生化制药学-生化药物.doc

本科药学第二学期生化制药学-生化药物生化制药学试卷1一 名词解释（每小题4分，共20分）：1. 超滤 2. 离心沉降系数 3. 酶单位 4. 核酸类药物5. 糖胺聚糖二 简答（每小题10分，共50分）： 1.简述有机溶剂分级沉淀的基本原理。 2. 蛋白质的颜色反应有哪些？3. 简述肝素的临床应用。4. 简述鱼油多不饱和脂肪酸EPA和DHA的药理作用。5. 简述定磷法测定RNA含量的基本原理。 三 论述（每小题15分，共30分）： 1. 试述糖胺聚糖的提取方法和原理。2. 什么是蛋白质的沉淀？简述蛋白质沉淀的几种方法和条件。山东大学生化制药学试卷1标准答案一名词解释1. 在一定压力下，使用一种特制的半透膜（不同分子量的截留膜）对混合物中不同分子进行选择性过滤而分离方法。膜上的小分子物质可以通过，而大分子物质受阻截留在膜的表面。2. 指单位离心力作用下粒子的沉降速度。3. 酶的1个活力单位是在该酶的最适条件下，在25，1分钟内催化lmol的底物转化为产物的酶量。4.核酸类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷、碱基以及它们的类似物和衍生物。5. 动物来源的含有氨基己糖（己糖胺）的多糖总称为糖胺聚糖。糖胺聚糖多是含有糖醛酸和氨基糖残基的多糖。二 简答1. 加入有机溶剂一是降低了溶液的介电常数，使物质的溶解度降低；二是破坏了两性电解质的水化膜，从而产生沉淀。2. （1）茚三酮反应蛋白质和茚三酮混合加热，反应呈现蓝紫色。（2）双缩脲反应 蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+产生紫红色反应。（3）酚试剂反应 在碱性条件下蛋白质分子中的酪氨酸色氨酸可与酚试剂反应呈现蓝色。3. 肝素是需要迅速达到抗凝作用的首选药物，也可用于外科预防血栓形成及妊娠者的抗凝治疗，对于静脉或皮下注射给与肝素适当的剂量，使病人开始即能迅速达到低凝状态。对于急性心肌梗死患者可用其预防病人发生静脉血栓栓塞病，并可预防大块的前壁透壁性心肌梗死病人发生动脉栓塞。还可以用于心脏手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。还用于治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血，也用于治疗肾小球肾炎、肾病综合征、类风湿性关节炎等。4. （1） 调血脂，(2)抗血小板聚集，(3)改善血液流变学，(4)扩张血管，(5)改善末梢循环，(6)抗炎作用，(7)延长凝血时间，(8)改善大脑功能，促进记忆。 5. 此法首先必须将RNA 中的磷水解成无机磷。常用浓硫酸或过氯酸将RNA消化，使其中的磷转变成正磷酸。正磷酸在酸性条件下与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸等）存在下，立即还原成钼蓝。钼蓝的最大光吸收在660nm处，在一定浓度范围内，溶液在该处的光密度和磷的含量成正比，从而可通过测光吸收度，用标准曲线算出样品的含磷量。根据对RNA和DNA的分析，已知前者的磷含量为9.4，后者的为9.9，于是可从磷含量推算出核酸的含量。三 论述1. （1）非降解法：非降解法是指用水或盐溶液从动物组织中提取粘多糖的方法。此法适用于与其他组织结构联接不牢固的粘多糖或其蛋白复合物的提取，如从玻璃体、脐带、关节滑液中提取玻璃酸。用本法提取的粘多糖仍结合有蛋白质，需用酶解等方法去除。（2）降解法：碱处理法：用碱处理的方法可以从组织中对粘多糖进行较完全的提取。例如，已经成功他用此法从软骨中提取硫酸软骨素。此法的缺点是，粘多糖分子有从裂解的一端被碱进一步降解的可能。