RNA提取中的原理.doc

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。 异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。 氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用 。通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧。 异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈手摇才行，这样才能彻底地两相混匀。而且DNA在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀。l楼主问的问题，我的个人理解是：前面提取的RNA经异丙醇沉淀后，总会含有一些未除去的蛋白和其它杂质分子，这些蛋白和杂质分子如果不除尽的话，就会直接影响所提取的RNA的纯度和稳定性。为此，就需要用70%乙醇洗涤沉淀(因为在70%乙醇里RNA是不溶的,而一些蛋白和其它杂质分子却可溶),并且最好是洗涤2次，然后高速离心后，倒去上清，即可得到较纯的RNA沉淀。用无水乙醇则达不到这个目的!。以下是我个人提取RNA时的操作总结，不正之处，请战友指正！1.1 匀浆1) 每个无菌的2 ml圆底离心管中加入0.75 ml TRIZOL试剂，每个大鼠的腺垂体从-80C取出后立即于预冷的TRIZOL试剂里用POLYTRON组织匀浆器（瑞士）进行匀浆。【注：1. 匀浆液的量按每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL，样品的体积不能超过匀浆液体积的10%。 2. TRIZOL试剂用前应于4C保存，操作时应带手套和口罩。3. 匀浆器头用前需在3% H2O2（DEPCC水配）里浸泡，然后于0.1% DEPC水中空转2次，最后于TRIZOL试剂中空转2次，方可用于匀浆。4. 匀浆时间不宜太长，转速不宜过大，刚开始时由慢到快至中档处，然后减速，重复1-2次，未见有组织碎块即可如果样品数多的话，可先将TRIZOL试剂一并加好，然后逐一加入样品匀浆。.特注：每加完一种试剂，都应及时盖上管盖，夹取管子或者打开管子时，尽可能不要碰到管的内缘。】。2) 将匀浆样品置于15-30C下静置5分钟，以使核酸蛋白复合物完全分离。如果所提取的组织中含有较多的蛋白、脂肪等，则应在匀浆结束后将匀浆液于4C，12000 g，离心10分钟，取上清用于以下操作。【注：如果此匀浆液暂时不用于实验，可于-80C下保存至少1个月。】1.2 RNA 提取1) 加0.15 ml氯仿（每1 ml匀浆液加0.2 ml氯仿），盖好管盖，用手剧烈振荡15秒，于15-30C下静置3分钟。【注：如果样品数多的话，可先于一个无菌的离心管中倒入适量的氯仿，而勿需每次从大瓶子里吸取，这样可以减少污染，亦可加快速度】2) 4C，12000 g，离心10分钟。3) 小心吸出上层无色溶液（约为匀浆液体积的60%）于另一个1.5 ml无RNAase的离心管中。【注：此步非常需要注意的是，在吸取上清时，切勿切勿将中间和底层的有机相吸出，宁愿少吸一点上清。同时，最好是用小枪头吸，这样就可以保证不吸到中间相】4) 加无RNAase的糖原10 g（终浓度约为250 g/ml，最多不能大于4 mg/ml），盖好管盖，充分振荡后，加入等体积的异丙醇（约400 l），室温静置10分钟。【注：1. 糖原应不含RNAase，其作用是能够携带液相RNA溶液，有助于其沉淀。2. 在4C下静置容易使其它不重要的物质沉淀下来，所以最好在室温下静置。3. 如果样品数多的话，可先于一个无菌的离心管中倒入适量的异丙醇，而勿需每次从大瓶子里吸取，这样可以减少污染，亦可加快速度。】4) 4C，12000 g，离心10分钟。5) 小心倒去上清。加0.75 ml 75乙醇清洗沉淀（0.1DEPC水配制。缓慢用枪头打起沉淀，均匀吹打几次。每1 ml匀浆液加1 ml 75乙醇），涡旋振荡，混匀。【注：如果沉淀暂时不用于实验，可在加入0.75 ml 75乙醇后，于4C下至少可以保存1周，或于-20C下至少可以保存1年。】6) 4C，7500 g，离心5分钟。7) 重复步骤5)-6)。8) 小心倒去上清，轻甩2下后，用移液器小心将离心管内残余的液体吸出，打开管盖，将沉淀于操净台上晾干（5分钟即可，完全晾干后反而会降低沉淀的溶解另外，亦可将装有沉淀的管子盖紧盖子后，放进一次性手套中，然后打开管盖，稍微包扎手套后，于50C烘箱中放置3分钟即可）。【注：如果来不急做完下面的工作，可将步骤8）所得到的沉淀于-80 C保存。第二天直接从步骤 9)开始做，这样就可以增加RNA的保存，防止降解。】RNA提取心得/经验/体会/纪律（RNA提取注意事项）！ (2009-08-30 00:05:37)转载标签： rna提取心得 体会 注意事项 ep 枪头 氯仿 研钵 ml 水瓶毛毛 校园分类： 专业知识 纪律一：杜绝外源酶的污染。 注意一：严格戴好口罩，手套。 注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。纪律二：阻止内源酶的活性 注意四：选择合适的匀浆方法。 注意五：选择合适的裂解液。 注意六：控制好样品的起始量。纪律三：明确自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。Rnase 污染的10大来源1：手指头 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。2：枪头，离心管，移液器 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。