第四章-海洋多糖..

第四章海洋多糖polysaccharide 韩645586 hanliang814 浙江工业大学精细化工研究所 海洋药物学 MarinePharmacology 糖概述 单糖 多糖 Saccharides orCarbohydrates 糖类 碳水化合物 衣 食 住 行息息相关 Starch 淀粉 polysaccharides Paper cellulose 纤维素 Sucrose 蔗糖 disaccharides 植物的光合作用 CO2 H2O Saccharide Carbohydrate Glucose CH2O 6 Cn H2O m 结构与保护作用 纤维素 几丁质 果胶能量来源 葡萄糖 淀粉 糖原 ATP复杂的生物学功能 重要的生命物质 影响蛋白质的折叠 溶解 半衰期 抗原性 生物活性 信息分子参与生命活动中的各种识别和信号转导 糖类药物 CarbohydrateDrugs 糖类的生物作用 血型物质与血型决定簇 A型 Y NHAc B型 Y OH AB性 Y NHAcorY OH O型 血型 红细胞膜脂或膜蛋白中的糖基 糖类药物 CarbohydrateDrugs 胰岛素及其他影响血糖药 抗癫痫药物 糖类药物 CarbohydrateDrugs 抗病毒药 单糖Monosaccharides 双糖Disaccharides 寡糖Oligosaccharides 醛糖 酮糖 丁糖 戊糖 己糖 丙糖 多糖Polysaccharides 糖类化合物 糖类化合物的分类 糖概述 单糖 多糖 单糖 葡萄糖 果糖 开链结构及构型 具有多个手性中心2n 分子有旋光 开链结构式的表示 Fischer投影式 上 下 氧化态 高 低 一对对映体 D Glucose L Glucose 甘油醛 糖构型表示法 D L 与甘油醛比较 D Glucose L Glucose D Glyceraldehyde L Glyceraldehyde D L 型糖互为一对对映体 自然界存在的糖大多数都是D 型 D L 只用在糖 氨基酸 羟基酸的构型表示 D 葡萄糖D Glucose D 甘露糖D Mannose D 葡萄糖D Glucose D 阿洛糖D Allose D 葡萄糖D Glucose D 半乳糖D Galactose 非对映异构体 差向异构体 在立体化学中 含有多个手性碳原子的立体异构体中 只有一个手性碳原子的构型不同 其余的构型都相同的非对映体 一些实验现象 缩醛acetal Glucose熔点146 配成水溶液 112 Glucose熔点148 150 配成水溶液 18 7 52 7 1 2 IR中无羰基吸收峰 1HNMR中无醛基氢吸收峰 3 变旋现象Mutarotation 环状结构及构型 如何解释变旋现象 Mutarotation 糖中的 CHO不是游离的 而是以半缩醛的形式存在 D Glu 112 m p 146 C D Glu 18 7 m p 150 C 开链D Glu 36 4 0 5 63 6 112 36 4 18 7 63 6 52 7 环状结构的表示方式 顺转90 碳链卷曲 C4 C5旋转120 Fischer投影式 Haworth投影式 D Glu D Glu Haworth式的书写规律 O在后面 C 1在右边时 最常用的写法 所有D 型糖的CH2OH均向上 L 型则均向下对 D 型糖 C1 OH向下 对 D 型糖 C1 OH向上 L 型糖则与D 型糖恰恰相反 Fischer式中在垂直碳链右边的羟基 在Haworth式中则向下 Fischer式中在垂直碳链左边的羟基 在Haworth式中则向上 D 吡喃葡萄糖 D 吡喃葡萄糖 D 呋喃葡萄糖 D 呋喃葡萄糖 六元环 五元环 吡喃糖椅式构象中 取代基占平伏键位置越多 构象越稳定 糖苷glycoside CH3CH2OH H 糖苷键 糖苷 也称配糖体 是单糖或寡糖的半缩醛羟基与另一分子中的羟基 