P物质上调正常人真皮成纤维细胞TGF—β1的mRNA表达.doc

P物质上调正常人真皮成纤维细胞TGF1的mRNA表达中华整形外科杂志2002年7月第鲞笙塑!,ly.!:!:!P物质上调正常人真皮成纤维细胞TGFl3.的mRNA表达胡大海陈璧朱雄翔陶克汤朝武王剑波【摘要】目的探讨神经肽P物质(SubstanceP,SP)与瘢痕形成间的调控关系.方法体外分离培养正常人真皮成纤维细胞,分别加入sP及其受体特异性拮抗剂L一703,6O6乙酸盐,M.rr法测定细胞生长增殖量;采用细胞爬片法培养细胞,加入sP对细胞作用后,应用TGF-.mRNA特异性探针行细胞原位杂交,计算细胞的TGF-.mRNA阳性表达率,并经图像分析测定阳性细胞TGF-mRNA的表达强度,分析sP与真皮成纤维细胞TGFp.mRNA表达间的关系.结果sP可促进体外培养的正常人真皮成纤维细胞的生长,其作用与sP浓度呈现依赖关系,当浓度达到25ng/ml时,刺激细胞生长的速率达最大值,可使细胞较对照组提前4d融合;正常人真皮成纤维细胞受25ng/ml的SP刺激后TGFp.mRNA的表达明显上调,48h后即可见细胞表达TGFp.mRNA的阳性率及强度均显着增加;sP对正常人真皮成纤维细胞的上述效应,均可被其受体拮抗剂L-703,6O6乙酸盐所抑制.结论sP可促进正常人真皮成纤维细胞的生长增殖,同时上调细胞的TGFp.mRNA表达;提示sP可能为皮肤损伤后瘢痕形成过程中启动成纤维细胞表型转化的重要调节因子.【关键词】瘢痕P物质真皮成纤维细胞细胞培养TGFp.SubstancePup-regulatestheTGFplmRNAexpressionofhumandermalfihroblastsinvitroDahai,CHENBi,ZHUXwngxinag,D,GChaowu,WANGJianbo.DepartmentofBurns,XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity.Xan7l0032.China【AbstractJ0bjectiveToinvestigatetheroleofsubstancePintheformationofhypertrophicscarMethodsDermalfibroblastsderivedfromhumannormalskinwereculturedwithsubstancePaloneortogetherwithselectivenonpeptideNKltachykininantagonist.L-703.606oxalatesalt.TheeffectofsubstancePonproliferationoffibroblastswasmeasuredbyM.rrassay.Furthermore,theTGF一81mRNAexpressioninthefibroblastswasdeterminedbyinsituhybridizationandimageanalysis.ResultsSubstancePenhancedfibroblastproliferationdose?dependently,whichshowedthemaximumratewhentheconcentrationofsubstancePwas25ng/mlorhigherintheculturemedia.By48hoursculturedwith25ng/mlofsubstanceP,thefibroblastsexpressedTGF一8lmRNAmoresignificantlythanthefibroblastswithoutsubstanceP.TheeffectsofsubstancePonbothfibroblastproliferationandTGFplmRNAexpressioncouldbeantagonizedbyL-703,606OXalatesalt.ConclusionTheresultssuggestthatsubstancePmayplayanimportantroleinphenotypechangesoffibroblastsinskinscarring.【KeywordsJScar;SubstanceP;Dermalfibroblast;Cellculture;Transforminggrowthfactor81近年来的研究表明神经肽P物质(SubstanceP,SP)在瘢痕增生活跃时呈现明显的变化J,但有关sP与Hs间的确切关系及作用机理尚不清楚.我们以体外培养的正常人真皮成纤维细胞(Normalhumandermalfibroblast,NHDF)为模型,观察sP对NHDF生长增殖及TGF一.mRNA表达的影响,为探讨sP在瘢痕形成中的作用机理提供实验资料.