原始标本涂片检查对微生物检验全过程的导航作用.doc___200566222728.doc

原始标本涂片检查对微生物检验全过程的导航作用过祥豹（第四军医大学，西安 710032）目前微生物学检验正向自动化发展。根据美国推行自动化中的教训，标本涂片手工操作仍不能缺少。原始标本未染色湿片位相显微镜观察和染色标本片检查，不仅对诊断提供快速有价值的信息，对微生物检验全过程能起到导向和领航作用。这是涂片对培养的“反向”作用，值得引起注意。本文对各种原始标本涂片方法、作用等作一简单叙述。1 微生物检验中原始标本涂片检查不能缺少新西兰奥塔哥大学在培养医学检验高级人才中特别强调，自动化仪器虽然值得应用，但检验人员对其结果仍要细心判断和核对，且不是适用于每种试验。在微生物检验中，手工制作的标本片在显微镜下详细观察仍很必要。美国一些实验室在推行微生物检验自动化过程中走过弯路。由于忽略了对标本片中培养菌落的观察，常使自动化检验结果答非所问，甚至误导。后把有经验技师请回，作涂片和平板的判读（smear and plate reading ）,才校正了偏差。临床微生物检验技术向来是以培养为核心，这是肯定和明确的。因通过培养能分离和鉴定致病菌作病原学诊断，取得菌种进行药敏试验，对病人作针对性治疗。培养也可验证涂片镜检所见，使之更有科学性。2 原始标本涂片的检查方法2.1 不染色标本湿片特别推荐位相显微镜检查未染色湿片加盖玻片后还可在位相显微镜下用油镜检查。由于放大倍数大和光线处理得当（位相明视野中微生物可呈暗色），显现微生物更加清晰。位相集光器和位相镜头与普通集光器和油镜头可装同一架显微镜上，旋转相应集光器和镜头，即可自由可选择。有的显微镜附有上下升降的特别集光器，调节至适当位置，通过位相物镜就能观察未染色标本明视野中明对比和暗对比，以及暗视野各个连续图像。血液可疑阳性培养物应用位相显微镜湿片检查，比较容易发现以下微生物：厌氧菌，布鲁菌，嗜血杆菌，其他革兰氏阳性小杆菌，弯曲菌，螺杆菌，疏螺旋体，钩端螺旋体及曲霉菌等（它们用革兰氏染色常漏检），还能观察微生物的动力。丹麦微生物实验室将血培养物的位相显微镜检查早已定为工作常规，在检查未离心小便湿片时，又将位相显微镜观察作为小便细菌数半定量测定，辅助诊断尿路感染。台湾蔡文城教授在脓、伤口及体液标本的检验中特别指出：“肺及脑化脓性检体在直接革兰氏涂片常看不到细菌，可用相位差显微镜观察湿涂片。”2.2 原始标本染色涂片制备 一般手工制片的通病是涂抹太厚，染色后内容重叠无法观察，影响检出率。理想的涂片应是细胞舒展不拥挤，细菌在细胞内外分明，容易看清细菌和细胞形态特点。制作方法除涂抹法外，还有滚动棉签的滚片法，组织标本印片法，痰液标本的压片法，诊断菌群失调的粪便推片法等。涂片法和印片法特点是菌膜菲薄，脓细胞的胞膜不易破裂，能呈现细菌在细胞内的自然状态。痰液粘稠，不便用接种器钩取，宜用两根牙签选取少许脓痰，置两玻片之间，加压使标本展开，再移动玻片向相反方向分开，即成两片菲薄的痰标本片。有网膜形成的脑脊液可用倾倒法标本片厚度以涂片对光观察呈毛玻璃状为合格。2.3革兰氏染色法及其功能 革兰氏染色法是由丹麦临床医师Han Christian Gram 于1884年首创，随着近年来深入工作，加深了对革兰氏染色片检查的认识，在原有的基础上又增加了新功能。