氨基 或巯基等失水而生成的化合物 熊果苷尿道消毒皮肤增白剂 黑芥子苷祛痰 理气等药物的原料 苦杏仁苷毒性 甜菊苷 双糖 一个单糖分子中的半缩醛羟基与另一个单糖分子中的羟基失水所得的糖 麦芽糖 蔗糖 1 4 糖苷键 1 2 糖苷键 D 呋喃果糖基 D 吡喃葡萄糖苷 4 O D 吡喃葡萄糖基 D 吡喃葡萄糖 糖概述 单糖 多糖 多糖 概述理化性质提取与分离结构鉴定海洋中的多糖 多糖概述 多糖 polysacchrides 是来源于高等动植物细胞膜 微生物细胞壁中的天然大分子物质 是所有生命有机体的重要组成成分与维持生命所必需的结构材料 按结构不同分为 淀粉 纤维素 糖原 氨基糖 壳多糖等多种 纤维素 世界上最丰富的天然有机物 占植物界碳含量的50 以上 是植物细胞壁的主要成分 D 葡萄糖以 1 4糖苷键组成的大分子多糖 分子量约50000 2500000 相当于300 15000个葡萄糖基 造纸的重要原料 支链淀粉 淀粉 植物体中贮存的养分 存在于种子和块茎中淀粉是葡萄糖的高聚体 水解到二糖阶段为麦芽糖 完全水解后得到葡萄糖 淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类 直链淀粉含几百个葡萄糖单元 支链淀粉含几千个葡萄糖单元 多糖的生物活性 抗肿瘤活性 香菇多糖 黄芪多糖 芦荟多糖 紫草多糖 人参多糖 南瓜多糖增强免疫作用 香菇多糖 银耳多糖 黑木耳多糖 茶多糖降血糖 血脂 茶多糖 香菇多糖 黑木耳多糖抗辐射 氧化 螺旋藻水溶性多糖 银耳孢子多糖 枸杞多糖 螺旋藻多糖 褐藻多糖 海藻硫酸多糖 猴头菌丝多糖 红藻多糖 南沙参多糖 多糖 概述理化性质提取与分离结构鉴定海洋中的多糖 多糖的理化性质 1 无还原性和变旋现象 也无甜味 2 多糖通常为无定型粉末 一般具有很强的吸湿性 3 多糖一般不溶于有机溶剂 尤其是低极性的有机溶剂 4 多糖一般微溶于冷水 易溶于热水中或稀碱水溶液中 5 多糖有一定的酸性 尤其是有糖酸构成的多糖酸性较强 多糖 概述理化性质提取与分离结构鉴定海洋中的多糖 多糖的提取 热水提取法 破坏最小 甘薯去皮 切成小块 0 3 0 3 0 3cm3 每组15g 4组共60g 于搅拌器中 加蒸馏水240mL 捣碎1min 分成4份 3层纱布过滤 滤液置50 恒温水浴30min 倾去上层液体 25mL蒸馏水重新悬浮白色沉淀 室温下静置15min 两次 60 烘干4h 称重 用沸水提取2 6小时 提取液如粘度不大 则可采用过滤法过滤去残渣 对于粘度大的提取液则必须采用离心法去残渣 即得到多糖提取液或上清液 例如 大麦中活性多糖提取 大枣多糖提取 老头草中多糖的含量测定 乌龙茶多糖提取等 提取淀粉 稀碱水溶液提取法 酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解度不大 所以常用5 15 NaOH或Na2CO3水溶液提取 注意 用稀碱溶液提取时 温度必须保持在10 以下 否则多糖容易发生降解反应 通常在冷却的条件下 4 放置6 8小时 然后过滤或离心 滤液用稀盐酸调节pH至中性即得碱性多糖提取液 或用稀酸水溶液提取 稀酸 稀碱提取液应迅速中和或迅速透析 浓缩与醇析而获得多糖沉淀 酶解法 在比较温和的条件中分解植物组织 加速多糖的释放或提取粉碎的植物悬浮于水中 调节至最适温度 通常是38 50 最适pH范围 通常是pH3 8 4 5 加入5 25 复合酶 反应4小时 过滤去残渣 滤液即为多糖提取液其它方法 超声波提取主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂 而且整个破裂过程在瞬间完成 同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放 扩散及溶解 加速植物中的有效成分进入溶剂 使其进一步增大了有效成分的溶出 