第一章 植物组织培养实验室的构建和操作技术

植物组织培养 第一章植物组织培养实验室的构建和操作技术 第一节实验室及主要设备 主要内容 植物组织培养的设计原则组培室的组成及其功能无菌操作设备常用工具常用仪器设备 组织培养实验室布局的总体要求 便于隔离便于操作便于灭菌便于观察 实验室设计原则 保证无菌操作 达到工作方便 防止污染 实验室的大小应取决于工作的目的和规模按组织培养流程来设计 避免某些环节倒排 引起日后工作混乱利用一定的设备 器材和特殊的实验室结构设计 达到严格无菌的条件 一 实验室设置及仪器设备 实验室是进行组培研究的主要场所 应能满足清洗 培养基制备 储藏 无菌操作 培养 鉴定等多方面的工作 辅助实验室 实验室组成 准备室缓冲室无菌操作室培养室 细胞生物学实验室温室生化分析实验室 基本实验室 1 构成与配置 基本实验室布局平面图 实验台 搁架 培养架 培养架 培养架 培养架 药品及仪器柜 无菌台 无菌台 搁架 拉窗 冰箱 搁架 水槽 电炉 门 4 5m 3 0m 3 5m 4 0m 准备室 缓冲室 无菌室 培养室 AGlimpseofPlantTissueCulture 1 准备室 所需器具的清洗 干燥和保存培养基的配制和灭菌生理生化测定等 组织培养准备实验室 1 洗涤间 根据工作量的大小决定其大小 一般面积控制在30 50m2 在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽 用来清洗玻璃器皿 中央实验台还应配置2个水槽 用于清洗小型玻璃器皿 如果工作量大 可以购置一台洗瓶机 准备1 2个洗液缸 专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿 此外还应配置落水架 干燥箱 柜子 超声波清洗器等 地面应耐湿并排水良好 面积60平方米左右 配备的主要仪器设备有 冰箱 天平 微波炉 pH计 培养基分装器 药品柜 器械柜 抽气泵 电炉 各种规格的培养瓶 培养皿 移液管 烧杯 量筒 容量瓶 储藏瓶等 冰箱以体积180 200L为宜 用于储存培养基母液 激素维生素等贵重药品 彩色胶卷 及保存植物材料 天平应有不同感量 2 培养基配制间 配备实验台 高压灭菌锅 排风灭火设备 细菌过滤设备 干热消毒柜 电炉等 灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅 一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅 较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅 生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅 如果没有条件的话 可以将上述工作间合并成一个准备间 要求是设备的安装和排列要合理 房间要宽敞 明亮 透风 地面要便于清洁 防滑 3 消毒间 2 缓冲室 注意门的朝向 工作人员在此换上工作服 拖鞋 戴上口罩功能减少人体从外界带入的尘埃等污染物 要求缓冲间需3 5平方米 应保持清洁无菌 有清洁的实验用拖鞋 已灭菌过的工作服 1 2盏紫外灯定时照射 对衣物及空间进行灭菌 无菌操作室主要用于实验材料的接种操作 所以又叫接种室 通常由里外两间组成 外间是缓冲间 用于准备工作 还有防止污染的作用 缓冲间的门应该与接种室的门错开 两个门也不要同时开启 以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌 缓冲间内应该设有水槽 实验台 鞋帽架 和柜子 紫外灯 无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修 工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋 室内应配有超净工作台 紫外灯 解剖镜 各种接种器械等 3 无菌操作室 无菌室 一 无菌室 二 为了控制培养室的温度和光照时间及其强度 培养室的房间不要窗户 但应当留一个通气窗 并安上排气扇 室内温度由空调控制 光照由日光灯控制 天花板和内墙最好用塑料钢板装修 地面用水磨石或瓷砖铺设 一般要分两间 一为光照培养室 一为暗培养室 培养室外应有一预备间或走廊 培养室应配有培养架 转床 摇床 光照培养箱 生化培养箱 自动控时器等 日光灯一般用40W 固定在培养架的侧面或搁板的下面 每层有两支日光灯 距离在20cm 