牙菌斑生物膜

第十章牙菌斑生物膜 天津医科大学靳趁心 牙菌斑是口腔微生物的生长环境 是口腔常见病 龋病和牙周病的始动因子 牙菌斑内微生物之间以共生 竞争和拮抗等方式相互作用 与所处的环境构成不同的微生态 第一节牙菌斑的概念与分类 概念 牙菌斑是一种细菌性生物膜 是被基质包裹的互相黏附并附着于牙齿或修复体表面的未矿化的细菌性群体 不能被水或唾液冲刷去除 分类 牙菌斑 光滑面牙菌斑 G 球菌和杆菌为优势菌龈上牙菌斑点隙沟裂牙菌斑 G 球菌为优势菌群邻面牙菌斑 G 杆菌为优势菌群龈下牙菌斑附着性龈下牙菌斑 G 球菌 杆菌 丝状菌 G 短杆菌和螺旋体非附着性龈下牙菌斑 G 无芽胞厌氧杆菌 第二节牙菌斑的结构与组成 镜下观察 牙菌斑为由大小不等的被覆基质或获得性膜的细菌团块组成 成熟牙菌斑由内至外一般分为三层 一 牙菌斑结构 1 基底层为牙菌斑紧靠牙面的一层 为无细胞的均质结构 HE染色为红色 厚度为0 1 1 0 实际上是获得性膜 可见少量细菌黏附于其表面或直接黏附于釉质表面 2 中间层为牙菌斑主体部分 主要由排列成栅栏状结构的细菌组成 黏附于基底层的长杆菌及丝状菌垂直于牙面排列 大量的球菌 杆菌分布或黏附于其中形成 栅栏状结构是牙菌斑的基本结构 3 表层为牙菌斑最外层 结构松散 可见谷穗样结构或试管刷样结构 微生物组成差异很大 主要含有球菌 短杆菌 脱落上皮细胞及食物残渣 二 牙菌斑的组成 牙菌斑基质的作用 构成了牙菌斑内部与外界进行物质交换的通道 是牙菌斑细菌生存的载体和营养物质储库 限制牙菌斑表层的氧气 抗菌药物及其它不利细菌生长的物质过多进入牙菌斑内层 从而起到保护作用 牙菌斑细菌组成特点 不同个体之间存在差异 同一个体口腔内不同部位之间存在差异 牙菌斑形成的不同阶段细菌的组成存在很大差异 致病性牙菌斑与非致病性牙菌斑的细菌组成差异却不大 仅是各种细菌所占的比例不同 影响牙菌斑生态平衡的因素 1 温度影响pH变化 离子活性及微生物的凝集 口腔温度一般维持在35 36 左右 摄入食物时的温差在60 左右 长期定植于口腔的细菌一般能够适应这一范围温度变化 2 pH值影响细菌酶的活性 口腔内平均pH值为6 7 7 2 主要由唾液中的碳酸盐及磷酸盐缓冲系统来维持 牙菌斑内pH值变化幅度较大 微生物生长适宜的pH值各不相同 当pH值为6 0 8 0时 几乎所有的牙菌斑细菌都能生长 当pH值为5 0时 放线菌和一些链球菌还可以生长 当pH值达4 6以下时 只有乳杆菌和酵母菌能够生存 当pH值高达9 5时 只有少量的韦荣菌 梭杆菌 酵母菌和链球菌可以生存 3 氧化还原电势 oxidation reductionpotentials Eh 高Eh支持需氧菌或微需氧菌的生长 而低Eh有利于厌氧菌的生长 口腔中不同部位的Eh差别很大 光滑面的Eh高 而龈沟 牙周袋内Eh很低 健康龈沟的Eh约为 75mV 而牙周袋则为 50mV 深牙周袋甚至可达 300mV 4 营养唾液与龈沟液中含有丰富的蛋白质 糖蛋白 微量元素等营养物质 是维持微生物生存的最基本营养物质 宿主摄入食物的种类 频率和方式影响微生物的组成 5 唾液中的抑菌成分分泌型IgA sIgA 能与细菌合成的葡聚糖转移酶结合 限制细菌酶的活性 sIgA还能与细菌表面蛋白 脂磷壁酸等抗原结合 使微生物凝集成簇 