微波提取靠微波电子管发出的电磁波 感应生电 又转化成分子的动能而发热 具有快速 高效 安全的特点 其次微波的频率很高 能透入物体的深度较深 对细胞的结构有较大作用 多糖的纯化 多糖提取液 含有许多杂质 主要是无机盐 单糖 寡糖 低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质 如蛋白质 木质素 除杂质 分离 去除无机盐和小分子物质 除蛋白质 脱色 多糖的纯化 使用透析袋除去无机盐 单糖 寡糖和低分子量的非极性物质 蛋白质除去通常采用方法 1 酶法 蛋白酶将提取液中的蛋白质酶解 常用链霉蛋白酶 pronase 其方法是在pH7 8时 加入链霉蛋白酶 37 消化2 4天 然后反应物于沸水中加热5分钟以阻断反应 2 Sevage法 蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性将氯仿按多糖水溶液1 5体积加入 加入氯仿体积1 5的正丁醇 剧烈振摇20分钟 离心 分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白特点 条件温和 缺点是效率不高 一般要重复5次左右 3 三氟三氯乙烷法 等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中 在冷却的情况下搅拌10分钟 蛋白质成胶冻状 离心除去胶状蛋白质 上层水相再用上述溶剂处理2次 即得无蛋白质的多糖特点 此法效率较高 但因溶剂沸点较低 b p 56 易挥发 且必须在低温条件下进行 不宜大量应用 4 三氯醋酸法 在冰浴中搅拌的情况下缓缓于提取液中加入15 30 三氯醋酸 直至溶液不再继续混浊 在低温下 4 放置4小时 离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液特点 由于三氯醋酸的酸性较强 往往会引起某些多糖的降解 所以操作必须在低温下进行 该法效率较高 常用于植物多糖的去蛋白 多糖的脱色 活性炭脱色法 活性炭对多糖有较强的吸附作用 多糖损失很大 一般不用弱碱性离子交换树脂 去除多糖粗品中游离的色素 对酸性多糖的吸附力强 故不宜使用 多糖提取液 常有较深的色泽 一般为酚类化合物的聚合物 过氧化氢脱色法 氧化脱色 1 将0 3 0 8 粗多糖水溶液用浓氨水调PH至82 50 加入过氧化氢 比例为10 30 ml g 3 在50 下保持2小时4 醋酸调节至PH7 0 减压浓缩5 3倍量乙醇沉淀 即得脱色的多糖 该法在多糖粗品的脱色中常用 但必须严格控制脱色条件 如温度 时间 PH等 尽管如此 该法也会引起一定多糖的降解损失 多糖的分离 多糖 不均一性 需要进行分级分离先分析组分 根据组分的摩尔比 特点 样品量选择合适的分级方法 有机溶剂沉淀法盐析法金属络合法季胺盐沉淀法层析法 有机溶剂沉淀法 原理 根据不同的多糖在低级醇或酮 通常是乙醇或丙酮 中具有不同溶解度而进行分离 分子量大的多糖较分子量小的多糖在乙醇 或丙酮 中的溶解度小逐步加大乙醇 或丙酮 的浓度可将不同分子量的多糖分别沉淀出来 盐析法 原理 根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离各种多糖 在多糖中加入中性盐如NaCl KCl NH4 2SO4等至一定浓度 溶解度最小的多糖便沉淀析出 然后上清液继续加盐至更高浓度 则另一多糖又沉淀析出 金属络合法 原理 根据不同多糖能与各种铜 钡 钙和铅离子形成络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化 常用的络合剂有氯化铜 氢氧化钡和醋酸铅等 季胺盐沉淀法 原理 长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物 