基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究

导 师: 王红静教授 研究生: 张晓燕,PTEN基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究,研究背景,子宫内膜异位症（endometriosis，EMs），是妇科常见疾病之一，组织学上虽然是良性的，但却有增生、浸润、转移及复发等恶性生物学行为。药物及手术治疗复发率均高。究其原因主要是EMs的病因及发病机制尚未完全明了。,自1921年Sampson首先提出子宫内膜种植学说以来，在EMs众多的病因及发病机制中，种植学说虽被大多数学者所接受，但它无法解释盆腔外EMs的发生，也无法解释多数育龄妇女存在经血逆流，但仅少数（10%-15%）发病。,越来越多的研究表明EMs与高血压、糖尿病、精神分裂症等一大类疾病一样被认为受多基因遗传及多因素的影响。现今的研究表明，子宫内膜碎片必须通过粘附、侵袭及血管形成，方可以生存、生长。这一过程的完成是由在位内膜的不同生物学特征，即基因差异决定的。,因此，当前的研究重点在于寻 找和鉴定EMs相关的遗传基因 。,PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是1997年发现的一种新的抑癌基因，是继P53基因之后发现的在人类肿瘤中突变率最高的基因。也是子宫内膜腺癌中发现的突变率最高的基因，被认为是子宫内膜的“看家基因” 。研究发现PTEN与子宫内膜相关性疾病如EMs的发病密切相关。,PTEN通过调控细胞周期，抑制细胞分化,抑制细胞粘附和迁移，诱导凋亡等参与肿瘤的发生、发展。 内异症患者在位内膜可能因抑癌基因PTEN失活而表现出与正常内膜不同的生物学特性,如细胞粘附增强，凋亡减少，血管形成能力增强，从而容易在异位部位存活并生长，继而引起相应的症状和体征。,PTEN基因突变、杂合性缺失及多态性 改变与多种肿瘤如食道癌、膀胱癌等的发病密切相关。其基因突变、杂合性缺失与EMS的相关性研究报道也较多，而PTEN多态性与EMS的相关性研究才处于探索阶段。,PTEN-9C/G (以下简读为-9C/G）单核苷酸多态性(SNP)及 PTENS4-/+（以下简读为IVS4-/+)为PTEN基因最常见的两个多态性位点，此两个位点多态性的改变与食道癌、鼻咽癌的相关性研究已见报道。国内外目前尚无此两个位点多态性的改变与EMs的相关性研究报道。,PTEN-9C/G SNP位于PTEN翻译起始点上游的第9位核苷酸处，CG的替换使得G周期性地出现 ，它非常接近翻译时使核糖体停留在阅读框架内的交感序列，因此CG的替换可能影响PTEN的表达。 PTENS4-/+为第4内含子的一个插入性多态，可能通过不同剪切及通过与其它位点连锁来影响其基因表达。,本研究首次采用聚合酶链反应-限制性 片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术对PTEN -9C/G及IVS4-/+基因进行分型，旨在探讨此两个位点的多态性与EMs 的关系。,材 料 与 方 法,主要实验仪器及设备 名称 型号 生产厂家 洁净工作台 上海力申科学仪器有限公司 高速离心机 TG19A.WS 美国BECKMAN公司 低温离心机 TGL-16H 珠海黑马医学仪器有限公司 普通冰箱 BCD-130H 青岛海尔股份有限公司 电子天平 PB3002-S 瑞士Mettler公司 PCR扩增仪 PTC一200 美国MJReseareh公司 Eppendorf移液器 0.1-1000ul 德国Eppendorf公司 紫外扫描仪 GelDoe1000 美国BioRad公司 稳压稳流电泳仪 DYY-III3 北京市六一仪器厂 电泳槽 Sub一CellModel96 美国BioRad公司 凝胶成像分析仪 AlphaImagerTM2200 美国Alpha Innotech公司,主要实验试剂试剂名称 生产厂商全血基因组DNA提取试剂盒 北京博大泰克公司引物合成 上海生工DNA胶回收试剂盒 北京博大泰克公司PCR纯化试剂盒 上海生工蛋白酶K (Germany)Merck公司限制性内切酶AflII New England Biolabs限制性内切酶DraII New England Biolabs 100bp DNA ladder 华美生物工程公司,研究对象,EMs组： 86人，无肿瘤性及遗传性疾病病史，术后病检证实为子宫内膜异位症的患者。 