光照强度为2000 3000lx 4 培养室 培养室 植物组织培养材料移到田间前 通常先移到温室进行练苗 待生根成活后 再移到大田 2 辅助实验室 1 鉴定室细胞学鉴定室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究 要求清洁 明亮 干燥 使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染 应配置各种显微镜 照相系统等 生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中 应建立相应的分析化验实验室 以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查 离心机 酶联免疫检测仪 天平 PCR仪等 为试管苗提供满足生长的适宜环境条件 2 温室 二 仪器和设备 一 无菌操作设备 烘箱 作用 干燥洗后的器皿高温干热灭菌测定培养物的干重时烘干培养材料 2 灭菌锅 类型 普通医用消毒锅大的高压灭菌锅作用 培养基 水和各种用具的消毒 医用手提式灭菌锅 不锈钢立式灭菌锅 3 超净工作台 陈列于操作室 接种室 内类型 垂直式和水平式作用 无菌操作 二 药品贮存和配制仪器设备 1 冰箱作用 低温保存材料 存放药品 培养基母液 激素 酶制剂 2 天平 陈列于制备室中作用 称取大量元素 微量元素 酶制剂 3 酸度计 陈列于制备室中作用 测定培养基及酶制剂的pH值 PHS 802中文台式酸度计 通用型或经济型酸度计 三 观察分析仪器设备 显微镜类型 倒置显微镜原生质体观察普通显微镜染色体和叶片气孔观察荧光显微镜细胞活力观察电子显微镜病毒检测 细胞器变化体视显微镜形态分化的实体观察 四 培养设备 1 空调作用 控制培养温度2 加湿器和去湿机控制培养室内湿度状况 3 定时器 控制光照时间4 培养架盛放培养物 5 摇床和旋转床进行液体培养时用以改善气体状况 小型臭氧发生器 不锈钢蒸馏水器 单蒸水 三 玻璃器皿及用具 一 玻璃器皿1 培养器皿培养用的 试管 三角瓶 培养皿等2 分注器类型 注射器式分注器 漏斗式分注器 量筒漏斗式分注器3 其他玻璃仪器烧杯 量筒 移液管 容量瓶 试剂瓶等 二 器械类 1 镊子类型 枪式镊子 接种 转移 尖头镊子 茎尖 2 剪刀类型 大剪刀 小剪刀 弯头剪刀3 解剖刀类型 固定式和活动式4 接种针用来转移细胞或愈伤组织5 细菌过滤器用来去除细菌 高温的影响 1 洗涤液的配制 二 实验基本操作 一 洗涤技术 A 新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质 可先用0 5 的去污剂洗刷 再用自来水洗净 然后浸泡在1 2 盐酸溶液中过夜 不可少于四小时 再用自来水冲洗 最后用无离子水冲洗两次 在100 120 烘箱内烘干备用 2 洗涤方法 先用自来水洗刷至无污物 再用合适的毛刷沾去污剂 粉 洗刷 或浸泡在0 5 的清洗剂中超声清洗 比色皿决不可超声 然后用自来水彻底洗净去污剂 用无离子水洗两次 烘干备用 计量仪器不可烘干 清洗后器皿内外不可挂有水珠 否则重洗 若重洗后仍挂有水珠 则需用洗液浸泡数小时后 或用去污粉擦洗 重新清洗 B 使用过的玻璃仪器的清洗 聚乙烯 聚丙烯等制成的塑料器皿 在生物化学实验中已用的越来越多 第一次使用塑料器皿时 可先用8mol L尿素 用浓盐酸调pH 1 清洗 接着依次用无离子水 1mol LKOH和无离子水清洗 然后用10 3mol LEDTA除去金属离子的污染 最后用无离子水彻底清洗 以后每次使用时 可只用0 5 的去污剂清洗 然后用自来水和无离子水洗净即可 C 塑料器皿的清洗 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤 新的可以用热洗衣粉水洗净 需要清洗时 一般用酒精擦洗 然后火焰干燥 E 除菌过滤器用清水冲洗后 用洗液冲洗 再用清水冲洗 最后用蒸馏水冲洗 晾干备用 D 金属用品洗涤 1 灭菌工作是极其重要的 首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴 有菌 凡是暴露在空气中的物体 至少其表面都是有菌的 如植物的表面 超净工作台的台面 未处理的工具和手等 无菌 高压高温处理 工具 器皿 培养基等 物理或化学处理 火烤后的物体 健康的动植物不与内外部表面接触的组织内部可能是无菌的 有时也有内生菌 但不会影响培养 也不会污染 二 