即（1）鉴别细菌；（2）选择药敏纸片；（3）早期诊断；（4）判定合格标本；（5）确定主要病原菌；（6）病原菌半定量；（7）查腹泻菌群失调；（8）提示需补充检查项目；（9）解释培养结果；（10）有利于细菌鉴定。详情可见另文。3原始标本涂片检查对微生物检验全过程的导航作用原始标本涂片检查的多功能并非孤立存在，在检验起始阶段应用，它们与标本检验全过程密切相关，对检验路线起到“导向”和“导航”作用。举临床常见标本加以论证。3.1 尿液标本检验 检验特点是以尿液的湿片直接镜检结果为依据，进而安排培养计数，细菌鉴定和直接药敏试验，大多数在24h出最后结果。3.1.1 尿液位相显微镜直接镜检 将新鲜中段尿未离心的尿液管摇匀，在玻片上加尿液1滴（约10l ），放盖玻片滴油，用位相显微镜检查（60x1000x）。每份标本检查10个视野。每个600x1000x视野中有一个细菌，相当于每毫升尿液中104105个细菌（这种关系由镜检和培养计数对比而来）。尿路感染尿液大多含菌106108/ml，至少在105以上，故每个油镜视野中发现101000个细菌，常可能有尿路感染，这时即可与临床联系进行初报。卫生部2001年颁发新医院感染诊断标准中也提到“新鲜尿液标本经离心，应用相差显微镜检查1400），在30个视野中有半数视野见到细菌”者可协助诊断尿路感染。3.1.2 尿液的培养计数 根据显微镜所见决定培养步骤。若每个油镜视野均未见细菌，取10l尿液在1/4血平板上为防遗漏。若每个油镜视野中含菌09个（时有时无，有菌时不超过9个），取10l尿液分别接种血平板和中国蓝平板，用L玻棒涂开，孵育计数。若每个油镜视野含菌10个以上，取尿液1l涂平板计数，若镜检发现革兰氏阳性球菌，可取100l尿液接种血平板计数。当然常规分离培养仍要进行（有时可利用计数平板上获得的分离菌落），以便进行纯菌鉴定和纯菌药敏试验。3.1.3 尿液的直接药敏试验 若尿液每油镜视野中细菌达10个或以上，就可以直接药敏试验。取尿液10l均匀涂布在血平板上，贴上抗生素纸片（包括尿路感染中常用药物），孵育过夜后读取结果。3.1.4 尿液中细菌直接鉴定 若尿液每油镜视野中细菌达10个，可将标本直接接种鉴定培养基上做鉴定试验。尿液镜检发现杆菌，大多可疑为大肠艾希氏菌（60%70%）,将尿液点种在伊红美兰平板的1/12小区内，孵育后菌落出现典型金属光泽为大肠埃希氏菌。或接种在PGUA平板上孵育后有黄色反应者为大肠埃希氏菌。如尿液镜检发现球菌，大多可疑为粪肠球菌，可将尿液点种在亚碲酸钾平板的小区内，孵育后长出黑色（非灰色）菌落者为粪肠球菌。这是应用标本直接作菌种鉴定的例子，结果快速，颇有特色。3.2 痰液标本检验 痰液咳出时通过喉咙，杂菌污染严重。检验中若不能将真正的病原菌检出，必将对诊断和治疗进行误导，耽误病情。本法以痰液染色涂片显微镜检查为核心，达到以下目的：（1）判定送检标本是否合格；（2）直接观察和判定主要病原菌；（3）合理解释培养和药敏结果。这样就将痰液标本的快速检验建立在比较科学的基础上，增加了培养结果的可靠性。标本片制备用粘痰压片法制成，一片作革兰氏染色，另片备用。