所以如果希望药物成分在特定的范围内保持分子完整，则不宜用此法，或尽可能地使用稀碱并避免高温。为了避免在碱处理时可能发生的一些糖苷键的断裂，用碱提取可以在硼氢化物存在下进行，硼氢化物可使木糖残基还原为木糖醇，因而能成功地阻止进一步降解。 酶处理法：用蛋白酶消化，是常用的从组织中释出粘多糖的方法之一。通常选用专一性低的蛋白酶，以进行广泛的蛋白质水解。常用的有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、糜蛋白酶等。从组织中释出粘多糖，有时选用含有多种酶类的混合酶更具有优越性。如用胰酶或胰脏，它们含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多种酶类，不仅具有水解蛋白质的广谱性，而且还可水解脂肪使提取易于操作，水解糖原等以减轻对粘多糖的污染。2. 蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。蛋白质沉淀反应是蛋白质提取、分离不可缺少的手段。在蛋白质的沉淀反应中根据需要通过控制沉淀条件可以得到变性或不变性的蛋白质。(1) 中性蛋白质沉淀反应 在溶液中加入中性盐即正盐而使蛋白质沉淀的现象，称为盐析。中性盐对于蛋白质的作用有两个方面。低浓度的个性盐离子减少蛋白质分子之间静电引力，增加蛋白质和溶剂的相互作用力而增加溶解度，这现象称为盐溶。但随着中性盐浓度的增加，蛋白质表面的电荷大量被中和，最后破坏蛋白质表面的水化膜，促使蛋白质分子聚集而沉淀。(2)有机溶剂沉淀反应 在蛋白质溶液中加入一定量的水溶性有机溶剂(如乙醇、丙酮)，有机溶剂与水的相互作用使得蛋白质分子表面的水化膜厚度降低，蛋白质分子容易相互聚集而从溶液中沉淀析出。优点在于：分辨率较盐析法高，沉淀物不必进行脱盐，可以直接挥干有机溶剂，简化操作。但有机溶剂沉淀蛋白质有可能蛋白质变性，这取决于有机溶剂的浓度、有机溶剂与蛋白质接触的时间，以及沉淀时的温度等。(3) 加热沉淀反应 加热可以使大多数蛋白质变性沉淀，但在偏酸或偏碱的环境中加热虽然可以使蛋白质变性，却不一定沉淀。对于热稳定的蛋白质或多肽，可以利用在杂蛋白等电点时加热的方法沉淀除去杂蛋白。(4) 金属盐沉淀反应 蛋白质比其等电点高的PH溶液中带负电荷，可与一些带正电荷的金属离形成不溶性蛋白盐复合物沉淀析出。(5) 生物碱试剂和某些酸类沉淀反应 蛋白质比其等电点低的PH 溶液中带正电荷，可以于苦味酸、磷鉬酸、鞣酸、磷钨酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等试剂结合成不溶性复合物沉淀析出。但蛋白质于生物碱试剂形成的复合物多为不可逆结合，因此用于制备活性蛋白质时应尽量采取较温和的条件，并加入一定量的稳定剂。 多肽由于分子较小，与生物碱试剂反应不易沉淀析出。所以生物碱试剂常用于鉴定多肽制剂中是否含有蛋白质杂质。向多肽溶液加入一定量的磺基水杨酸，不应出现浑浊，否则多肽纯度不合格。山东大学生化制药学试卷2一 名词解释（每小题4分，共20分）：1. 凝胶层析 2. 氨基酸输液3.酶的比活力 4. 糖复合物 5. 蛋白质的变性 二 简答（每小题10分，共70分）：1. 蛋白质结合上带正电荷的金属离子后其等电点向什么方向偏移？为什么？2. 简述免疫核糖核酸的药理作用与临床应用。 3. 肝素的临床应用有哪些？4. 稳定蛋白质胶体的因素有哪些？ 5. 简述胆汁酸的生理功能。三 论述（每小题15分，共30分）：1. 试述多肽和蛋白质药物的常用纯化方法。2. 试述糖胺聚糖的纯化方法。山东大学生化制药学试卷2标准答案一 名词解释1. 是指混合物经凝胶层析柱分离时，混合物是因分子大小不同而被分离的技术。2. 