降低其对牙面的黏附能力 溶菌酶 作用于G 细菌细胞壁的主要结构肽聚糖而使细菌胞壁崩解 乳铁蛋白 能够与Fe3 紧密结合 从而降低了细菌对生存必需的Fe3 的利用 实现抑菌作用 过氧化物酶 主要是催化唾液中过氧化氢及硫氰酸盐氧化反应 产生毒性物质 使细菌糖代谢所需的酶失活而终止糖代谢 干扰有机酸的产生 6 微生物间的相互作用共生 一些细菌的代谢产物是另一些细菌的营养物质 必须的生长因子 一些细菌的存在是另一些细菌生存的必要条件 协同完成物质代谢过程 拮抗 细菌通过竞争营养物质和定植空间而影响生态平衡 细菌自身能够合成并释放不利于其他微生物生存的代谢产物 引发机体产生天然抗体而抑制其他细菌的定植与生长 血链球菌产生的对氨基苯甲酸是变异链球菌生长的必要生长因子 需氧菌和兼性厌氧菌在生长过程中消耗生境中的氧 使局部Eh下降 为专性厌氧菌的生长提供了条件 牙菌斑中的细菌代谢唾液中的糖蛋白时 首先由口腔链球菌 普雷沃菌等含有糖苷酶的细菌分解糖蛋白侧链 然后蛋白质被具核梭杆菌 中间普雷沃菌等含有链蛋白水解酶的细菌降解 如变异链球菌产生的细菌素为变链菌素 它能杀伤链球菌属中的其它细菌及粘性放线菌 也能杀伤与其共生的血链球菌 7 氟化物的作用氟可以抑制致龋菌的附着 有利于唾液的冲洗和外力的机械清洁除菌 使牙菌斑形成的时间延长 数量减少 牙菌斑中的氟还能够以氢氟酸的形式扩散到细菌细胞内 通过抑制糖代谢酶的活性而干扰糖代谢 降低细菌的产酸能力 第三节牙菌斑形成与发育 牙菌斑生物膜的形成是一个有序的 连续的过程 不能截然分开 为描述方便 一般将其分为三个阶段 1 获得性膜的形成2 细菌黏附集聚3 牙菌斑的成熟 一 获得性膜的形成 获得性膜 acquiredpellicle 是一层非发育性的无细胞结构的薄膜 主要由唾液 龈沟液中的粘蛋白或糖蛋白选择性的沉积 吸附于牙齿 修复材料表面形成 不同部位获得性膜的成分有所不同 釉质表面的获得性膜的以唾液成分为主 而牙根表面的获得性膜以龈沟液成分为主 获得性膜的形态与结构受所支持的固体表面性质影响 其厚度差异很大 一般在30 60 m之间 获得性膜具有双重作用 1 获得性膜有助于细菌附着与生长 能够保护牙齿 获得性膜提供细菌黏附牙面的特殊受体 使细菌选择性吸附定植于牙面 获得性膜中的受体与宿主的免疫球蛋白 抗体 补体 溶菌酶等 结合 抑制宿主的免疫反应 利于微生物的生长与繁殖 获得性膜为细菌的生长繁殖提供充足的营养 2 获得性膜还具有保护及修复牙齿矿化表面的功能 获得性膜被覆于牙齿表面 缓冲了酸性食物对牙面的脱矿作用 获得性膜可结合钙 磷 氟等矿物质 利于牙面的矿化和再矿化 获得性膜上正常菌群的定植抑制了外源性致病微生物的入侵 二 细菌对牙面的黏附和集聚 一 细菌对牙面的黏附包括非特异性黏附和特异性黏附两个过程非特异性黏附 附着初期 细菌与牙面以氢键 钙桥等方式黏附 该过程可逆 特异性黏附 细菌细胞壁表面的黏附素 adhesin 与获得性膜表面的相应受体特异性地结合 二 细菌在牙面的集聚 aggregation 1 通过自身合成的细胞外聚合物而相互黏附2 通过黏附素与受体特异性结合使细菌集聚在一起 三 牙菌斑的成熟 在牙菌斑的成熟过程中 细菌的定植有一定顺序 早期定植菌主要是革兰阳性球菌 其中链球菌为优势菌 而后是放线菌等细菌 