在低离子强度的水溶液中不溶解的特性 使其沉淀析出增加溶液的离子强度到一定范围 络合物则逐渐离解 最终溶解 常用的季胺盐是十六烷基三甲基胺溴化物及其碱 十六烷基吡啶 柱层析方法 纤维素柱层析 不同浓度乙醇水溶液 如80 60 40 20 洗脱洗脱规律 先洗脱的是分子量最小的多糖最终洗脱的是分子量最大的多糖阴离子交换柱层析利用多糖具有一定的酸性进行分离 使用最多的方法 效果好 操作简单 凝胶柱层析 根据多糖分子的大小和形状的不同即按分子筛的原理进行分离的常用的凝胶有葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 展开剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液 亲和色谱用凝集素一般是蛋白质和糖蛋白作亲和色谱来分离多糖 多糖 概述理化性质提取与分离结构鉴定海洋中的多糖 多糖结构鉴定 纯度测定分子量的确定糖种类以及比例的确定糖连接方式确定糖构型的确定 纯度测定 超离心法 超速离心机 带照相设备 多糖在离心场作用下形成单一区带高压电泳法 电泳后呈单一色斑或单一峰凝胶柱层析 分步收集中出现形状对称的单一峰旋光测定法 比旋光度相同高压液相色谱法 须经过两种以上的方法进行确定 原理 凝胶层析也称分子筛层析 排阻层析 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用 根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术 分子量的确定 凝胶柱层析 分离原理示意图 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外 只能在凝胶颗粒外的空间向下流动 因此流程较短 移动速度快 所以首先流出 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔 可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔 在向下移动过程中 因此流程较长 移动速率慢 所以最后流出 中等大小的分子 它们在凝胶颗粒内外部分渗透 渗透的程度取决于它们分子的大小 所以它们流出的时间介于二者之间 这样分子大的组分先流出 分子小的组分后流出 这样样品经过凝胶层析后 各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出 从而达到了分离的目的 基本概念 外水体积 内水体积 柱床体积 洗脱体积外水体积 Vo 是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内水体积 Vi 是指凝胶颗粒中孔穴的体积柱床体积 Vt 是指凝胶柱所能容纳的总体积 Vs为固定相体积 基本概念 洗脱体积 Ve 是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 它包括自加入样品时算起 到组分最大浓度出现时所流出的体积 Ve一般是介于Vo和Vt之间的 对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内 故其洗脱体积Ve Vo对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内 故其洗脱体积Ve Vt分子量介于二者之间的分子 它们的洗脱体积也介于二者之间 凝胶层析柱洗脱曲线示意图 完全排阻的大分子 中等分子 完全渗透的小分子 洗脱体积的测定 外水体积 Vo 可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定 一般常用蓝色葡聚糖 2000作为测定外水体积的物质 内水体积 Vi 可以通过测定完全渗透的小分子溶质 如重铬酸钾 