氨基酸输液是多种L-氨基酸按一定比例配制而成的静脉营养输注液。此外还有依治疗要求配制的专用输液。3. 是指每毫克蛋白质酶单位的数目(units/mg)。4. 是由糖和其它化合物组成的复合物。5. 在某些物别因素的作用下，蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，生物活性丧失和些理化性质改变的现象，称为蛋白质的变性。二 简答1. 蛋白质的带电质点与阳离子或阴离子结合后其pI发生偏移，结合较多的阳离子（如Mg2+、Ca2+、Zn2+等），则等电点向较高的pH值偏移。因结合阳离子后相对的正电荷增多了，只有pH升高后才能达到等电状态。2免疫核糖核酸是重要的免疫调节剂，临床上常与特异性转移因子、聚肌胞等药物合用具有明显的抗肿瘤作用。已有用于治疗消化道肿瘤、肝癌、肾癌、膀肮癌、乳腺癌、黑色素瘤等的报道，对慢性乙型肝炎也有一定的疗效。3. 肝素是需要迅速达到抗凝作用的首选药物，也可用于外科预防血栓形成及妊娠者的抗凝治疗，对于静脉或皮下注射给与肝素适当的剂量，使病人开始即能迅速达到低凝状态。对于急性心肌梗死患者可用其预防病人发生静脉血栓栓塞病，并可预防大块的前壁透壁性心肌梗死病人发生动脉栓塞。还可以用于心脏手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。还用于治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血，也用于治疗肾小球肾炎、肾病综合征、类风湿性关节炎等。4. 稳定蛋白质腋休的因素有二：一是蛋白质表面所带相同电荷之间相互排斥，不易凝聚成团而沉淀；二是蛋白质表面形成的水化膜，它使胶体颗粒与水融治相处，又在胶体颗粒间起到隔离作用。如果两个因素全部被破坏，则蛋白质将从溶液个沉淀析出。5 （1）促进脂类的消化吸收作为乳化剂，体内胆汁酸以胆盐形式存在，胆盐分子的一端是极性的羧基或磺酸基，另一端则为非极性的甾醇环，是一种乳化剂，可在脂肪和水之间形成中间单分子层，使脂肪与水的界面张力降低，而将脂肪乳化为微粒，分散于水相中，从而增加脂肪在小肠中与脂肪酶的接触面积，使消化作用容易进行。一部分高度乳化的脂肪微粒，可以直接由肠粘膜吸收。（2）抑制胆汁中胆固醇的析出。三 论述1. (一) 利用溶解度不同的纯化方法：利用蛋白质溶解度不同进行分离的方法有盐析法、热变性法等。(二)利用分子形状和大小不同的纯化方法：蛋白质分子形状各异，有细长如纤维状，有些则密实如球形，分子量侧从6000左右至几百万不等。利用这些差别，可以采用凝胶层析及超滤法来分离蛋白质。(三)利用电离性质不同的纯化方法： 组成蛋白质分子的某些氨基酸残基侧链基团台有各种可解离的基团，如谷虱酸和天冬氨酸含有按基，赖氨酸含有氨尽，组氨酸含有眯哗基，桔氨酸含有肥基，酪氨酸台有酚基，色氨酸含有叫保基等。这些基因的数量和分布各异、使得不同的蛋白质表团的带电情况不尽相同。所以可以利用这种电离性质上的差异来分离纯化蛋白质。离子交换法是利用电荷性质分离蛋白质的最常用的方法。电泳法亦较常用。(四)利用生物功能专一性的不同纯化蛋白质：蛋白质是有专一生物功能的物质，通过与其它生物大分子或小分子物质相互结合而发挥其功能，这种结合方式经常是专一且可逆的。如抗原与抗体、激素与受体的结合等。蛋白质与其对应的分子问的这种结合能力称为亲和力。利用蛋白质这一特性可进行亲和层析来纯化蛋白质。首先将具有高度特异性和亲相力的配基与不镕性载体(如琼脂糖凝胶)牢固结合，装入层析柱(称为亲和杆)，在一定的流动相中将含有待分离蛋白质的样品通过该枪，由于专亲和力的作用，待分离蛋白质与柱上的配基结合而留在柱内，其它杂蛋白则流出柱外。然后改变洗脱液性质，降低待分离蛋白质与其配基的亲和力，则可洗脱得到待分离的蛋白质。 