3.2.1 痰液涂片的显微镜检查是关键步骤3.2.1.1 标本质量鉴别 判定标本是来自下呼吸道痰液还是口腔唾液，区别标志如下：若发现形大扁平的鳞状上皮细胞以及种类繁多的各种细菌（包括螺旋体，酵母样真菌）为口腔唾液；发现柱状上皮细胞（有时附有纤毛），多量的白细胞，细长的粘丝和一种细菌（少数情况2种细菌），代表着痰液成份。3.2.1.2 镜检步骤 先用低倍物镜（10x）迅速观察全片，若每个视野中鳞状上皮细胞10个，标本不合格，要求重送检材。若观察到一些或很多不含鳞状上皮细胞的视野，尤其是白细胞大量聚集的地方，换用油镜（100x物镜）检查。有下列几种情况：A、虽未见鳞状上皮细胞，但见细菌种类繁多与含鳞状上皮细胞视野中相似，为不合格标本，要求重送。B、可见白细胞，柱状上皮细胞，粘丝单独或混合存在，细菌较单纯为12种，这些标本可做培养，并将镜检所见和培养结果核对。C、白细胞，柱状上皮细胞，粘丝单独或混合存在，但未发现细菌，疑为结核杆菌感染时，可取备用片作抗酸染色镜检，也应结合临床考虑病毒或其他微生物感染。3.2.2 选择主要病原菌 在合格标本的涂片中，关注炎症细胞之间的细菌，注意细菌的形态及其染色性，常为12种或优势菌很可能为主要致病菌。认清其形态特点和染色性，在以后的培养物中要重点注意这类细菌菌落的出现，这时就可以找出痰液直接涂片的初报（标本情况，有无炎症，主要细菌，革兰氏阴、阳性等），必要时可与临床医师联系了解病人情况。3.2.3 痰液培养 选用相应的平板培养基如血平板，巧克力平板，中国蓝等，四区划线作半定量分析，生长数3+至4+的优势菌为注视的重点。如涂片中发现革兰氏阴性染色浅的小杆菌疑为流感嗜血杆菌时，可在分离血平板上加种新鲜金葡菌固体培养物数点观察卫星现象，有利于该菌的分离和鉴定。3.2.4 痰液培养结果一定要和直接镜检核对（1）培养的优势菌和镜检优势菌应当相符；（2）若二者不符，要首先考虑直接镜检所见；（3）只报告优势菌（常为12种）及其药敏，正常菌群，非主要细菌，不必报告药敏，以免误导；（4）经常与临床医师联系讨论（1/21/4肺炎病人的病原菌能侵入血液，可考虑取血培养）。3.3血培养标本检验 观察血培养瓶可疑有菌生长者或自动化仪血培养管生长指数超标者，用无菌注射器抽取0.51 ml 培养液，置针筒中备用。3.3.1 湿片位相显微镜检查 观察有无细菌，形态（杆、球）、动力等特点。3.3.2 涂片革兰氏染色检查 位相显微镜发现有菌，接着观察染色片，注意细菌形态及染色性。确实后立即与临床联系，并初报细菌大致类别，讨论诊断及感染病灶事项。3.3.3 取培养液作直接药敏试验 依据细菌种类和特点选用合适的抗生素纸片供检。如早晨发现培养阳性，立即做药敏，下午45时一般可看出初步结果，即和临床联系，初报药敏结果，讨论治疗事项，次日再补报。3.3.4 取培养液接种血平板等培养基，以后分离细菌、菌种鉴定和纯菌药敏试验，按常规检验步骤进行。3.4 脓汁标本检验 脓汁标本的涂片作用已被公认。每份标本需作涂片2张，一张作革兰氏染色，一张作美兰染色，油镜观察细菌种类、染色性和脓细胞形态。多形核白细胞占80%90%以上者多为急性炎症，淋巴细胞较多者（30%）为慢性炎症。观察细菌注意单一或混杂细菌，有无可疑厌氧菌。