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修美乐报告 题目：修美乐报告学 院 化工学院 专 业 生物化工 学 号 姓 名 2016年 4 月 22 日目录1.研发背景12.分子基础以及构建22.1.全人源抗体制备途径22.2.分子基础以及作用机制22.3.构建过程52.3.1.重组人源抗体的筛选52.3.2.抗体的表达52.4.总结73.安全及有效性评价73.1.安全评价：73.2.有效性84.前景展望10参考文献修美乐报告1. 研发背景修美乐最初与雅培并没有关系，是由巴斯夫旗下生物研究公司诺尔药业和英国剑桥抗体技术公司CAT在1993年开始进行的合作研发项目。当时，CAT公司以噬菌体显示技术和融合蛋白库，筛选得到某一特定抗原表位的TNF抗体，经过人源化加工处理，得到第一个完全人源化抗TNF阿尔法单抗药物D2E7，经期临床试验证实，对类风湿关节炎患者有很好的疗效。尽管期临床效果不错，但是由于巴斯夫对于制药业并不热衷，继续研发这一新药以及未来建立营销渠道需要很大投入，巴斯夫决定回归化学主业，剥离诺尔药业。当时在制药业沉寂很久的雅培公司，以其对修美乐的积极性打动了诺尔药业，2000年，雅培以69亿美元收购诺尔药业及其所有上市和在研产品。当时，诺尔药业的在研产品不止修美乐一种，但是雅培的一些高管却十分看好这款TNF抑制剂，事实也证明了雅培当时独特的眼光。2003年1月首次在美国上市，并被美国食品药品管理局批准用于治疗中到重度类风湿关节炎。但是，获批上市只是第一步，为了进步获得市场竞争力，雅培艰难地开始了一系列后续的临床研究。此后雅培耗资 10 亿美元以扩展该药的新适应症，临床试验也证实修美乐确实对其他自身免疫疾病有效，因此美国和欧盟陆续批准其用于治疗银屑病关节炎、强直性脊柱炎、中到重度克罗恩病、中到重度斑块型银屑病和中到重度多关节型幼年特发性关节炎等适应证。在 2012 年 10 月上旬，美国 FDA 批准了该药的第七个适应症: 溃疡性结肠炎。这使得修美乐将在慢性病领域发挥作用，并影响美国的 62 万患者。修美乐在溃疡性结肠炎这一领域的使用，将为其增加额外的 5 亿甚至更多的销售额。修美乐可以预见适应症还将继续拓宽，比如，2015年艾伯维已经分别向FDA和欧洲药管局（EMA）提交了该药物用于化脓性汗腺炎的新药上市申请。从2012年开始，修美乐就以94.8亿的成绩稳坐全球药物销售排行榜榜首。2013年，雅培宣布进行拆分，修美乐被划归为专注于生物制药研发的新公司艾伯维旗下。2015年的销售额更是达到了140.9亿元。这些年，虽然新药层出不穷，但是真正能够占到年销售额100亿美元大关的新药则只有修美乐，修美乐能够荣登全球畅销药之首，主要原因是产品过硬、适应症广、受众群大，能解决临床上的迫切需求。修美乐由雅培公司于2010年8月在我国进口上市，2010年在中国获批用于治疗类风湿性关节炎，2013年又获批用于缓解活动性强直性脊柱炎患者的相关病征和症状。2. 分子基础以及构建2.1. 全人源抗体制备途径全人源抗体制备则是有四种途径：一 从采集的病人血样中构建 Fab或者ScFv文库，并通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAb。2002 年，第一个全人源MAb，Humira，就是通过噬菌体展示开发出来的。二 第二种生产人源抗体的策略是用含有人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以来生产人源MAb，从转基因小鼠衍生而来的人源MAb正在临床试验中。三 第三种途径是通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力，再克隆进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生成的。四 第四类途径是通过分离和低密度(约500B细胞每96孔)培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。2.2. 分子基础以及作用机制阿达木单抗是重组人源IgG1单克隆抗体，可以特异性的结合人类肿瘤坏死因子TNF。