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蛋白质组学研究技术及其进展摘要：蛋白质组学是以生物体系整体蛋白质为研究对象的新的研究领域。近年来，蛋白质组学研究取得了令人鼓舞的进展，一些新技术也得到迅猛的发展和改进，蛋白质组学研究主要依赖4大技术：蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、蛋白质相互作用分析及生物信息学。现就蛋白质组学相关技术的研究进展作一综述，最后重点介绍了生物信息学在蛋白质组学中的应用。关键词：蛋白质组学 研究技术 生物信息学 蛋白质组学研究的首要任务是建立获取和分析蛋白质的常规、可靠、有效的技术。为达到这一要求，就需要样品准备、数据获取标准化及自动化，也就是要有可重复的高通量的技术。蛋白质组研究的技术手段在不断完善，其工作流程是多步骤进行，包括蛋白质样本的制备、分离、定量及鉴定。由双向凝胶电泳、质谱技术、酵母双杂交系统、蛋白质微阵列技术、能进行大规模数据处理的计算机系统和软件、软电离技术及生物信息学技术构成了蛋白质组学研究的主要技术体系。1 蛋白质分离技术1.1 双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)双向凝胶电泳是由SMITHIEA和POULIK在1956年发明的，并于1975年由0FARRELL做了改进，并建立起了双向凝胶电泳技术体系1。2-DE原理是：第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度进行分离，至各自的等电点；再根据分子量的不同，在第一向基础上，通过聚丙烯酰胺垂直的方向电泳进行分离。1982年Bjellqvist等2开始采用固相pH梯度胶（immobilized pH gradients，IPG）。与传统两性电解质载体在电流作用下形成pH梯度不同，IPG由丙烯酰胺衍生物与聚丙烯酰胺共价聚合而成固相pH凝胶梯度，消除了传统IEF阴极漂移问题，具有快速、重复性好等优点3。2-DE可使我们较快地获取样本整个蛋白质组大量蛋白质变化、分布的宏观信息，同时也可以借助后续的方法进行微观分析。此外，它还具有高通量的优势。2-DE也有其自身局限性，主要在于（1)在二维凝胶电泳图谱上，并不是每个蛋白点所包含的蛋白量都足以用于鉴定蛋白；(2)存在歧视性问题，如对于低丰度蛋白、疏水性蛋白、极碱性蛋白(pI9)、一些极大蛋白(相对分子质量200，000)和极小蛋白(相对分子质量8，000)，二维凝胶电泳还不能够将其很好地显示出来，仅仅只有一些可溶的蛋白能被分析；(3)费时、费力，难以实现与质谱(Ms)的直接联用等，蛋白组学研究在一些方面受到了限制4。近年来又发展了荧光差异双向凝胶电泳(two dimensional luorescence difference in gel electrophoresis，2DDIGE)，采用不同的荧光染色，分别对两个样本蛋白质进行标记，将标记的样本混合后进行2-DE，由于2种荧光染料的发光波长不同，从而在同一块胶上的2个样品的蛋白质进行分离，并能准确测出含量差异。与利用传统的双向电泳及染色方法进行表达蛋白质组的比较相比，显著地减少了样品和染色时操作的差异，提高了重复性，特别是内标的引入，进一步提高了这一技术的定量的准确性和统计的可靠性5。2D-DIGE结合质谱分析是发现肿瘤细胞特异性分子和鉴别肿瘤标记物的重要工具6。1.2 色谱技术近年来，色谱技术的发展为蛋白质和多肽或亚基的分离分析提供了新的手段。色谱技术是利用各种物质在固定相和流动相之间不同的分配系数，使其在相对运动着的两相间经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。按两相状态来分类，有气相色谱法（gas chromatography，GC）和液相色谱法（liquid chromatography，LC）两种，而其中的LC是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。