基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究

导师 王红静教授研究生 张晓燕 PTEN基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究 研究背景 子宫内膜异位症 endometriosis EMs 是妇科常见疾病之一 组织学上虽然是良性的 但却有增生 浸润 转移及复发等恶性生物学行为 药物及手术治疗复发率均高 究其原因主要是EMs的病因及发病机制尚未完全明了 自1921年Sampson首先提出子宫内膜种植学说以来 在EMs众多的病因及发病机制中 种植学说虽被大多数学者所接受 但它无法解释盆腔外EMs的发生 也无法解释多数育龄妇女存在经血逆流 但仅少数 10 15 发病 越来越多的研究表明EMs与高血压 糖尿病 精神分裂症等一大类疾病一样被认为受多基因遗传及多因素的影响 现今的研究表明 子宫内膜碎片必须通过粘附 侵袭及血管形成 方可以生存 生长 这一过程的完成是由在位内膜的不同生物学特征 即基因差异决定的 因此 当前的研究重点在于寻找和鉴定EMs相关的遗传基因 PTEN phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen PTEN 是1997年发现的一种新的抑癌基因 是继P53基因之后发现的在人类肿瘤中突变率最高的基因 也是子宫内膜腺癌中发现的突变率最高的基因 被认为是子宫内膜的 看家基因 研究发现PTEN与子宫内膜相关性疾病如EMs的发病密切相关 PTEN通过调控细胞周期 抑制细胞分化 抑制细胞粘附和迁移 诱导凋亡等参与肿瘤的发生 发展 内异症患者在位内膜可能因抑癌基因PTEN失活而表现出与正常内膜不同的生物学特性 如细胞粘附增强 凋亡减少 血管形成能力增强 从而容易在异位部位存活并生长 继而引起相应的症状和体征 PTEN基因突变 杂合性缺失及多态性改变与多种肿瘤如食道癌 膀胱癌等的发病密切相关 其基因突变 杂合性缺失与EMS的相关性研究报道也较多 而PTEN多态性与EMS的相关性研究才处于探索阶段 PTEN 9C G 以下简读为 9C G 单核苷酸多态性 SNP 及PTEN S4 以下简读为IVS4 为PTEN基因最常见的两个多态性位点 此两个位点多态性的改变与食道癌 鼻咽癌的相关性研究已见报道 国内外目前尚无此两个位点多态性的改变与EMs的相关性研究报道 PTEN 9C GSNP位于PTEN翻译起始点上游的第9位核苷酸处 C G的替换使得G周期性地出现 它非常接近翻译时使核糖体停留在阅读框架内的交感序列 因此C G的替换可能影响PTEN的表达 PTEN S4 为第4内含子的一个插入性多态 可能通过不同剪切及通过与其它位点连锁来影响其基因表达 本研究首次采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 polymerasechainreaction restrictionfragmentlengthpolymorphism PCR RFLP 技术对PTEN 9C G及IVS4 基因进行分型 旨在探讨此两个位点的多态性与EMs的关系 材料与方法 主要实验仪器及设备名称型号生产厂家洁净工作台上海力申科学仪器有限公司高速离心机TG19A WS美国BECKMAN公司低温离心机TGL 16H珠海黑马医学仪器有限公司普通冰箱BCD 130H青岛海尔股份有限公司电子天平PB3002 S瑞士Mettler公司PCR扩增仪PTC一200美国MJReseareh公司Eppendorf移液器0 1 1000ul德国Eppendorf公司紫外扫描仪GelDoe1000美国BioRad公司稳压稳流电泳仪DYY III3北京市六一仪器厂电泳槽Sub一Cell Model96美国BioRad公司凝胶成像分析仪AlphaImagerTM2200美国AlphaInnotech公司 主要实验试剂试剂名称生产厂商全血基因组DNA提取试剂盒北京博大泰克公司引物合成上海生工DNA胶回收试剂盒北京博大泰克公司PCR纯化试剂盒上海生工蛋白酶K Germany Merck公司限制性内切酶AflIINewEnglandBiolabs限制性内切酶DraIINewEnglandBiolabs100bpDNAladder华美生物工程公司 研究对象 EMs组 86人 无肿瘤性及遗传性疾病病史 术后病检证实为子宫内膜异位症的患者 对照组 64人 同期因输卵管阻塞继发不孕 宫外孕及子宫脱垂等手术 