亲和层析的优点是条件温和、操作简单、效率高，特别是对分离含量低而又不稳定的蛋白质尤为有效。甚至从粗提液中经亲和层析一步就能将蛋白质提纯几百至几千情。其局限性在于不是任何蛋白质都有特定的配基，而且针对某蛋白质还需要制备含有其配基的特定层析载体及制定相应的法析条件。2. （1）乙醇沉淀 用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收糖胺聚糖的简单方法，由于不同性质或不问分于量的糖胺聚糖沉淀所需乙醇浓度不同，它同样也可用于样品中不同糖胺聚糖组分的分级分离。 （2）季铵化合物沉淀 糖胺聚糖的聚阴离子与某些表面活性物质，如十六烷基三甲基溴化铵等能形成季铵络合物，这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解。在离子强度大时，这种络合物可以解离并溶解。不同的糖胺聚糖聚阴离于电荷密度不同，使其络合物溶解时所需盐的浓度也不同，因而可用于进行分级分离。降低PH值以抑制羧基的电离，硫酸化粘多搪沉淀的选择性可增强。 季铵化合物除了在糖胺聚糖的分级分离中有应用价值外，还用于从组织消化液和其他溶液中回收糖胺聚糖。由于生成的络合物溶解度低，可用于0.01%或更稀溶液中的糖胺聚糖回收。（3）离子交换层析 糖胺聚糖由于具有酸性基因如糖醛酸羧基和各种硫酸基，在溶液中以聚阴离子的形式存在，因而可用阴离子交换剂进行交换吸附。可选用的阴离子交换树脂有D-254、Dowex12、DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-25等。（4）凝胶过滤分离 根据糖胺聚糖分子量大小不同，可选用合适的分子筛，如葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等进行分级分离。其中最常用的是葡聚糖凝胶，例如用SePhadex G-75分级分离低分子肝素。（5）超滤分离 利用超滤进行分级分离也是基于糖胺聚糖分子旦大小的不同。可根据需要，选用具有合适的分子量截留值的膜。这种方法的优点是适用于大规模的生产，并可使存在于截留液中的糖胺聚糖得到浓缩和除去小分子杂质。山东大学生化制药学试卷3一、 名词解释（每小题4分，共20分）：1. 亲和层析 2. 免疫核糖核酸 3. 盐析 4. 蛋白质的等电点 5. 糖生物学二、 简答（每小题10分，共50分）：1. 简述凝胶层析法测定分子量的原理；2. 简述氨基酸的主要药理作用。 3. 定磷法测定RNA含量的原理是什么？ 4. 简述鹅去氧胆酸的药理作用。5. 稳定蛋白质胶体的因素有哪些？三、 论述（每小题15分，共20分）：1. 试述低分子肝素的药理作用。2. 试述基因治疗的策略。山东大学生化制药学试卷3标准答案一、 名词解释1. 指在一种特制的具有专一性吸附能力的吸附剂上进行的层析。2. 免疫核糖核酸(iRNA)是指从致敏动物的细胞中提取的RNA，分子量约135000，具有调节免疫功能的作用。3. 向蛋白质溶液中加入大量盐使其达到一定浓度时，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀出来，这就是盐析。4.在某个pH溶液中，蛋白质表面带的正电荷与负电荷相等，即蛋白质解离为正离子和负离子的趋势相等，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。5. 研究糖蛋白和糖脂的合成以及糖基转移酶的分子生物学，细胞的分化发育、细胞内的信号通路和传递受体，糖与免疫学和神经生物学的关系，宿主和病原体的相互作用，糖基化和疾病等的科学。二、 简答1. 