灭菌技术 1 物理方法 干热 湿热 过滤 0 25微米 紫外灯 超声波等 2 化学方法 使用灭菌剂或抗菌素 如酒精 次氯酸钠 升汞 漂白粉 高锰酸钾 双氧水 福尔马林等 2 灭菌的方法 干热灭菌玻璃器皿 器械湿热灭菌培养基 蒸馏水 器械 棉塞等熏蒸灭菌接种室 培养室过滤灭菌液体培养基 蒸馏水药剂灭菌培养材料烧灼灭菌器械 瓶口 棉塞 包头纸辐射灭菌接种室 培养间 各种灭菌方法及其使用范围 适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌 操作方法 150 40min或120 120min 如果发现芽孢杆菌 160 90 120min 1 干热灭菌 适用于各种器皿 培养基 器皿 蒸馏水 棉塞 纸等 121 维持20 30min注意点 加足水 排尽气 气压降到0时 才能开盖 2 湿热灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理 但如果培养基中某些成分遇到高温分解 如某些生长调节剂GA3 玉米素等 就需要过滤灭菌 另外酶 血清等也需要过滤灭菌灭菌方法 将生长调节剂或酶配成一定浓度 用注射器注入微孔滤膜虑 滤膜孔径0 22 0 45微米 制培养基时 现将培养基高压灭菌 待降至50 左右时 加入适量的激素 然后分装 3 过滤灭菌 主要是利用紫外灯进行照射 适合实验室空气 操作台等 灭菌时间20 30min 注意 关灯后5min后再进入 超净工作台关灯后要打开风机 4 射线灭菌 用火焰灼烧达到灭菌目的 适用于接种器皿的灭菌 5 火焰灼烧灭菌 适用外植体 实验器皿 操作表面 皮肤等 几种常用消毒剂的效果比较 6 消毒剂 长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸 方法 甲醛 高锰酸钾熏蒸 甲醛的用量通常按每立方米空间2 6毫升计算 高锰酸钾的用量是甲醛的一半 室内准备妥当后 把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内 最好在碗或杯下面铺一张报纸 以利清洗 然后将甲醛也倒入碗或杯内 立即出屋关门 几秒钟后 甲醛溶液即沸腾挥发 高锰酸钾是一种氧化剂 当它与一部分甲醛作用时 由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体 7 熏蒸灭菌 甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行 熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作 甲醛对人的眼 鼻有强烈刺激作用 因此 可在使用前用氨进行中和 取与甲醛等量的氨水 倒在另一个烧杯里 迅速放入熏蒸室内 使甲醛和氨水发生中和反应 以消除甲醛味 减少对人体的刺激作用 使用氨水应在工作前2小时进行 对有材料的培养室 也可以采用乙二醇加热熏蒸 人为因素 工作人员本身 工作服 帽 口罩 酒精擦手 物品因素 器皿和用具 培养皿 洗 热压玻璃器皿 洗 干热 干热箱 或晾干接种用具 用CCL4布擦 湿布擦 泡75 95 酒精 烧 培养基 湿热 培养材料 外部细菌 用水冲洗 化学药剂处理内部细菌 茎尖培养加抗生素 青霉素 利福平 操作的空气 洗刷地板95 酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸 污染来源 三 无菌操作技术 1 实验器具和材料的准备2 用75 的酒精擦拭超净工作台 然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min 30min 注意 台面上的用品不要放置太多或重叠放置 以免降低灭菌效果 3 关紫外灯 打开风机 过5 10min进入缓冲间 以75 洗手和手臂 更换无菌服 帽子和口罩 进入接种室 注 没有特别情况 尽量不要下工作台 4 用70 75 的酒精拭擦台面并消毒双手 试验用具也应该用酒精消毒 点燃酒精灯 将金属器械在其火焰上灼烧 冷却待用 注意 所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行 金属器械不能过度灼烧 以防退火 移液管不能灼烧 培养瓶口 塑料材料 橡胶材料过火焰不能时间太长 5 取流水冲洗 至少30min 过的外植体 用一定的消毒剂浸泡消毒 用无菌水冲洗3 4次 放入无菌培养皿中 置于酒精灯火焰下方 