3：水/缓冲液 一定要确保无 Rnase 污染。4：实验台面 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。5：内源 Rnase 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。6：RNA 样品 RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。7：质粒抽提 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。8：RNA 保存 即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。9：阳离子 (Ca, Mg) 在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。10：后续实验所用的酶 酶均有可能被 Rnase 污染。RNase 和 DEPC 处理1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明：37 C 与 RNA 反应，没有灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml；灭菌后，活性点为 100 ng/ml。当然，灭菌后 Rnase 仍然不能认为没有残留。2：DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示，0.1% DEPC 只对 MOPS 有效，而 1% DEPC 对三种试剂都有效。4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。我也来谈谈RNA的提取，我觉得14楼说的方法很严格，但是有时候我们其实不必在过多的细节上太紧张。而在有些步骤一定要小心了。以下的内容，是讲给那些既想偷懒，有希望实验结果有保证的人听的，如果你是习惯于每一步都很严格的人的话，建议还是按照14楼的方法做，因为那样才是正途啊。 好了，下面是给想偷懒，但又不想搞砸实验的战友看的。用最少的时间，Money，力气，来做出最好的结果，是我们的终极目标（PS：我相信一句话，懒人推动科技进步！个人愚见，大家不要拍我啊）。我是做植物的，所以以植物RNA提取为例子：一、关于器皿的处理： 枪头ep管最好是用DEPC处理一下，当然如果老板钱多的话，尽管用进口的RNase-Free的吧。这里，如果你想要偷点懒，也是有办法的，就是少处理一些ep管，因为后面我们会讲到，不是所有的ep管都一定要处理的。 研钵，这个东西按要求是要高温干燥处理的，但是在实际实验中，如果你不处理的话，也不会有太大的影响。因为在一般我们要处理的材料上都会带有很多的RNA酶，设想一下，一个研磨碎了的细胞会释放多少RNA酶出来。所以，在研钵上残留的那些RNase，不是导致你RAN降解的原因。我的做法是，洗干净的研钵，和枪头等一起湿热灭菌即可。如果你真的很急的话，连湿热灭菌也免了。 关于手套、口罩和实验台。手套是一个很重要的东西，这个千万不能省，而且实验过程当中要勤换手套。因为，一般我们在做实验是时候，还要取用很多其他试剂、仪器。所以手套往往是最有可能污染你样品的东西。所以千万记得要换得勤快点。还有，顺便说一下，最好是戴两层PE手套，因为实验过程中，往往手上会出汗，戴一层手套的话，往往脱下来，就很难戴上去了。戴上两层，外层的手套可以方便更换，免得戴不上，还把PE手套夹到ep管里面，这样可是很危险的！至于口罩，我认为，不戴也没关系，但不戴口罩的话，建议你少说些话了，尤其是不要对这样品。讲话是时候，带出去的口水，足够降解你的样品了。工作台的话，我想，能在一个超净台上是最好，普通的bench也可以，但是要保证周围没人干扰，否则，有人冲你打个招呼，那喷过来的口水就够让你的RNA嗝屁了（像口水兵？）。二、关于实验过程和试剂 通常，提取植物RNA的方法如下 试剂：Trizol，氯仿，75乙醇，异丙醇，DEPC水； 操作： 1）、每100mg组织加1ml TRIZOL试剂，用液氮匀浆后，室温放置到变成液态； 2）、将液体吸到1.5 ml EP管中（可以用没有经DEPC处理的ep管），加新开的氯仿0.2ml，振荡15秒。 3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4，离心。 4）、取0.5ml上清到ep管（DEPC处理）加等体积的氯仿重新抽提；4，12000g，15min； 5）、取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟； 6）、12000 rpm，15分钟，4，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别倒了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4离心。 7）、重复洗涤（可选）； 8）、去上清，用10 ul Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟； 9）、加DEPC水20-30 ul，枪打匀，溶解总RNA，测OD值。 10）、电泳，检测RNA质量。 讲一下注意事项和可以偷懒的地方。Trizol现在我发现好多实验室都是自己做的，所以也不要吝啬，多加一点吧，这个东西可以有效的抑制RNase的活力，情愿偏多，不要偏少。第1）步，在磨样的时候，注意，千万要保持低温，尤其是开始还没加Trizol的时候，千万不要让样品的温度升高了，否则就可以和你的RNA说拜拜了。在加了Tri