单一的液相分离技术常不能满足复杂蛋白质复合物分离的需要，多维液相分离系统则在技术上弥补了单一的液相分离技术的不足。多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特性的液相分离方法的优化和组合，它有效地提高了系统对样本的分辨率和峰容量。此外，多维液相分离系统还具有快速、高通量、自动化、重复性好等优点7。常见的多维液相分离系统有二维液相色谱、二维毛细管电泳、液相色谱-毛细管电泳等。色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。它与质谱结合，并与电离喷雾质谱或电离喷雾串联质谱联用，借助计算机的联机检索，实现了高通量筛选和鉴定蛋白质混合体系的要求。色谱分析法与2-DE比较具有操作过程简单、分析速度快、分离效能好和灵敏度高等优点，尤其将分离物直接与质谱连接，实现了分离和鉴定一次完成。目前，蛋白质组研究中高效液相色谱与质谱联用的方式有一维色谱-质谱联用技术、多维色谱-质谱联用技术以及亲和色谱-质谱联用技术等。 一维色谱-质谱技术仅能分析一些不太复杂的蛋白质体系，而对复杂的多肽混合物常不能满足分离的要求。多维色谱分离的方法在某种程度上满足了对复杂蛋白质混合分离鉴定的要求。1.3 毛细管电泳(capiIlary electrophoresis，CE)技术毛细管电泳技术是在高电场强度作用下，对毛细管内径(510m)中的样品按分子质量电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离，包括毛细管区电泳(CZE，依据不同蛋白质的电荷质量比差异进行分离)、毛细管等电聚焦(CIEF，依据蛋白质等电点不同在毛细管内形成pH梯度实现分离)和筛板-SDS毛细管电泳(依据SDS-蛋白质复合物在网状骨架中迁移速率的不同而实现分离)等技术，其优点是可实现在线自动分析，可用于相对分子质量范围不适于2-DE的样品，其缺点是存在对复杂样品分离不完全的现象8。2 蛋白质鉴定技术2.1 传统蛋白质鉴定技术(1)Edman降解法测N端序列。由于Edman降解法测序可得到准确的肽序列，是蛋白质鉴定可靠的重要依据，成为目前蛋白质鉴定的主要方法。近年来，研究人员对Edman降解法做了许多改进，如：CORDWELL应用细径(内径0.8 mm，流速40uLmin)的高压液相分析(HPLC)柱，在100fmol的初产率下测得510个氨基酸残基的序列9,使其在测序速度和灵敏度上得到了很大的提高，拓展了其应用范围。随着Edman降解法在微量测序和速度等技术上的突破，它在蛋白质组研究中可发挥重要的作用。类似Edman的C端化学降解法已研究了多年并有自动化分析仪器问世，但它的反应效率较低，通常需纳摩尔(nmo1)样品。(2)氨基酸组成分析。氨基酸组成分析由于耗资低而常用于蛋白质鉴定。氨基酸组成分析有别于肽质量或序列标签，是利用不同蛋白质具有特定的氨基酸组分的特征来鉴定蛋白质。该法可可用于鉴定2-DE分离的蛋白质，应用放射标记的氨基酸来测定蛋白质的氨基酸组分，在155酸性水解，让氨基酸自动衍生后，经色谱分离，获得的数据用AACompldent、ASA、AACP1、PROP-SEARCH等软件进行数据库查询，依据代表两组分间数目差异的分数对数据库中的蛋白质进行排榜，“冠军”蛋白质的可信度较大。2.2 质谱技术与传统的蛋白质鉴定方法相比质谱分析技术灵敏、准确、高通量、自动化等特点成为当前蛋白质组学技术的支柱10。质谱鉴定蛋白质的基本原理是先使样品分子离子化，然后根据不同离子之间的质荷比(mz)的差异来分离并确定蛋白质的相对分子质量。根据蛋白质酶解后所得到的肽质量指纹图谱(PMF)、肽序列标签(PST)、和肽阶梯序列(PLS)去检索蛋白质或核酸序列数据库，质谱技术可达到对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选11。目前常见的质谱仪种类主要有磁偏转式质谱、四级杆式质谱(Q-MS)、离子阱质谱(IT-MS)、飞行时间质谱(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)五种。