用无菌的接种器械进行分离 切割或其他处理 6 打开培养瓶 瓶口在灯焰处旋转灼烧 用镊子将培养材料置于培养基上 灼烧镊子放回 灼烧瓶口 盖上瓶塞 7 用酒精擦洗工作台和手 进行下一轮操作 注意 1 进行培养时 动作要准确敏捷 但又不必太快 以防空气流动 增加污染机会 2 不能用手触及已消毒器皿 如已接触 要用火焰烧灼消毒或取备品更换 3 为拿取方便 工作台面上的用品要有合理的布局 原则上应是右手使用的东西放置在右侧 左手用品在左侧 酒精灯置于中央 4 工作由始至终要保持一定顺序性 组织或细胞在未做处理之前 勿过早暴露在空气中 同样 培养液在未用前 不要过早开瓶 用过之后如不再重复使用 应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会 5 吸取营养液 细胞悬液及其它各种用液时 均应分别使用吸管 不能混用 以防扩大污染或导致细胞交叉污染 6 工作中不能面向操作区讲话或咳嗽 以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染 7 手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方 瓶口最易污染 加液时如吸管尖碰到瓶口 则应将吸管丢掉 接种时在近火焰处打开瓶口 使瓶倾斜 以免空气中微生物落入瓶中 正确错误 整个接种操作应在近火焰处进行 且动作要迅速 正确错误 接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带来的污染 正确错误 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 正确错误 瓶盖朝上放 接种完毕后立即盖好瓶口 正确错误 接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生 种子和分生组织 培养时通常将其贴放在培养基表面 而不是插到培养基内部 以免供氧不足 正确错误 接种茎段 注意形态学下端插入培养基内 而形态学上端露于空气中 正确错误 第二节培养基及其配制 主要内容 一 培养基的成分二 培养基的配制三 常用培养基配方及其特点 一 培养基的成分 水无机盐炭源和能源维生素类氨基酸及有机附加物植物生长调节物质琼脂活性炭 一 无机营养 无机营养包括水和各种无机盐 它们提供了除碳源以外的几乎所有的营养元素 1 水是植物原生质的组成成分 也是一切代谢过程的介质和溶媒 为生命活动不可缺少 配制培养基时一般用离子交换水 蒸馏水 重蒸馏水 2 无机盐 无机盐包括大量元素和微量元素 大量元素是指碳 氢 氧 氮 磷 钾 硫 钙 氯 镁 氮通常是指硝态氮或氨态氮 但在培养基中多以KNO3或Ca NO3 2的硝态氮形式来满足培养物对氮素的需求 或将两种混合使用 有时也以硝态氮为主 补加 NH4 2SO4以满足酸性植物的需要 磷是植物的必须元素之一 参与植物生命活动中核酸 蛋白质合成 光合作用 呼吸作用 及能量的贮存 转化与释放等重要生理生化过程 因此在组织培养物中需大量的磷 钾是主要的阳离子 近年来在培养基中的用量呈逐渐提高的趋势 钙 钠 镁的用量较少 微量元素是指铁 硼 锰 锌 钴 钼 铜等 其需要量很少 一般多为10 5 10 7mol L 1 稍多则产生毒害 1 碳源 能源 植物组织培养中被培养的外植体 由于其光合作用的能力较低 需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源 一般是添加蔗糖 葡萄糖和果糖 其中以蔗糖为最常用 效果也最好 然而在体细胞组织培养中 葡萄糖 麦芽糖和山梨醇也有影响 在花药培养中 麦芽糖也有促进作用 糖类在培养基中除了作为碳源和能源以外 还具有维持培养基一定的渗透压的作用 大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1 5 但个别植物组织培养中蔗糖的浓度也可高达7 甚至15 如玉米 油菜等植物的花药培养 一般来说 蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3 1 3 2 即约有1 4 2 5的蔗糖用于保持培养基的渗透压 二 有机成分 2 维生素类 维生素类与植物体内各种酶的形成有关 维生素的种类很多 在植物组织培养中通常以B族维生素为主 使用浓度一般为0 1 1 0mg L 其中以盐酸硫胺素 B1 盐酸吡哆素 B6 维生素B12 烟酸 