如见着色浅而不均的革兰氏阴性杆菌常为厌氧菌，两端圆且着色深、时有空泡的多形性革兰氏阴性杆菌，可能是脆弱类杆菌，菌体长、两端尖的革兰氏阴性杆菌可能是具核梭杆菌，菌体粗短的革兰氏阳性杆菌，不见芽孢，结合涂片中多形核白细胞少或变形，可能为产气荚膜杆菌。这些可作临床诊断的参考，也可提示做常规需氧培养外是否需作厌氧培养。一种微生物的形态在原始标本涂片中常比它在培养物中更加典型。在以下一些细菌组别中这种差别比较明显便于区别：如链球菌、李斯特菌和类白喉杆菌；奈瑟氏菌、不动杆菌和莫拉菌；梭状芽孢杆菌、需氧芽孢杆菌和乳酸菌；奴卡菌、放线菌、丙酸杆菌和双歧杆菌；消化链球菌和消化球菌。笔者实验室取急性淋病患者尿道分泌物涂片染色，发现淋病奈瑟氏菌形态丰满，肾形双球典型，革兰氏阴性明显，在脓细胞内外一致，和不动杆菌的革兰氏阴性短杆菌极易区别。在专用培养基培养24h，取淋球菌菌落涂片染色，发现细菌形态瘦小，肾形不显著，染色微带紫。培养36h再取材观察，细菌因自溶酶作用变成大小不等的圆球，染色深浅不匀，和典型淋球菌形态相差甚远。油镜检查每个视野中都有细菌的脓汁标本，作直接药敏试验常易获得成功，受到临床的欢迎。3.5 脑脊液标本检验 脑脊液涂片检查对疾病的诊断及起始治疗起到非常关键作用。接到标本应立即检查，结果必须立即向医师报告，绝不能耽误。为了保证脑脊液中细菌不溶解易被检出，丹麦常规取脑脊液2管：一管内含经除菌过滤的2%福尔马林盐水0.51.0ml,加入等量脑脊液标本以固定细菌和细胞，专供涂片用。另一空管加入脑脊液和保温（35），专供培养用。脑脊液呈脓性混浊的，可不离心直接取材作3张涂片。浆液性脑脊液需离心沉淀，取沉渣作涂片。一作革兰氏染色，观察细菌形态和染色性，一作美兰染色，观察脓细胞种类也观察细菌，一张备用作抗酸染色检查结核杆菌。含菌量较少的体液标本（如脑脊液、胸液、腹腔液等）还可使用英国Shandon公司生产的细胞离心制片器（Cytospin Centrifuge ）,将0.30.5ml标本经离心直接附在玻片上，再作染色镜检很方便。有学者将该法与常规离心沉淀法对比，体液（主要是脑脊液）检查阳性率可增加20%，有临床重要性，国内也有同类产品（FMU-5）3.6 粪便涂片检验 粪便推片染色检查可协助诊断菌群失调。标本片观察正常菌群是否减少，酵母是否过度生长。若看到大片葡萄球菌聚集，说明有葡萄球菌结肠炎，培养时应增用血平板，看到大量产芽孢革兰氏阳性大杆菌可能为艰难芽孢梭菌（Clostridium difficile）。结合临床情况可协助诊断抗生素相关腹泻（AAD）和伪膜性结肠炎，分离时可增用CCFA选择性培养基作厌氧培养。腹泻粪便中常见脓细胞。粪便用位相显微镜直接检查有时可见动力很强的弯曲菌。为了快速诊断，具体落实WHO充分利用原始标本作显微镜检查的方针，丹麦医院临床微生物学科对血培养、痰、脓、脑脊液等标本的涂片均由检验医师（包括主任）亲自镜检和核对，打出报告，发现问题及时和临床联系。次日要观察这些标本的培养结果和直接药敏结果，并和直接涂片所见进行核对。因而提高了观察涂片和解释涂片的能力，又能结合临床较早地协助主管医师解决临床问题，临床值班医师和实习医师都要初步学会观察原始标本的直接涂片，成为相关科室临床医师的一项基本功。4 结束语20世纪后期，现代临床微生物学检验已从技术系列的医学检验员（medical laboratory scienc