生物质谱的原理是将样品离子化后，通过离子质荷比来获取信息。生物质谱仪通常包含3个部分：离子源、质量分析器和检测器。电喷雾离子化（ESI)和基质辅助激光解吸离子化（MALDI)为生物质谱中常用的两种离子化方式。目前在蛋白质组研究中有4种基本的质量分析器：飞行时间(TOF)、四极杆(Q)、离子肼(IT)和傅里叶变换离子回旋共振(FFICR)，不同的分析器可单用也可串联使用。不用的离子源和分析器连接成不同组合。最常用的为MALDI-TOF，MALDI-OFTOF，ESI-Q-TOF等等。目前蛋白质鉴定体系除上述基于二维凝胶电泳(2-DE)和生物质谱结合的鉴定手段，另一种鉴定方法是多维液相色谱分离与串联质谱的联用(LC-MS) 12。2.3 蛋白质芯片（protein chips）技术蛋白质芯片技术是近年来建立的一种蛋白质分离技术，它是利用化学或生物学的方法在硅、云母、各种膜片等载体表面制作成点状芯池，每个芯池用探针修饰。这种探针包括结合蛋白质的抗体或受体、结合某些阳离子或阴离子的化学基团、吸水或疏水物质、酶、免疫复合物等。使用时，先将需要检测的样本按一定的程序做好前处理，然后在每个芯池内点入检测的样品，利用特定的探针和特定蛋白质结合的特性，将样品中的特定蛋白质分离出来，然后对芯片上的蛋白质直接进行质谱检测，从中得到样品中各种蛋白质的相对分子质量、含量、等电点、糖基化和磷酸化位点等信息13。这种蛋白质芯片与质谱联合应用的技术称为表面增强激光解吸电离质谱芯片技术(SELDI)。蛋白质芯片技术具有分析速度快、简便易行、样品用量少和高通量等特点，可直接用于临床标本的检测。然而，芯片蛋白质组学的蛋白质来源于已知蛋白质，如抗体或重组蛋白质，但它不能识别已知蛋白质的多种异构体。根据日本科学家田中(tanaka)教授发明的“对生物大分子的质谱分析法”为应用原理、由美国Ciphergen公司研发生产的蛋白质芯片-飞行质谱仪，已经在国内外的多个蛋白质组学研究机构得到广泛应用14。它具有快速、操作简便、样品用量少和对多样品的平行检测等特点，可直接检测不经处理的各种体液和分Head物等，从而可检测到样品中特异性蛋白质的分子质量。因此，在蛋白质组学的研究中较目前常规方法具有显著的优势。2.4 同位素标记亲和标签法(isotope coded affinity tags,ICTA)15将两种不同样品分别标记轻同位素和重同位素后混合、酶切、亲和层析，再进行在线高效液相色谱一串联质谱分析即可定量检测蛋白质的表达情况，能较准确的鉴定不同状态下细胞或组织中差异表达的蛋白质。其优点在于能对混合样品直接测试，可快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质(尤其是膜蛋白等疏水性蛋白质)，还可快速找出重要功能蛋白质(疾病相关蛋白质及生物标志分子)，具有巨大的应用价值。此外，在蛋白酶解过程中，尚可采用18O标记技术对蛋白样品的片段进行标记，而对照品不用同位素标记。当使用胰酶、Glu-C或Lys-C等蛋白酶时，可分别引入两个18O到正在被酶解的多肽中，再联用毛细管液相色谱电喷雾离子阱质谱技术，即可在混合样品中鉴定差异蛋白质。与ICAT法相比较，18O标记技术具有更好的重复性，并且同位素影响小。近来出现的以磁性介质为基础的亲和色谱技术，由于能够快速、高效、平行、高通量地分析蛋白质组，因此具有较大的发展潜力。3 蛋白质的相互作用技术3.1 酵母双杂交系统(yeast two hybrid system)酵母双杂交法是目前研究蛋白质组中蛋白质相互作用的重要手段，它用已知蛋白作为诱饵来筛选与之特异结合的靶蛋白，只有诱饵蛋白结合了报告基因的启动子才能启动报告基因在酵母中的表达，通过检测表达产物来判别蛋白是否互作16。该方法仍在不断的完善中，如今它不但可用来在体内检验蛋白质间、蛋白质与小分子肽、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA问的相互作用，而且还能用来发现新的功能蛋白质和研究蛋白质的功能，在对蛋白质组中特定的代谢途径中的蛋白质相互作用关系网络的认识上发挥了重要的作用。