生物素和维生素C最为常用 在各种维生素中 Vit B1可能是必需的 其它可能只对外植体的生长起促进作用 肌醇本身不促进外植体的生长 但可能有助于活性物质发挥作用 从而促进外植体生长 胚状体及芽的形成 培养基中肌醇的用量为50 100mg L 3 氨基酸及有机添加物 在一些培养基中可加入一些氨基酸 如甘氨酸 Gly 丝氨酸 Ser 酪氨酸 Tyr 谷氨酰胺 Gln 天冬酰胺 Asn 等 它们是培养基中重要的有机氮源 水解酪蛋白 CH 和水解乳蛋白 LH 也是多种氨基酸的混合物 对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用 常用量为500mg L 水解酪蛋白 CH 和水解乳蛋白 LH 也是多种氨基酸的混合物 对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用 常用量为500mg L 在某些植物组织培养中还加入一些天然的有机物 例如椰子乳10 20 酵母提取物0 5 番茄汁5 10 香蕉泥100 200mg L 其作用是提供一些必要的微量营养成分 生理活性物质和生长激素等 如培养基中加入100 200mg L的香蕉泥 具有较大的pH缓冲作用 主要用于兰花的组织培养 对幼苗的发育有较大的促进作用 三 植物生长调节物质 生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质 其用量虽极少 但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用 其中以生长素类和细胞分裂素最为常用 1 生长素 它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成 胚状体的产生及试管苗的生根 更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生 生长素常用的是2 4 D 2 4 二氯苯氧乙酸 NAA 萘乙酸 IAA 吲哚乙酸 IBA 吲哚丁酸 它们作用的强弱顺序为2 4 D NAA IBA IAA 2 4 D常用于诱导愈伤组织 NAA IBA IAA常用于生根 使用浓度范围一般为0 1mg l 10 0mg l 2 细胞分裂素 它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化 延缓组织的衰老 增强蛋白质的合成 抑制顶端优势 促进芽的生长及显著改变其它的激素的作用 常用的细胞分裂素类有 激动素 KT 6 苄基腺嘌呤 6 BA 玉米素 ZT 2 异戊烯腺嘌呤 2 iP 吡效隆 4PU CPPU 和噻重氮苯基脲 TDZ 它们作用的强弱顺序为TDZ 4PU ZT 2 Ip 6 BA KT 但在组织培养中通常使用人工合成的 性能稳定的而价格适中的KT和6 BA 二者的最适浓度为1 10mg L 它们作用的强弱顺序为TDZ 4PU ZT 2 Ip 6 BA KT 常用浓度为1 10mg L 四 琼脂 琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物 它的主要作用是使培养基在常温下凝固 同时不参与代谢 所以在组织培养中一直被作为首选的培养基质而广泛应用 五 活性炭 活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力 减少一些有害物质的影响 例如可以防止酚类物质的污染而引起组织褐化死亡 在兰花组织培养中的效果更明显 另外 活性炭使培养基变黑 有利于某些植物生根 活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应 常用浓度为0 1 0 5 二 培养基的配制 准备工作母液的配制和保存培养基配制程序培养基配制程序 1 水和药品 用于配制培养基的水最好是用玻璃容器蒸馏过的蒸馏水或去离子水 化学药品应尽可能采用分析纯或化学纯级别的试剂 生长调节物质在应用前有时还需要进行重结晶或选用纯度更高的 蛋白质水解物最好是用酶水解的 药品的称量及定容都要准确 2 母液的配制和保存 配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液 配成培养基配方使用浓度的10倍100倍 甚至1000倍 在配制母液时为减少工作量可以把几种药品 如培养基中的大量元素或微量元素 配在同一母液中 