对照组： 64人，同期因输卵管阻塞继发不孕、 宫外孕及子宫脱垂等手术，术后病检排除EMs，且无肿瘤性及遗传性疾病病史的患者 。,标本采集,采集每位研究个体的外周血3ml，EDTA抗凝，置4冰箱保存，并于采血后1周内提取符合条件的研究对象的外周血白细胞DNA。,DNA的提取,用微量全血基因组DNA提取试剂盒，提取全基因组DNA。,100l裂解液20lRNaseA/蛋白酶K ，55温浴30min,12000 rpm离心1min，弃尽上清 ,100lTE,10000 rpm离心1.5min,弃上清,300l 红细胞裂解液,300l 抗凝全血等体积红细胞裂解液,加入10l3MnaAC、1250l结合缓冲液加入600l漂洗液,加入30l ddH2O洗脱，-20保存24小时将所提DNA进行Agarose电泳泳,PTEN的基因分型,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行基因分型。,PTEN IVS4-/+引物:上游引物：5-GGG GGT GAT AAC AGT ATC TA-3 下游引物：5-CTT TAT GCA ATA CTT TTT CCT A-3,PCR反应体系,72延伸1min,58退火45s,94变性30s,94预变性5min,35个循环后，72继续延伸5min,PCR反应条件,扩增产物为403bp,PTEN IVS4-/+ PCR产物酶切电泳后判断基因型,纯化PCR产物10l经限制性内切酶AflII (2l) 于37酶切过夜,行2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪下观察判断基因型,-/-纯合型显示403bp一条电泳带， +/+纯合型显示335bp和73bp两条电泳带，-/+杂合型显示403bp、335bp和73bp三条电泳带,PTEN -9C/G 引物为: 上游引物：5-GCA GCC GTT CGG AGG ATT-3 下游引物：5-GCCGCAGAA,ATG GAT ACA GG-3,PTEN -9C/G PCR反应体系及反应条件同扩增PTEN IVS4-/+ 。,PTEN -9C/G PCR产物 酶切电泳后判断基因型,纯化PCR产物10l经限制性内切酶DraII (10l) 于37酶切过夜,行2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪下观察判断基因型,C/C纯合型显示371bp的一条电泳带 G/G纯合型显示266bp和105bp两条电泳带C/G杂合型显示371bp、266bp和105bp三条电泳带,统计学分析,数据用SPSS13.0软件进行统计学分析，P0.05认为有统计学意义。 比较基因型频率的观察值与预期值，并进行卡方检验行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组与对照组的基因型及等位基因分布采用卡方检验，用OR值及其95%可信区间，分析PTEN -9C/G、IVS4-/+ 多态性与EMs的关系。,结 果,一. 研究对象的一般特征： 1. 平均年龄 EMS组：35.47.69岁 对照组： 35.612.24岁 两组比较，平均年龄差异无统计学意义(t=0.122,P0.05),2. 家族史 EMs阳性家族史， EMs组为24.4% ，对照 组仅10.9% ，两者相比有统计学意义 (2=4.392,P0.05) 。 EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险， OR值2.6308（95%CI=0.8117-5.1771）。,二.PTEN基因S4 - /+扩增产物Afl酶切电泳结果 PTEN S4 - /-纯合型产生403bp 一条电泳带 PTEN S4+ /+纯合型产生335bp和 73bp 两条电泳带 PTEN S4 - /+杂合型产生403b、335bp、 73bp三条电泳带,Fig.1 Genotype pattern for PTEN IVS4(-/+)polymorphism analyzed by PCR-AflII digestion. Lane 1:+/+homozygous genotype,Lane 2:-/-homozygous genotype, Lane 3，4，5,and 6:-/+heterozygous genotype,三. PTEN基因-9C/G 扩增产物DraII酶切电泳结果:C/C纯合型产生371bp的一条电泳带G/G纯合型产生266bp和105bp两条电泳带C/G杂合型产生371bp、266bp和105bp三条电泳带,Fig.2 