3.2 表面等离子体共振技术(surface plasmonresonance，SPR)SPR生物传感器是利用表面等离子体共振现象和SPR谱峰对金属表面上电解质变化敏感的特点，通过将受体蛋白固定在金属膜上，检测受体蛋白与液相中配体蛋白的特异性结合。SPR技术的特点是检测快速、安全、不需标记物或染料，灵敏度高。其除了应用于检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用外，还可检测蛋白质与核酸及其他生物大分子之间的相互作用，并且能对整个反应过程进行实时监测。3.3 串联亲和纯化技术(tandem affinity purification，TAP)双杂交技术已经广泛用于研究蛋白一蛋白间相互作用，但由于其筛选步骤复杂，假阳性结果较多，难于量化，且不易研究高级复合物间的相互关系，故远远不能满足大规模蛋白质组研究的需要，因此，与质谱联用的蛋白纯化技术已成为当前蛋白质组学研究的重要工具。Rigaut等人于1999年首先提出了串联亲和纯化TAP技术，它是利用一种经过特殊设计的蛋白标签，经过两步连续的亲和纯化获得更接近自然状态的特定蛋白复合物的技术，在一定程度上打破了制约蛋白质组研究的瓶颈。TAP技术在低浓度情况下，也能高效富集目的蛋白，并且纯化多在天然条件下进行，故可较好的保持靶蛋白复合物的空间结构，得到的产物可用于活性检测及结构分析。即可用于分析在稳定复合物中的蛋白间相互作用，也可分析反应中蛋白间的瞬时相互作用，鉴定与靶蛋白发生直接或间接相互作用的配体(核酸、脂类及多肽)，这都是传统双杂交技术所不可比拟的。目前这一技术已在酵母蛋白质组研究中广泛应用。与质谱连用的TAP技术是我们研究蛋白质组学的有力工具，必将在解析生物蛋白复合体的功能方面发挥重要作用。3.4 噬菌体展示(phage display)技术：主要是在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的基因序列技术。噬菌体生长时表面表达出的相应单抗在过柱时，如柱上含有目的蛋白质，则可特异性结合相应抗体。这种噬菌体表面表达筛选技术具有高通量及简便的特点，研究蛋白质的相互作用时无需了解其结构，只依赖于被研究的蛋白质的特定种类(如细胞质蛋白或细胞表面蛋白)，与酵母双杂交技术互为补充，弥补了酵母双杂交技术的一些限制，如有些蛋白质本身具有激活转录活性，不经过双杂交相互作用即可激活已知基因的表达，而酵母双杂交技术则检测不出来。目前，可利用噬菌体展示技术构建蛋白质库，研究、改造和提高蛋白质的生物学和免疫学属性，研究新型药物、疫苗和抗体等17。4 生物信息学生物信息学是蛋白质组学研究的重要组成部分。大量蛋白质组学研究所获得的数据都需要借助生物信息学知识和方法快速有效地解释其背后隐含的生命信息。生物信息学在蛋白质组研究中的应用主要是对其产生的实验数据进行获取、加工、存储、检索、分析等，以揭示数据中蕴含的生物学意义18。先进的信息技术在后基因组学研究中的应用主要包括以下一些方面：(1）高效率的分析技术平台：计算机和网络已成为生物学研究的必备工具之一。(2）高通量技术：主要致力于如何运用信息技术去分析所得到的巨量数据。(3）数据挖掘技术：它是计算机科学发展极为迅速的一个研究领域，其可从存放在数据库或其他信息库中的大量数据中挖掘知识，应用于分析中。(4）数据可视化技术：可视化技术有助于反映生物序列的三维结构模型，表现出生物体错综复杂的相互关系。(5）复杂系统理论：描述系统关系时，必须把核酸、蛋白质、细胞、器官、组织等的作用考虑在内，即用系统的方法来认识生命活动19。蛋白质组数据库是蛋白质组学的主要内容之一，目前主要集中在不同细胞或组织表达的全部蛋白质数据库的构建与细胞在不同状态下的蛋白质表达差异的研究上。蛋白质数据库具有以下一些特点20： (1)数据库种类的多样性。(2)数据库的更新和增长快，数据库的更新周期越来越短，有些数据库每天更新。数据的规模也以指数形式增长。(3)数据库的复杂性增加、层次加深。许多数据库具有相关的内容和信息，数据库之间相互引用，如PDB就与文献库、酶学数据库、蛋白质二级数据库、蛋白质结构分类数据库，蛋白折叠库等十几种数据库直接交联。