术后病检排除EMs 且无肿瘤性及遗传性疾病病史的患者 标本采集 采集每位研究个体的外周血3ml EDTA抗凝 置4 冰箱保存 并于采血后1周内提取符合条件的研究对象的外周血白细胞DNA DNA的提取 用微量全血基因组DNA提取试剂盒 提取全基因组DNA 100 l裂解液20 lRNaseA 蛋白酶K 55 温浴30min 12000rpm离心1min 弃尽上清 100 lTE 10000rpm离心1 5min 弃上清 300 l红细胞裂解液 300 l抗凝全血等体积红细胞裂解液 加入10 l3MnaAC 1250 l结合缓冲液加入600 l漂洗液 加入30 lddH2O洗脱 20 保存24小时将所提DNA进行Agarose电泳泳 PTEN的基因分型 采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 PCR RFLP 方法进行基因分型 PTENIVS4 引物 上游引物 5 GGGGGTGATAACAGTATCTA 3 下游引物 5 CTTTATGCAATACTTTTTCCTA 3 PCR反应体系 72 延伸1min 58 退火45s 94 变性30s 94 预变性5min 35个循环后 72 继续延伸5min PCR反应条件 扩增产物为403bp PTENIVS4 PCR产物酶切电泳后判断基因型 纯化PCR产物10 l经限制性内切酶AflII 2 l 于37 酶切过夜 行2 5 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像仪下观察判断基因型 纯合型显示403bp一条电泳带 纯合型显示335bp和73bp两条电泳带 杂合型显示403bp 335bp和73bp三条电泳带 PTEN 9C G引物为 上游引物 5 GCAGCCGTTCGGAGGATT 3 下游引物 5 GCCGCAGAA ATGGATACAGG 3 PTEN 9C GPCR反应体系及反应条件同扩增PTENIVS4 PTEN 9C GPCR产物酶切电泳后判断基因型 纯化PCR产物10 l经限制性内切酶DraII 10 l 于37 酶切过夜 行2 5 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像仪下观察判断基因型 C C纯合型显示371bp的一条电泳带G G纯合型显示266bp和105bp两条电泳带C G杂合型显示371bp 266bp和105bp三条电泳带 统计学分析 数据用SPSS13 0软件进行统计学分析 P 0 05认为有统计学意义 比较基因型频率的观察值与预期值 并进行卡方检验行Hardy Weinberg平衡分析 病例组与对照组的基因型及等位基因分布采用卡方检验 用OR值及其95 可信区间 分析PTEN 9C G IVS4 多态性与EMs的关系 结果 一 研究对象的一般特征 1 平均年龄EMS组 35 4 7 69岁对照组 35 6 12 24岁两组比较 平均年龄差异无统计学意义 t 0 122 P 0 05 2 家族史EMs阳性家族史 EMs组为24 4 对照组仅10 9 两者相比有统计学意义 2 4 392 P 0 05 EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险 OR值2 6308 95 CI 0 8117 5 1771 二 PTEN基因 S4 扩增产物Afl 酶切电泳结果PTEN S4 纯合型产生403bp一条电泳带PTEN S4 纯合型产生335bp和73bp两条电泳带PTEN S4 杂合型产生403b 335bp 73bp三条电泳带 Fig 1GenotypepatternforPTENIVS4 polymorphismanalyzedbyPCR AflIIdigestion Lane1 homozygousgenotype Lane2 homozygousgenotype Lane3 4 5 and6 heterozygousgenotype 三 PTEN基因 9C G扩增产物DraII酶切电泳结果 C C纯合型产生371bp的一条电泳带G G纯合型产生266bp和105bp两条电泳带C G杂合型产生371bp 266bp和105bp三条电泳带 Fig 2GenotypepatternforPTEN 9C GpolymorphismanalyzedbyPCR DraIIdigestion Lane1 4and6 C Gheterozygousgenotype