作者单位:7132西安,第四军医大学西京医院烧伤外科(胡大海,陈璧,朱雄翔,陶克,汤朝武),病理科(王剑波)?论着?1材料与方法1.1细胞培养标本来源于整形手术剩余的正常全厚皮,切去表皮及皮下组织后,剪成1mm1mm大小真皮组织块,贴附于培养瓶内,加入DMEM(Gibco公司)/10%胎牛血清(FetalcalfseFilm,FCS)进行培养;待成纤维细胞长满培养瓶后,胰蛋白酶消化,传代扩大培养用于实验.1.2细胞增殖的MrIT法测定NHDF培养至95%融合时,胰蛋白酶消化,用DMEM/10%FCS配制浓度/10个细胞/ml的细胞悬液,以每孑L110个细胞的密度接种于96孑L板内,培养24h后换液,加人中华整形外科杂志2002年7月第18卷笙塑!:!:!含不同浓度的sP(Sigma)及sP受体拮抗剂L一703,606乙酸盐(ResearchBiochemicalsIntemational公司)的DMEM/5%FCS培养;隔日换液,DMEM培养基所含辅加成份保持不变;于培养后不同时间点采用MTI比色分析法测定细胞的生长增殖量.MTI比色分析法过程:用PBS配制5%MTI(Sigma)溶液,加入待测96孔板的细胞培养基内,每孔加20l,置37,c0:孵箱内反应4h;弃上清,加入100l/孔的纯二甲基亚砜溶解细胞,于570nm波长下测定吸光度,每一相同处理组共测8孔,用测得的平均值代表细胞的相对数量.1.3细胞原位杂交NHDF悬液配制同前,取200l滴加到20mm20mm的盖玻片上培养,细胞附壁后添加培养基再培养24h换液,加入含25ng/mlsP及sP受体拮抗剂L.703,606乙酸盐的DMEM/5%FCS培养基,培养72h后,弃上清液,加预冷的纯丙酮固定细胞;用TGF.mRNA杂交试剂盒(TGF.口.ISHDetectionKit,武汉博士德生物工程有限公司)行细胞原位杂交,步骤按使用说明进行;所用的TGF.8.寡核苷酸探针序列为:TGGACGTICTGGTAGCTGTACCTCGACCACTITGC;GCACGTCTCGACGCGAACGTCTCTAATmAGTTC;GTGTCGAGTGCCGTGGCCTCTCGGGAC.CTATGGTI;经DAB显色后,苏木素轻度复染,酒精脱水,二甲苯透明,封片观察.1.4TGF.p.mRNA阳性细胞表达率计算各处理组分别取原位杂交片5张,每张按体视学分析要求随机取10个高倍镜视野,分别计算全部细胞数及显示TGF.p.mRNA杂交信号阳性的细胞个数,以二者的相比百分数表示细胞的TGF.mRNA阳性表达率.1.5TGF.mRNA表达强度的图像分析半定量测定各组随机化原则同上,测量每个视野内的全部TGF.pmRNA杂交信号阳性细胞内DAB显色的吸光度A值,计算每个细胞的平均值,以此代表细胞内TGF.p.mRNA的表达强度.1.6统计学处理全部数据均表示为平均数标准差,行组问t检验.2结果2.1SP对NHDF增殖的影响SP的浓度为1100ng/ml作用24h,各组NHDF的增殖量与对照组相比无明显差别,作用至72h后,NHDF的生长增殖则呈现明显不同;可见SP小于10ng/ml时对NHDF的生长无影响,而10ng/ml的sP作用72h后可使细胞较对照组增加(19.446.26)%(P<0.05),25ng/ml的sP可使细胞增加(36.54.86)%(P<0.01),sP浓度大于25ng/ml以上时,细胞增加量不再上升.使细胞处于25ng/ml的sP作用下连续培养,可见细胞于培养后约7d达到融合状态,较对照组提前4d进入生长平台期;这种SP促进NHDF的增殖效应可被其受体拮抗剂L.703,606乙酸盐所抑制(图1).l2能求昏与对照组比较:一P<0.叭图1SP对NHDF生长曲线的影响P<0.01VScontrolFig1EitectofsubstancePonthegrowthCUlVeotnormalhumandermalfibroblasts2.2SP对NHDF表达TGF.mRNA的影响加入25ng/ml的sP作用48及72h后,可见NHDF阳性TGF-.mRNA表达率比对照组分别高(11.192.48)%及(57.923.45)%(P<0.01);与此同时阳性细胞内的TGF.p.mRNA表达强度明显增加,其表达强度较对照组分别增加(1l9.85-4-26.73)%及(80.0711.28)%(P<0.01,图2,3).镜下观察见经sP作用48h时,某些NHDF细胞浆内出现TGF.mRNA表达异常增强的杂交信号.3讨论皮肤神经系统含有丰富的神经末梢,其对损伤刺激信号具有特定的敏感性,因此,在皮肤修复过程中无疑起着重要作用.