脊椎动物线粒体 VertebrateMitochondrion 8 酵母线粒体 YeastMitochondrion PrimerPremier5 0使用介绍 1 PreimerPremier启动界面 Loadsequence 基本信息 Sequencename Originalsequence UsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好 Chooseafunction 引物设计界面 Firstyoucandesigntheprimermanually Sensestrandoranti sensestrand Usefulinformationoftheprimer 引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5 引物位置范围 3 引物位置范围 产物大小范围 引物长度 搜索结果 28对引物 引物分值100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin dimer falseprimingandcrossdimer 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构 因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 引物编辑 引物编辑 Editprimerhere Analysistheeditresult AccepttheeditresultReturntothemainwindow SomeotherusefulfunctionofPP5 Enzyme Meltingtemperaturegraph Per25 mer GC graph Per25 mer Stability Per5 mer 心肌特异性表达双顺反子载体的构建 pIRESneo 2质粒克隆扩增 MYL2序列查询及启动子功能分析 不加酶切位点引物设计 基因组DNA制备 高保真PCRCloning 大量纯化的MYL2promoter片段 酶切获得无promoter线性质粒载体片段 DNALigationReaction 转入DH5a ColonyScreening PCRIdentification MYL2promoterpIRESneo pEGFP c3质粒克隆扩增 酶切获取MYL2promoterPlasmidvector开环分子 酶切获得EGFP片段 酶切及凝胶电泳鉴定及回收 环状DNA分子 DNALigationReaction 环状DNA分子 转入DH5a ColonyScreening PCRIdentification rat原代胚胎心肌细胞培养及冻存 MYL2promoterpIRES neo EGFP 心肌细胞 脂质体 荧光鉴定 rat心肌细胞特异表达EGFP 无绿色荧光蛋白表达 达到目的