阿达木单抗含有人源轻链和重链可变区序列和人源IgG1，链恒定区序列，包括1330氨基酸残基，分子量大概有148kD。其半衰期与IgG1相同为两周。该抗体对hTNF-具有很高的亲和性（Kd=10 -8M or less）和比较低的解离速率（K off=10-3/s or less)能够中和hTNF-的活性包括hTNF-诱导的细胞毒性和细胞活化作用。（TNF与抗体的实时结合反应通过Biacore根据表面等离子共振原理测得）关于D2E7的结合特异性，其可与各种形式的hTNF结合，包括可溶性hTNF，跨膜hTNF和与细胞受体连接的hTNF。D2E7不会与其它细胞因子特异性结合。然而以前杂交瘤细胞产生的单克隆抗体对Human TNF-的亲和性太低，而且不能连接到可溶性的hTNF-上，不能中和hTNF-介导的细胞毒性。另外杂交瘤细胞技术的成功需要产特异抗体的淋巴细胞在人类外周血的存在。作用机制：TNF-是一种促炎症细胞因子，其在正常的免疫应答中发挥抗感染和损伤的保护作用。然而，长期升高的TNF-水平与多种自身免疫和炎症性疾病的发病机制相关。 RA患者的滑液中TNF的水平显著升高， 在关节破坏与病理性炎症中起重要作用。D2E7能与 -TNF 受体特异性结合， 阻止其与细胞表面的TNF受体 p55，p75 位点结合，能够使体内表面TNF 表达的细胞裂解，导致TNF 水平降低，但并不与-肿瘤坏死因子(-TNF)受体发生作用。D2E7 亦能调节由 TNF 诱导的生物反应， 使白细胞移动的黏附分子水平改变。 D2E7 能够迅速缓解炎症的急性反应， 降低C反应蛋白( CRP)、血清免疫介质白细胞介素-6( IL-6)水平以及红细胞沉积率( ESR)， 使组织改变而造成软骨破坏的血清金属蛋白水平亦显著下降。D2E7一级结构： 轻链可变区序列：重链可变区序列：2.3. 构建过程2.3.1. 重组人源抗体的筛选除了D2E7或与其相关的抗体外的其它抗体通过重组组合抗体库分离出去。本研究所用的抗体库是scFV噬菌体展示抗体库，其是从人类淋巴细胞中分离的编码重链和轻链可变区的mRNA经噬菌体展示技术得到的。为了分离与hTNF具有高亲和力和低解离率的人源抗体，选择对hTNF具有高亲和力的鼠源抗体（MAK195）用分子印迹（epitope imprinting）的方法选择对hTNF具有亲和力的人源序列。scFV噬菌体抗体库通过hTNF进行筛选。选好了VH和VL片段之后，“mix and match”实验用来筛选合适的VH和VL配对，另外为了进一步提高抗体对hTNF的亲和力，已选择的VH和VL匹对可以随机突变，一般对CDR3区进行突变。体外的亲和力突变可以利用互补于轻链和重链可变CDR3区的引物来扩增轻链和重链可变区来完成。获得编码合适抗体的DNA序列后，亚克隆于其它表达载体进行表达2.3.2. 抗体的表达一获取编码抗体轻链和重链可变区的DNA片段为了表达D2E7和D2E7相关的抗体，第一步是获取编码抗体轻链和重链可变区的DNA片段。可通过PCR对人源轻链和重链的修饰和扩增获得。例如为了获得D2E7或与其相近抗体的编码重链可变区的DNA片段，人VH基因的VH3基因家族中某一基因（DP-31)通过PCR进行扩增。为了获得轻链可变区基因片段，人VL基因的VI家族中的某一基因（A20）通过PCR进行扩增。二经突变后编码D2E7或者D2E7相近抗体的氨基酸序列。获得的人源VH和VL基因片段经突变后编码D2E7或者D2E7相近的氨基酸序列。人源序列的突变通过标准方法获取。例如:PCR介导的突变（即通过引物使突变的核苷酸插入）或者定点突变。三通过重组DNA技术进行下一步操作编码D2E7或者其相近的可变区序列获得后，这些DNA片段通过重组DNA技术进行下一步操作。例如把可变区序列转变为完整的抗体，Fab或者scFV片段。即把轻重链可变区序列分别与其对应的恒定区结合，重链恒定区可以是IgG1-4、IgA、IgD、IgM和IgE，最好是IgG1和IgG4的恒定区。轻链恒定区可以是和链恒定区，最好是链恒定区。四表达载体的构建注意事项：为了表达D2E7，编码部分或者全长的轻链或者重链DNA序列插入到表达载体上。抗体的轻链基因和重链基因可以插入到不同的载体，但最好插入到同一载体。