近来有关sP在损伤后增生性瘢痕中的变化引起人们的注意.sP为发现最早研究最清楚的神经肽,由11个氨基酸组成,属速激肽类,sP在皮肤内主要存在于感觉神经末梢,动物实验显示,皮肤损伤可导致受损组织内的sP释放量明显增加,过量的SP参与引发组织水肿及炎症反应等病理过程.丛林等对临床病人增生性瘢痕活跃期组织内的sP含量测定发现比正常皮肤增236?中华整形外科杂志2002年!旦箜鲞笙塑型瑾!:!:!:072细胞培养时问(h)与对照组比较:一P<0.O1雷2sP对NHDF表达TGF.plmRNA阳性率的影响P<O.O1VScontrolFig2EffectofsubstancePonthepercentageofnormalhumandermalfibroblastsexpressingTGF-plmRNAO40.35米030昏025072细胞培养时间(h)学特性的改变,多表明细胞表型的变化.近代瘢痕研究的大量实验显示很多细胞因子如TGFJ3,TGF一,IL一1等与增生性瘢痕的发生密切相关,其中TGFJ3,的作用更为重要?;因此,我们观察了sP与NHDF表达TGF.I3,mRNA的关系,发现sP可直接导致NHDF的TGF.I3,mRNA表达上调,该结果进一步提示:sP于活体内可能对正常真皮成纤维细胞在损伤后向增生性瘢痕成纤维细胞表型转化过程中,发挥重要的启动因子作用.参考文献丛林,李世荣,徐友奇.增生性瘢痕P物质含量的放射免疫测定中华整形烧伤外科杂志,1998,14:401.4032CroweR,ParkhouseN,McgroutherD,etal4与对照组比较:一P<O.O16围3SP对阳性表达TGF.mRNA的NHDF表达强度的影响P<O.O1VScontrolFig3EffectofsubstancePontheTGF一(1mRNAintensityofnormal7humandermalfibroblastsexpressingTGF(1mRNA)加约1倍,该结果与应用免疫组化对SP神经定位分析的结果相一致.此外,有实验证明SP可刺激肥大细胞释放组织胺等生物活性因子,因此可能导致组织纤维化反应引.但综合分析上述实验结果,sP所表现的扩张局部血管,传导及易化初级感觉伤害性刺激,使组织胺释放等作用,均提示sP可能为导致活跃期的增生性瘢痕临床表现潮红,疼痛,瘙痒等主要皮肤感觉症状的重要介质.增生性瘢痕的组织病理特征为成纤维细胞过度激活增殖同时伴随大量的胶原合成堆积.我们观察到,sP具有刺激由正常人真皮体外分离获得的NHDF的增殖效应,其与Kahler等的研究结果相似,提示活跃期增生性瘢痕组织内过量的sP可能直接参与了激活成纤维细胞的失常增殖反应.Parent】等.实验观察到SP可促进人皮肤成纤维细胞迁移,并证明SP的促迁移效应由人皮肤成纤维细胞的速激肽NK1受体所介导.细胞增殖,迁移等生物89nervesinpainfulhypertrophichumanscartissueBrJDermatol,1994,130:444452.王波涛,陈璧,胡大海,等.大鼠皮肤降钙素基因相关肽正常分布及烫伤后改变规律.中华整形烧伤外科杂志,I999,15:62.65.OlerudJE,UsuiML,SeckinD,eta1.Neutralendopeptidaseexpres-sionanddistributioninhumanskinandwounds.jInvestDermatol,1999.112:873.881DunnickCA,GibranNS,HeimbachDMSubstancePhasaroleinneuregenicmediationofhumanburnwoundhealing.JBurnCareReha-bil.1996.17:390.396.DamasJ,LiegeoisJF.Theinflammatoryreactioninducedbyformalinintheratpaw.NaunynSchIIliedebergsArchPharmacol,1999,359:220227.CdumboM.HorowitzEM.KageySobotakaA.ela1.SubstancePactivatesthereleaseofhistaminefromhumanskinmastcellsthroughapertussistoxinsensitiveandproteinkinaseCdependentmechanism.ClinImmunollmmunopathol,1996,81:6873.Katayama1.NishiokaK.SubstancePaugmentsfibrogeniccytokineinducedfibroblastproliferation:possibleinvolvementofneuropeptideintissuefibrosis.JDermatolSci,19