大约在牙菌斑形成的第5 6天 牙菌斑内的细菌重新排列 形成栅栏状结构 标志牙菌斑成熟 此时牙菌斑内细菌的组成比例和数量趋于稳定和平衡 牙菌斑中的微生物群落并不是无限扩增的 当其中细菌种类和数量达到一定限度后 牙菌斑内的细菌可分泌蛋白释放酶使部分细菌脱落 多余的细菌向周围扩散与定植 第四节牙菌斑的物质代谢 一 糖的代谢 1 糖的分解牙菌斑中细菌具有纤维素酶 淀粉酶 糖苷酶等多糖降解酶 可将多糖降解为单糖或双糖后 通过透性酶转运系统和磷酸转移酶系统主动转运到细胞内 进入到细胞内的单糖或双糖首先通过各种代谢途径转变为丙酮酸 然后经有氧代谢或无氧酵解产生各种代谢产物并释放能量 细胞内糖无氧酵解产生乳酸 甲酸 乙酸等有机酸 并以质子的形式转移到细胞外 使环境中的pH值下降 2 糖的合成细胞内多糖的合成 外源性糖供给充足时 在糖原合成酶的作用下 合成具有分支链的糖原 贮存能量 细胞外多糖的合成 细菌在葡糖基转移酶或果糖基转移酶的作用下 利用蔗糖合成胞外多糖 主要有葡聚糖 果聚糖和粘多糖 以及多糖 蛋白复合物 水溶性细胞外多糖易被细菌利用 是牙菌斑内能源的贮存形式 3 糖代谢的调节通过调节糖酵解的速度调节糖代谢 己糖激酶 葡萄糖激酶 果糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解途径中的限速酶 乳酸阀门 机制调节无氧酵解 对抗糖致死 二 氮源物质代谢 氮源物质对细菌生长重要作用 为细菌提供蛋白质更新所必需的氨基酸作为能源贮存代谢产生的碱性产物可调节牙菌斑基质的pH值 牙菌斑中的蛋白质经蛋白水解酶降解为胨 肽 再经肽酶降解为氨基酸 该过程的终末及中间产物可被不同细菌所利用 氨基酸的分解可通过脱氨 转氨和脱羧等方式完成 1 氨基酸失去氨基的脱氨作用是氨基酸分解代谢的主要方式 分为氧化脱氨和非氧化脱氨两种形式 代谢产物或衍生物包括 酮酸 过氧化氢 氨 ATP 羟醛酸等物质 2 转氨基作用是 氨基酸在转氨酶作用下将氨基转移到 酮酸的酮基位置上生成相应的 酮酸 转氨基作用既是氨基酸分解的重要方式 也是氨基酸合成的途径 3 脱羧基作用是在低pH值环境中发生的一种氨基酸分解方式 氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下分解为胺和二氧化碳 其代谢产物为碱性 可升高牙菌斑pH值 三 牙菌斑内矿物质转换 1 唾液与牙菌斑间矿物质交换唾液是牙菌斑矿物质的主要来源 唾液与牙菌斑中的矿物质以离子扩散的方式相互交换 该过程可逆 扩散速度取决于浓度差 2 牙菌斑与牙面的矿物质转换牙菌斑中的钙 磷主要以各种磷酸盐形式存在 磷酸盐的性质主要由钙磷的相对浓度及牙菌斑基质的pH值决定 Ca P比例高时固相溶解度低 酸性环境中磷酸盐的溶解度增加 第五节牙菌斑的致病性 一 牙菌斑与龋病 1 细菌致龋机制牙菌斑中致龋菌分解碳水化合物产生的有机酸是导致龋病发生的直接原因 1 牙菌斑中碳水化合物在细菌的作用下分解代谢产生乳酸 乙酸 丙酸等有机酸 氢离子和有机酸根离子扩散到釉质晶体周围 使釉质表面钙和磷酸盐等矿物质溶解 2 致龋菌合成非水溶性的粘性多糖形成生物屏障 限制牙菌斑内外物质的扩散 维持牙菌斑深层较低的pH值 当外源性糖缺乏时 细菌可利用这些细胞内多糖和细胞外多糖继续产酸 