根据公式原理，用已知分子量的标准品经凝胶层析柱分离获得不同的洗脱体积，用分子量与洗脱体积作图，将待测物质的洗脱体积从曲线图上或通过公式即可计算出分子量的大小。（也可不用公式，而用语言描述）。 2. 氨基酸类药物是治疗因蛋白质代谢紊乱和缺乏所引起的一系列疾病的生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。氨基酸的主要药理作用有：作为营养补剂；降血氨；保护作用；转变成重要的生物活性物质；离子载体。3.此法首先必须将RNA 中的磷水解成无机磷。常用浓硫酸或过氯酸将RNA消化，使其中的磷转变成正磷酸。正磷酸在酸性条件下于钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、-1，2，4-氨基萘酚磺酸或氧化亚锡等）存在下，立即还原成钼蓝。钼蓝的最大光吸收在660nm处，在一定浓度范围内，溶液在该处的光密度和磷的含量成正比，从而可通过测光吸收度，用标准曲线算出样品的含磷量。根据对RNA和DNA的分析，已知前者的磷含量为9.4，后者的为9.9，于是可从磷含量推算出核酸的含量。4. CDCA主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度，从而使结石中的胆固醇溶解、脱落。一般当CDCA占胆汁中胆盐的70时，胆固醇就处于不饱和状态。大剂量的CDCA(每日1015mgkg)可以抑制胆固醇的合成，并增加胆石症患者胆汁的分泌，但其中的胆盐和磷脂分泌量维持不变。 5. 稳定蛋白质腋休的因素有二：一是蛋白质表面所带相同电荷之间相互排斥，不易凝聚成团而沉淀；二是蛋白质表面形成的水化膜，它使胶体颗粒与水融治相处，又在胶体颗粒间起到隔离作用。如果两个因素全部被破坏，则蛋白质将从溶液个沉淀析出。三、论述1. LMWH主要通过亲和于AT-III和肝素辅因子而发挥抗血栓作用。AT-III可抑制活化的凝血因子，包括凝血酶、凝血因子a、a、a和a，主要是抑制凝血酶和因子a。LMWH作为催化剂，可使凝血酶与AT-III复合物以及凝血酶与因子a 复合物的形成速率提高约1000倍。这种抗a因子作用与体内抗栓形成作用密切相关。此外，LMWH可以促进释放纤维蛋白溶酶原激活剂和缩短优球蛋白溶解时间，并能促进释放脂蛋白脂酶(LPL)和肝三酰甘油脂酶(HTGL)。 LMWH皮下注射23h后达血浆峰浓度，半衰期约4h，比UFH长1倍LMWH的生物利用度约90。而UFH仅约20。LMWH的这些特征，使之每日只需皮下注射1次，可作为长程预防治疗。然而必须注意，不同方法生产的LMWH具有不同的药理特征，不同产品应作不同试验。2. （1）离体基因治疗: 将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞或其它细胞，再将这些修饰过的靶细胞转入体内。（2）原位基因治疗: 将目的基因载体直接注射或导入体内的肿瘤组织，进行局部治疗，这也是最主要的方法。（3）体内基因治疗: 将目的基因载体注射到血液系统进行全身治疗。山东大学生化制药学试卷4一 名词解释（每小题4分）：1. 有机溶剂分级沉淀法2. 糖工程3. 脂质类药物 4. 结合蛋白 5. 酶结晶的透析平衡法二 简答（每小题10分）:1. 氨基酸的分离方法有哪些？其原理是什么。2. 去掉糖胺聚糖中残存蛋白质的方法有那些？3. 如何选用亲和层析用载体？4. 简述定磷法测定RNA的原理。5. 超氧化物歧化酶的临床应用。三 论述（每小题15分）1. 简要论述粘多糖的提取方法有哪些2. 什么是蛋白质的沉淀？简述蛋白质沉淀方法及其条件？山东大学生化制药学试卷4标准答案一 名词解释1. 利用生物大分子在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称为有机溶剂分级沉淀。