Lane2and3 G Ghomozygousgenotype Lane5 C Chomozygousgenotype 四 PTENIVS4 多态位点的基因型分布 Table2 PTEN 9C GGenotypeHardy WeinberyexaminationintwoGroups 五 PTEN 9C G多态位点的基因型分布 六 PTEN 9C G基因型分布与EMs的发病风险 七 PTENIVS4 基因型分布与EMs的发病风险 八 PTEN单体型与EMs的发病风险 讨论 一 研究对象的一般特征1 平均年龄EMS组 35 4 7 69岁对照组 35 6 12 24两组比较 平均年龄差异无统计学意义 t 0 122 P 0 05 说明病例组与对照组年龄分布具有可比性 2 家族史阳性家族史 EMs组为24 4 对照组为10 9 两者相比有统计学意义 2 4 392 P 0 05 OR值2 6308 95 CI 0 8117 5 1771 说明EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险 进一步证实了EMs的家族遗传倾向 二 分析PTEN基因 9C GSNP及IVS4 基因型及等位基因频率分布情况本研究中PTEN 9C GSNP的基因型分布在EMs病例组及对照组中均符合Hardy Weinbery平衡 表明研究对象具有群体代表性 PTENIVS4 基因型分布在EMs病例组及对照组中均不符合Hardy Weinbery平衡 可能的原因有 突变 选择 随机遗传漂变 迁移及遗传异质性 本研究人群中 PTENIVS4 杂合型 73 5 明显高于另两种类型 10 9 15 6 这是Hardy Weinbery平衡计算中影响其遗传平衡的主要因素 可能跟遗传选择中的杂合子优势有关 具体原因有待进一步研究 本研究对照组中 9C GSNP的基因型分布 C C90 6 C G9 4 G G0 0 与日本人群 C C95 0 C G5 0 G G0 相似 而IVS4 多态的基因型分布 10 9 73 5 15 6 与美国人群 43 1 45 7 11 2 有显著差别 在不同种族不同地区人群中PTEN基因的多态性可能分布相似或存在差异 三 分析PTEN 9C G基因型分布与EMS发病风险合并PTEN 9C G及G G基因型与C C基因型相比 携带G等位基因 C G G G 不改变EMs的发病风险 与张小爱及Ge等分别在PTEN 9C G多态性与鼻咽癌及食道癌中的研究结果一样 位于PTEN非编码区的 9C G多态性改变可能不改变抑癌基因PTEN的功能 不增加EMs的发病风险 四 分析PTENIVS4 基因型分布与EMs的发病风险在合并PTENIVS4基因 和 后与 相比 病例组与对照组差异有统计学意义 P 0 05 PTEN S4基因多态性中 突变型 可能降低EMs的发病风险 这与 S4 基因型降低食管癌的发病风险的报道一致 但与IVS4 基因型可增加较年轻者患乳腺癌的风险的报道不同 在不同类型肿瘤中 PTEN S4多态性发挥不同的作用 同时也存在不同人群中这一多态存在着对肿瘤易感性的差异的可能性 因此有必要在某一确定的人群中进行不同类型疾病的研究 来评价PTEN S4多态性的作用 五 分析PTEN单体型与EMs的发病风险在PTEN 9C G和IVS4 构成的单体中 9C IVS4 为EMs病例组中最常见 9C IVS4 为对照组中最常见 与对照组中最常见的单体型 9C IVS4 相比 9C IVS4 9G IVS4 9G IVS4 三种单体型在EMs组及对照组中的分布无统计学差异 也均不增加EMs的发病风险 这与Ge等的研究结论 9C IVS4 单体型增加食管癌的发病风险 结果不同 PTEN 9C G和IVS4 这两个多态位点构成的单体型中 是否可能通过相互连锁 共同影响对肿瘤及EMs的易感性 需要进一步扩大样本量并通过单体型 表型的关系来阐明 结论 1 EMs家族史明显增加EMs的发病风险 2 与PTEN 9C C基因型相比 携带G等位基因 即C G G G基因型 不影响EMs的发病风险 3 PTENIVS4 基因型可以降低EMs的发病风险 是EMs发生的保护性因素 4 与 9C IVS4 单体型相比 9C IVS4 9G IVS4 9G IVS4 单体型不影响EMs的发病风险 致谢 首先 感谢我的导师王红静教授 在王教授的倾力支持和严格要求下 本课题得以顺利完成 导师无论在课题确定 实验设计还是论文撰写上都倾注了大量心血 特别是对