但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序 以免发生沉淀 铁盐宜单独配制 对于植物生长调节物质 配制成母液时 通常用mg ml较为方便 一般宜配制成0 5mg ml的母液 这样的浓度既便于计算也可避免冷藏时形成的结晶 由于多数生长调节物质难溶于水 因此配法各不相同 IAA IBA和GA3可先用少量95 酒精溶解 再加水定容 摇匀后贮于试剂瓶中 贴上标签后存放在冰箱中 NAA可溶于热水或少量95 酒精中 再加水定容至一定体积 2 4 D不溶于水 可用少量1N的NaOH溶解后 再加水定容 KT和6 BA应先溶于少量1N的HCl中 再加水定容 玉米素先溶于少量95 的酒精中再加水定容至一定浓度 椰子汁的活性成分是耐热的 椰子汁从椰子中倒出后应立即煮沸过滤去除蛋白质 高压消毒后贮于 20 低温冰箱中备用 3 培养基配制程序 三 常用培养基及其特点 MS培养基是1962年Murashige和Skoog为培养烟草材料而设计的 特点是无机盐的浓度高 有加速愈伤组织生长的作用 能满足植物组织对矿质营养的要求 铵盐和硝酸盐含量高 比例也较为合适 也不需要添加更多的有机附加物 这是目前应用的最广泛的一种培养基 与MS较为接近的还有LS RM 等培养基 N6培养基是1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的 其KNO3和 NH4 2SO4高且不含钼 目前在国内已广泛用于小麦 水稻及其它植物的花粉和花药的培养和其它的组织培养 B5培养基它的主要特点是含有较低的铵盐 该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用 对有些植物如双子叶植物特别是木本植物更加适合 第三节外植体的选择与培养 一 外植体的选择 1 选择优良品种2 选择健壮植株3 选择最适时期4 选择适宜的大小0 5 1 0cm 二 外植体的灭菌 1 外植体灭菌的流程把采来的材料事先截剪 除去不用的部分将需要的部分仔细弄干净 用流水冲洗肥皂水浸洗自来水冲洗70 75 的酒精浸泡30s灭菌剂灭菌无菌水冲洗遍3 5遍接种 2 灭菌剂的种类 1 70 75 酒精比其他浓度的酒精杀菌效果强 组织穿透力也强 它对材料气泡内空气进行杀菌 可以湿润材料 有利于其他消毒剂的渗入 具湿润和杀菌的双重作用 酒精灭菌时间不宜过长 浸渍30s可达表面灭菌 因不能彻底杀菌 往往需用其他灭菌剂灭菌 2 氯化汞这是一种重金属化合物 有剧毒 对人 动物和植物的毒性非常大 常用浓度为1 处理时间5 10min 杀菌效果好 但残毒很大 外植体灭菌后 需用无菌水冲洗至少3 5次 3 次氯酸钠浓度可为2 10 消毒时间15 30min 杀菌效果比较好 很容易去除 对植物无害 4 漂白粉这是一种常用的低毒的消毒剂 是含有多种成分的复合化合物 一般含10 20 的次氯酸钙 使用浓度一般为5 10 或饱和溶液 取其上清液 处理10 30min 杀菌效果好 且不伤组织 容易洗净 5 次氯酸钙粉状 可以很好溶解于水 待澄清后取上清液用以消毒 常用浓度为9 10 消毒时间为5 30min 次氯酸钙进入植物组织内的速度低于次氯酸钠 由于它易潮解 只能存储有限时间 三 外植体的接种和培养 一 外植体的接种 无菌操作 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官 组织 细胞 转放到无菌培养基上的全部操作过程 1 无菌操作 1 接种4h前用甲醛熏蒸接种室 并打开其内紫外灯进行灭菌 2 在接种前20min 打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 3 接种员先洗净双手 在缓冲间换好专用实验服 并换穿托鞋等 4 上工作台后 用 70 酒精棉球擦拭工作台面 然后擦拭双手 特别是指甲处 5 先用酒精棉球擦拭接种工具 再将镊子和剪子从头至尾过火一遍 然后反复过火尖端处 对培养皿要过火烤干 6 接种时 接种员双手不能离开工作台 不能说话 走动和咳嗽等 7 接种完毕后要清理干净工作台 可用紫外灯灭菌30min 若连续接种 每5天要大强度灭菌一次 2 接种 1 将初步洗涤及切割的材料放入烧杯 带入超净台上 用消毒剂灭菌 再用无菌水冲洗 最后沥去水分 取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上 2 材料吸干后 一手拿镊子 一手拿剪子或解剖刀 对材料进行适当的切割 