2 致龋菌的生物学特征 1 对牙面有选择性黏附力 2 可快速产生大量的酸 并具有强耐酸性 3 具有合成细胞内或细胞外多糖的能力 4 细菌的数量与龋病发生率密切相关 选择性的抑制该菌可降低龋病发生率 5 能引起实验动物传染性龋损 3 致龋牙菌斑特征致龋牙菌斑多位于牙齿的邻面和咬合面 致龋产物主要是有机酸 致龋牙菌斑内变异链球菌为优势菌 而能够合成葡聚糖酶的细菌及韦荣菌数量少 能够迅速分解蔗糖产生大量乳酸 并能够迅速将蔗糖转化为细胞内多糖 4 主要致龋菌目前已经证实的致龋菌有 变异链球菌 远缘链球菌 乳酪乳杆菌 嗜酸性乳杆菌和粘性放线菌 1 变形性链球菌 是最早确认的致龋菌 在病变早期发挥重要作用 具有强致龋性 它能够合成非水溶性葡聚糖 对牙齿的釉质面及根面均有较强的黏附力 它能够产生大量乳酸 并在pH低的酸性环境中生存 2 乳杆菌 能够产生大量乳酸 并具有强耐酸性 但是与牙面的亲和性很低 因而主要在龋病发展中起促进作用 乳杆菌在深龋中检出率高 在无菌鼠口腔中能产生点隙龋 与龋病密切相关的乳杆菌主要有乳酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌 3 粘性放线菌 粘性放线菌对牙面有较强的黏附力 能产生大量乳酸 主要诱发根面龋及邻面龋 二 牙菌斑与牙周病 一 特异性牙菌斑学说与非特异性牙菌斑学说非特异性牙菌斑病因学说 即牙周病是由非特异的口腔正常菌群的混合感染所致 这一学说强调牙菌斑数量的增加 或微生物毒力的增大 或宿主防御系统功能下降是牙周病发生的原因 特异性牙菌斑学说 即口腔微生物中大多数细菌是口腔正常菌群 只有少数细菌具有毒力 并能够损害宿主防御系统 当这些细菌在牙菌斑中存在或达到一定数量时则可引起特定类型的牙周病 这一学说强调牙菌斑细菌的质 认为牙周健康区与病损区 不同类型牙周病的病损区之间的牙菌斑微生物构成不同 只有某种或某些细菌与相应类型牙周炎密切相关 在该型牙周病的发生发展中起关键作用 二 牙菌斑引发牙周病的机制1 细菌及其代谢产物的直接破坏作用外毒素 exotoxin 是细菌在生长过程中由细胞内分泌到细胞外的毒性物质 能够抑制宿主蛋白质的合成 对宿主有细胞毒及神经毒性作用 内毒素 Endotoxin 是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖成分 是一种强烈的炎症因子 能够通过完整的龈沟上皮进入血液循环系统而扩散 对牙龈 牙骨质和牙槽骨均有破坏作用 酶 牙菌斑细菌能够产生多种水解酶 可破坏牙周组织而使炎症扩散 其他代谢产物 细菌代谢过程中产生的一些物质对细胞具有损伤作用 如硫化氢 吲哚 有机酸铵盐等 2 牙菌斑引起免疫性病理损害牙菌斑是多种抗原的集合体 能够引起宿主的免疫反应 造成的破坏作用要远远大于细菌直接引起的损害 三 牙周致病菌的特征1992年Socransky归纳的牙周致病菌条件为 必须是毒性克隆株 具有引发疾病的染色体遗传因子 宿主必须对该致病菌易感 数量超过宿主阈值 寄居于适当位置 局部环境利于毒性因子的表达 牙菌斑中的其他菌群不能抑制该菌的致病过程 目前已证实的牙周病致病菌 牙龈卟啉单胞菌 P gingivalis 伴防线放线杆菌 A actinomycetemco