Genotype pattern for PTEN -9C/G polymorphism analyzed by PCR-DraII digestion. Lane 1, 4 and 6: C/G heterozygous genotype, Lane 2 and 3: G/G homozygous genotype,Lane 5: C/C homozygous genotype.,四.PTEN IVS4-/+多态位点的基因型分布,Table 2. PTEN -9C/G Genotype Hardy-Weinbery examination in two Groups,五.PTEN-9C/G多态位点的基因型分布,六.PTEN-9C/G 基因型分布与EMs的发病风险,七.PTEN IVS4-/+基因型分布与EMs 的发病风险,八.PTEN单体型与EMs的发病风险,讨 论,一.研究对象的一般特征 1. 平均年龄 EMS组：35.47.69岁 对照组：35.612.24 两组比较，平均年龄差异无统计学意义(t=0.122,P0.05) 说明病例组与对照组年龄分布具有可比性。,2. 家族史 阳性家族史,EMs组为24.4% ，对照组为10.9%，两者相比有统计学意义(2=4.392,P0.05) 。 OR值2.6308（95%CI=0.8117-5.1771),说明EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险 。 进一步证实了EMs的家族遗传倾向。,二.分析 PTEN基因-9C/G SNP及IVS4-/+基因型及等位基因频率分布情况 本研究中PTEN-9C/G SNP的基因型分布在EMs病例组及对照组中均符合Hardy-Weinbery平衡，表明研究对象具有群体代表性。,PTENIVS4-/+基因型分布在EMs病例组及对照组中均不符合Hardy-Weinbery平衡，可能的原因有：突变、选择、随机遗传漂变、迁移及遗传异质性。,本研究人群中，PTENIVS4-/+杂合型(73.5%)明显高于另两种类型（-/-10.9%，+/+15.6%），这是Hardy-Weinbery平衡计算中影响其遗传平衡的主要因素，可能跟遗传选择中的杂合子优势有关，具体原因有待进一步研究。,本研究对照组中-9C/G SNP的基因型分布（C/C 90.6%、C/G9.4%、 G/G 0.0%）与日本人群(C/C 95.0%,C/G 5.0%,G/G 0%)相似；而IVS4-/+多态的基因型分布（-/-10.9%、-/+73.5%、+/+15.6%）与美国人群(-/-43.1%,-/+45.7%,+/+11.2%)有显著差别。,在不同种族不同地区人群中PTEN基因的多态性可能分布相似或存在差异。,三.分析PTEN-9C/G基因型分布与EMS发病风险 合并PTEN-9C/G及G/G基因型与C/C基因型相比，携带G等位基因(C/G+G/G)不改变EMs的发病风险，与张小爱及 Ge 等分别在PTEN-9C/G多态性与鼻咽癌 及食道癌中的研究结果一样。,位于PTEN非编码区的-9CG多态性改变可能不改变抑癌基因PTEN的功能，不增加EMs的发病风险。,四.分析PTENIVS4-/+基因型分布与EMs的发病风险 在合并PTEN IVS4基因-/+和-/-后与+/+相比，病例组与对照组差异有统计学意义(P0.05)。,PTENS4基因多态性中，突变型(+/+)可能降低EMs的发病风险。这与S4+/+基因型降低食管癌的发病风险的报道一致，但与IVS4+/+基因型可增加较年轻者患乳腺癌的风险的报道不同。,在不同类型肿瘤中, PTEN S4多态性发挥不同的作用, 同时也存在不同人群中这一多态存在着对肿瘤易感性的差异的可能性。因此有必要在某一确定的人群中进行不同类型疾病的研究, 来评价PTEN S4多态性的作用。,五.分析PTEN单体型与EMs的发病风险 在PTEN-9C/G和IVS4-/+ 构成的单体中：-9C/IVS4-为EMs病例组中最常见 -9C/IVS4+为对照组中最常见,与对照组中最常见的单体型-9C/IVS4+相比 ： -9C/IVS4-、-9G/IVS4+、-9G/IVS4- 三种单体型在EMs组及对照组中的分布无统计学差异；也均不增加EMs的发病风险。这与Ge等的研究结论（-9C/IVS4-单体型增加食管癌的发病风险)结果不同。,PTEN-9C/G和IVS4-/+这两个多态位点构成的单体型中