在接种过程中要经常灼烧接种器械 防止交叉污染 3 用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上 二 外植体的培养 1 光照通常对愈伤组织的诱导来说 暗培养比光培养更适合 但器官的分化需要光照 每日光照12 16h 光照度1000 5000lx如果培养材料要求在黑暗中生长 可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围 或置于暗室中培养 2 温度大多数植物在23 32 之间 培养室一般所用的温度是25 2 低于15 或高于35 对生长都不利 3 湿度培养容器内的湿度 培养室的湿度要求室内保持70 80 的相对湿度 4 氧气液体培养 振荡培养固体培养 采用通气性好的瓶盖或瓶塞 四 外植体的成苗途径 五 污染的原因及其预防措施 一 污染的原因污染 指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌 导致培养失败的现象 污染的原因 病原菌污染 细菌 真菌 污染的途径外植体 培养基 培养器皿带菌 操作人员未遵守操作规程等 二 污染的预防措施1 防止材料带菌的措施取材以春夏生长旺季 当年生的嫩梢为佳 应尽量选择晴天中午进行 取离体枝梢在洁净空气条件下抽芽 然后从新生组织中取材接种 2 外植体的灭菌根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法 对于材料内部带菌的组织 有时还需在培养基中加入适量抗生素 多次灭菌法 多种药液交替浸泡法 3 器皿与金属器械的灭菌4 布质制品及无菌操作室的灭菌5 操作人员严格按照无菌操作的程序进行接种 六 外植体的褐变及其防止措施 褐变是指外植体在培养过程中 体内的多酚氧化酶被激活 使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质 这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色 而且还会抑制其他酶的活性 严重影响外植体的脱分化和器官分化 最后变褐而死亡的现象 一 褐变的原因 植物品种多酚氧化酶活性上的差异 生理状态老熟的组织褐变程度较幼嫩的组织严重 培养基成分无机盐和细胞分裂素浓度过高 培养条件不当如果光照过强 温度过高 培养时间过长 二 褐变的防止措施1 选择合适的外植体一般来说 最好选择生长处于旺盛的外植体 这样可以使褐变现象明显减轻 2 合适的培养条件无机盐成分 植物生长调节物质水平 适宜温度 及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象 3 使用抗氧化剂半胱氨酸 抗坏血酸 4 连续转移对容易褐变的材料可间隔12 24h的培养后 再转移到新的培养基上 连续处理7 l0d 5 加活性炭0 1 0 5 的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显 七 培养物的玻璃化现象及其预防措施 一 玻璃化现象及其产生原因当植物材料不断地进行离体繁殖时 有些培养物的嫩茎 叶片往往会呈水晶透明或半透明状 这种现象通常称为玻璃化 它的出现会使试管苗生长缓慢 繁殖系数有所下降 玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化 试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状 1 激素浓度激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高 或细胞分裂素与生长素比例提高 易导致玻璃化苗的产生 培养基中一次性加入了过多的细胞分裂素 细胞分裂素与生长素比例失调 在多次继代培养时愈伤组织和试管苗体内积累过量的细胞分裂素 2 琼脂浓度培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加 随着琼脂浓度的增加 玻璃化苗比例减少 3 温度适宜的温度可以使试管苗生长良好 当温度低时 容易形成玻璃化苗 温度越低 玻璃化苗比例越高 温度高时玻璃化苗减少 且发生的时间较晚 4 光照时间不同的植物对光照的要求不同 满足植物的光照时间 试管苗才能生长正常 大多数植物在每天10 12h光照下都能生长良好 光照时数大于每天15h时 玻璃化苗的比例明显增加 5 通风条件试管苗生长期间 要求有足够的气