的洗脱体积来测定柱床体积 Vt 1 可用下式计算 Vt D 2 2 h2 根据Vt Vo Vi可以得到3 加入一定量的水至层析柱预定标记处 然后测量水的体积 对于某一型号的凝胶 在一定的分子质量范围内 各个组分的Ve Vo与其分子质量的对数成线性关系 Ve Vo blgMr c 通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱 分别测定Ve 并根据上述的线性关系绘出标准曲线 然后在相同条件下测定未知样品的Ve 通过标准曲线即可求出其分子质量 糖种类以及比例的确定 1 完全酸水解操作 在1MH2SO4中封管100oC水解8小时 用碱中和 水解的难易程度与组成多糖的单糖性质 单糖环的形状和糖苷键的构型有关 一般呋喃糖苷键较吡喃型易水解 型较 型易水解 含有糖醛酸或氨基糖的大多不易水解 HPLC法 流动相为乙腈 水 85 15 流速1 0mL min 示差检测 气相色谱法 将水解样品进行NaBH4还原和乙酰化制成糖醇乙酸酯衍生物 或将水解样品进行硅醚化 而后再进行分析 薄层法纸层析法 展开剂大多为含水的溶剂系统 如正丁醇 醋酸 水 4 1 5 EtOAc 吡啶 水 2 1 2 等 硅胶薄层法 常用的展开剂为正丁醇 丙酮 水 正丁醇 醋酸 水或正丁醇 吡啶 水 2 糖的分析 包括种类和比例分析 糖连接方式的确定 Haworth法 试剂 硫酸二甲酯和氢氧化钠 或碳酸钠 碳酸钾 缺点 甲基化能力较弱 欲进行全甲基化反应 必须进行多次反应 甲基化 将多糖中的游离羟基全部甲基化 进而水解后得到的化合物 其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点 根据不同甲基化单糖的比例 可以推测这种连接键型在多糖重复结构中的比例 甲基化方法 Purdie法 试剂 碘甲烷和氧化银为试剂 一般可在丙酮或四氢呋喃中进行 缺点 氧化银有氧化作用 不能用于还原糖的甲基化 改良的方法 碘甲烷和四甲基脲Hakomori法 试剂 碘甲烷 甲基亚磺酰甲基钠 SMSM DMSO为溶剂缺点 需重复数次 反应进行程度的判断 红外检测无羟基吸收 表明甲基化完全 甲基化 水解 检测 高碘酸氧化 smith降解 IO4 KBH4 H 以1 4位键合 赤藓醇 2IO4 KBH4 H 以1 6位键合 糖苷键构型的确定 1 利用酶水解进行测定麦芽糖酶一般能水解的为 苷键 能被苦杏仁苷酶水解的大多为 苷键 2 利用波谱法测定红外光谱法 苷键890cm 1 苷键840cm 1 核磁法利用端基质子的偶合常数对于葡萄糖 苷键J 7Hz 苷键J 3Hz利用 苷键和 苷键的端基碳的化学位移差别利用2DNMR谱 胡萝卜苷 多糖 概述理化性质提取与分离结构鉴定海洋中的多糖 海洋动物多糖 海藻多糖 粘多糖 氨基多糖 海藻多糖 褐藻多糖 褐藻胶 为甘露糖醛酸和古罗糖醛酸构成的线性多糖 褐藻糖胶 主要组成成分为硫酸化的岩藻糖 海带淀粉 是一类葡聚糖 其生理功能类似于植物中的淀粉 红藻多糖 琼胶 卡拉胶 绿藻多糖 微藻多糖 琼胶和卡拉胶 两者均为细胞壁填充物 且均为半乳糖琼胶 琼胶由琼胶糖和琼脂果胶二部分组成 琼胶糖是不含有硫酸酯盐的非离子型多糖 是形成凝胶的组分 琼脂果胶是非凝胶组分 是带有硫酸酯盐 葡萄糖醛酸和丙酮酸醛的复杂多糖 也是在商业提取中力图去掉的部分 卡拉胶 在食品工业中主要用作胶凝 增稠 稳定和持水剂功能 在奶制品饮料中用作悬浮剂 在布丁 酸奶 掼奶油 冰淇淋 奶酪中用作增稠稳定剂 在红肠 洋火腿生产中用作持水剂 果冻中用作胶凝剂 琼胶糖 A 酸水解 A A E 酶水解 E 琼二糖 琼四糖 新琼二糖 新琼四糖 琼二糖 新琼二糖 蓝色标记 3 6 内醚 L 半乳糖绿色标记 D 半乳糖 壳多糖和壳聚糖 壳多糖 又名甲壳素 几丁质 广泛存在于虾 蟹和昆虫等节肢动物的外壳和菌 藻的细胞壁中 是自然界中最为丰富的生物高分子之