2. 研究内容包括发展糖药物的重组与表达，宿主细胞的糖基化工程，糖蛋白生产系统，糖或糖蛋白的药理作用和诊断应用，在体内的寿命和靶向性，以及质控等。3. 具有特定的生理、药理活性，并已用于防治疾病的脂质，称为脂质类药物。4. 有些蛋白质有两部分组成，除了具备完整的蛋白质部分外，还必须含有非蛋白质部分才具有生物学活性，这类蛋白质成为结合蛋白，其非蛋白质部分称为辅基。5. 将酶液装入透析袋，置于一定饱和度的盐溶液或有机溶剂中进行透析，袋中酶可缓慢达到饱和状态而析出结晶。二 简答1. （1）溶解度法或等电点法：溶解度法是根据不同氨基酸在水和乙醇等溶剂中的溶解度不同，而将氨基酸彼此分离。由于氨基酸在等电点时溶解度最小，易沉淀析出的性质而进行分离。（2）特殊沉淀剂法：氨基酸可以和一些有机化合物或无机化合物生成具有特殊性质的结晶性衍生物，利用这一性质可分离纯化某些氨基酸。（3）离子交换法：是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力不同而分离纯化氨基酸的方法。氨基酸为两性电解质，在一定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，对同一种离子交换剂的吸附力也不同，故可对氨基酸混合物进行分组或单一成分的分离。2. 方法有:（1）等电点沉淀法；（2）加热变性法；（3）蛋白质沉淀剂法。或两种以上的方法结合使用，如调pH值与加热相结合。对于结合于糖胺聚糖分子上未完全水解的蛋白质，可选用较高纯度的蛋白酶进行水解，最好选用与提取时使用的不同的酶。 3. 惰性的，尽可能少的物理吸附及离子交换非专一性吸附；大量的活化基团，在较温和的条件下与配基偶联； 多孔、网状、允许被亲和物自由通过； 有较好的物理和化学稳定性；良好的机械强度。4. 用浓硫酸或过氯酸将RNA消化，使其中的磷变成正磷酸，在酸性条件下与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂的存在下，立即还原成钼蓝，钼蓝的最大吸收波长在660nm处，在一定浓度范围内，溶液的光密度和磷的含量成正比，可用标准曲线算出样品的含磷量。5. 对自身免疫性疾病的治疗作用：类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肌炎等是胶原性的自身免疫性疾病（胶原病），用SOD处理，均可获得缓解和治愈。治疗其它炎症及水肿：用SOD静注治疗肺炎有特效。此外，SOD对各类过敏性所致水肿如抗血清引起的皮肤水肿、角叉菜聚糖引起的脚部水肿以及其它炎症性水肿都有疗效，对各类细菌引起的发炎也有较好的疗效。其他：SOD也用于抗辐射、抗肿瘤，治疗氧中毒、心肌缺氧与缺血再灌注综合征以及某些心血管疾病。三 论述1. （1）非降解法：非降解法是指用水或盐溶液从动物组织中提取粘多糖的方法。此法适用于与其他组织结构联接不牢固的粘多糖或其蛋白复合物的提取，如从玻璃体、脐带、关节滑液中提取玻璃酸。用本法提取的粘多糖仍结合有蛋白质，需用酶解等方法去除。（2）降解法： 碱处理法：用碱处理的方法可以从组织中对粘多糖进行较完全的提取。例如，已经成功他用此法从软骨中提取硫酸软骨素。此法的缺点是，粘多糖分子有从裂解的一端被碱进一步降解的可能。所以如果希望药物成分在特定的范围内保持分子完整，则不宜用此法，或尽可能地使用稀碱并避免高温。为了避免在碱处理时可能发生的一些糖苷键的断裂，用碱提取可以在硼氢化物存在下进行，硼氢化物可使木糖残基还原为木糖醇，因而能成功地阻止进一步降解。 酶处理法：用蛋白酶消化，是常用的从组织中释出粘多糖的方法之一。通常选用专一性低的蛋白酶，以进行广泛的蛋白质水解。常用的有胰