(4)数据库使用的高度计算机和网络化是蛋白质组信息学的又一重要特点。越来越多的蛋白质组信息学数据库与因特网联结，从而为分子生物学家利用这些信息资源提供了前所未有的机遇。特别是绝大多数网上蛋白质组信息学数据库信息资源可免费检索或下载使用，这对我国开展蛋白质组信息学研究以及人类和水稻基因组工程的DNA序列数据的分析提供了捷径，特别是当前我国生物信息学自建数据库不丰富和引进数据库又比较少的情况下，探讨和研究如何充分开发和利用网络上免费的生物信息学数据库信息资源显得尤为重要。蛋白质生物信息数据库种类繁多21。归纳起来，大体可以分为4个大类，即基因组数据库、核酸和蛋白质一级结构序列数据库、生物大分子(主要是蛋白质)三维空间结构数据库，以上述3类数据库和文献资料为基础构建二次数据库。基因组数据库来自基因组作图，序列数据库来自序列测定，结构数据库来自X衍射和核磁共振结构测定。这些数据库是分子生物信息学的基本数据资源，通常称为基本数据库、初始数据库，也称一级数据库。根据生命科学不同研究领域的实际需要，对基因组图谱、核酸和蛋白质序列、蛋白质结构以及文献等数据进行分析、整理、归纳、注释，构建具有特殊生物学意义和专门用途的二级数据库，是数据库开发的有效途径。近年来，世界各国的生物学家和计算机科学家合作，已经开发了几百个二级数据库和复合数据库，也称专门数据库、专业数据库、专用数据库。5 展望随着研究技术的日益成熟，蛋白质组学在揭示诸如生长、发育和代谢调控等生命活动规律方面已有所突破，在生命科学领域、疾病基因组研究和新药开发、药物毒理学等方面的研究应用也越来越广泛。相信随着全世界生命科学研究的持续快速发展，蛋白质组学及其研究技术必将成为21世纪的核心学科之一，并将切实而广泛地对人类生活带来巨大影响，为人类进步和发展作出更大的贡献。6 参考论文1皇甫海燕，官春云，郭宝顺，等.蛋白质组学及植物蛋白质组学研究进展J.作物研究，2006，20(5)：5775812Bjellqvist B, Ek K, Righetti P G, Gianazza E, Gorg A, Wester-meier R, Postel W. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients:principle,methodology and some applicationsJ.J Biochem Biophys Methods,1982,6(4)：317-339.3Fey S J,Larsen P M.2D or not 2D.Two-dimensional gel lectrophoresisJ.Curr Opin Chem Biol,2001,5:26-30. 4张婕.蛋白质组学多维色谱质谱分析平台新技术新方法研究D.上海：复旦大学，2005.5金宏伟，黄回滨.蛋白质组学研究相关技术新进展J.国外医学临床生物化学与检验学分册，2005，26（12）：909-912.6张丽华.蛋白质组学研究的分离技术及其进展J.医学研究生学报，2004，17（10）：916-918.7常俊丽，杨广笑，何光源.蛋白质组学分离检测技术研究进展J.武汉植物学研究，2006，24（3）：261-266.8GARCIA-CAMPANA A M，GAMIZGRACIA L，BAEYENS W R，et a1.Derivatization of biomolecules for chemiluminescent detection in capillary electrophoresisJJoumal of Chromatography B，2003，793(1)：49749李强,胡志东.蛋白质组学技术研究J.医学综述,2007,13(11):81681810KOOMEN J，HAWKE D，KOBAYASHI RDeveloping an understanding of proteomics：An introduction to biological mass spectrometryJCancer Investigation，2005，23(1)：4759.11SHI R，KUMAR C，ZOUGMAN A，et a1An