D2E7或者其相关的轻链和重链基因在连接到载体之前，载体上可能已经携带抗体恒定区序列。例如把D2E7或者与其相近的抗体的重链和轻链可变区转化为完整抗体的一个方法就是把他们插入到已含有编码轻链和重链恒定区DNA序列的表达载体上。另外，重组表达载体可以编码一个信号肽，从而有利于抗体链从宿主细胞中分泌。信号肽可以是Ig信号肽或者异源信号肽。除了抗体链基因，重组表达载体携带了可调控抗体链基因在宿主细胞表达的调控序列。调控序列包括启动子，增强子和其它表达控制元件。对于哺乳动物的宿主细胞表达更倾向于使用病毒元件，从而有利于其在哺乳动物细胞中的高效表达。例如来自巨细胞病毒（CMV），猴病毒40（SV40)，腺病毒，多瘤病毒等的启动子和增强子除了抗体链基因和调控序列，该重组表达载体还可以携带其他序列，如调控载体复制的序列和选择标记基因。倾向于使用二氢叶酸还原酶基因和新霉素抗性基因五把携带有抗体轻链和重链基因的载体转染到宿主细胞中去1.尽管在理论上其在真核和原核细胞中都能表达，在真核细胞尤其是哺乳动物细胞中表达是最好的方式。因为这些真核细胞尤其是哺乳动物细胞比原核细胞能更好地组装和分泌具有免疫活性的抗体。而且已证明在原核细胞不能有效地大量生产抗体。2.表达重组抗体的细胞倾向于使用CHO细胞（包括dhfr-CHO细胞，含有DHFR选择性标记），NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。 3.重组表达载体转入宿主细胞后经过一段时间的表达，表达后的抗体分泌到培养基上。然后利用蛋白质纯化的方法收集抗体。 4.宿主细胞也可以用来产生不完整的抗体，如Fab或者scFV分子。研发过程试验了各种形式的抗体，重组DNA技术可以用来排除不能结合hTNF的抗体。2.4. 总结对于抗体或者其抗原结合部位的表达最倾向于使用载有编码抗体重链和轻链的基因的重组表达载体通过磷酸钙转染法转入到dfhr-CHO细胞中。重组表达载体中，轻链和重链基因连接到CMV增强子和AdMLP（腺病毒）启动子以增强其高水平表达。重组表达载体携带有DHFR标记基因，可用甲氨蝶呤进行选择。最后培养宿主细胞进行抗体的表达，并从培养基中收集到抗体。3. 安全及有效性评价3.1. 安全评价：常见不良反应有抗核抗体(ANA)转阳性(12%)、产生低滴度的 D2E7 抗体(5%)、注射部位反应(12%)、头痛(12%)、高血压(5%)等。严重不良反应有严重感染、恶性肿瘤和淋巴瘤及神经系统反应。 严重感染主要为上呼吸道感染、尿路感染和支气管炎等, 发生率为每年100人中0.04人。恶性肿瘤和淋巴瘤的标准化发生率(SIR)(实际观察发病人数/ 预期发病人数)分别为1.0和5.4。神经系统反应主要为脱髓鞘作用 , 出现皮肤感觉异常。3.2. 有效性271例患者参加的一项随机、双盲、安慰剂对照的试验，为期24周，患者被随机分为4组，分别接受D2E7 20，40，80mg及安慰剂皮下注射，每2周1次，同时服用MTX（甲氨蝶呤），剂量不变。第24周时采用ACR制定的20%，50%，70%改善标(ACR20，ACR50，ACR70)评价疗效。结果显示，在治疗第24周，D2E7加MTX组患者ACR20改善率分别为 47.8%、67.2%和65.8%，显著高于安慰剂加MTX组； D2E7治疗组ACR50改善率分别为31.9%，55.2%和42.5%，亦显著高于安慰剂组D2E7的40，80mg治疗组ACR70 改善率为26.9%和19.2%，也显著高于安慰剂对照组。4. 前景展望修美乐作为艾伯维的明星产品，在类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病等许多自身免疫性疾病中均取得出色的疗效，且销售额遥遥领先。目前，我国与国外的技术还有比较大的差距。全人源抗体的构建与动物细胞大规模培养技术是限制我国单抗药物的瓶颈，应加大力度攻克技术难关。我国的生物制药公司应尽快加紧对修美乐仿制药物的研发，不仅能给自己的公司带来一大笔利润，更能造福我国的类风湿关节炎等自身免疫性疾病患者。参考文献1. 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