《珍稀药用真菌桑黄》.doc

珍稀药用真菌桑黄前 言 桑黄是一类具有重要药用价值的大型真菌，目前被国际公认为抗肿瘤效果最好的真菌之一。自1968年13本国立癌症中心的Ikekawa博士与东京大学柴田实验室合作，以桑黄水提取物进行细胞试验，结果发现其对肿瘤细胞增殖抑制率高达967，而对正常细胞没有毒性以来，人们对桑黄的研究逐渐兴起。其中13本和韩国对其研究最多，我国从20世纪末也开始了桑黄的研究工作。随着人们对桑黄药用价值的不断研究和报道，使其越来越受到世人的认同和青睐。桑黄产品的种类在市场上不断涌现，价格也是不断飙升。l千克桑黄的价格达到了3000元人民币，而且还有不断上涨的趋势。本书主要对桑黄进行了较为详尽的介绍，包括桑黄的种属，桑黄的药用价值，桑黄的人工栽培技术，桑黄的液体发酵技术，以及桑黄的有效成分和桑黄子实体、菌丝体有效成分的提取方法等，旨在让更多地人们了解桑黄，更好地发展桑黄产业，使得桑黄能够早日普遍应用于人类的医疗保健事业。第一章 概 述第一节 桑黄的基本概述 桑黄(Phellinus igniarius)是大自然中多年生的珍稀药用真菌之一，为担子菌亚门(Basidiomyctina)，层菌纲(hymenomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，多层孔菌科(Hymenochaetacae)，针层孔菌属(phellinus)。一、桑黄的介绍桑黄是一类具有重要药用价值的十分珍贵的大型真菌。其实，桑黄最早收载于我国李时珍本草纲目中。桑黄由于通常生长于桑属植物上，子实体为黄褐色而得名。药性论中称桑臣、桑耳，酉阳杂俎中称胡孙眼，篡要奇方中又称桑黄菇。桑黄子实体中等至较大，马蹄形至扁半球形，木质，硬。主要生于柳、杨、桑、花椒、山楂等阔叶树的树桩及树干上，或倒木上，多年生。国外主要分布在日本、韩国、朝鲜、俄罗斯等地。国内集中分布在黑龙江省东部、西北地区陕西与甘肃交界的“子午岭”自然保护区，东北的长白山林区、西南各省区亦出产少量的桑树生“桑黄”。产量极为有限，有“森林黄金”之美称。本草纲目记载桑黄能治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、经闭等症。其子实体入药，味微苦，能利五脏、软坚、排毒，止血、活血，和胃止泻，民间用以治疗淋病、崩漏带下、疮窟积聚、癖软、脾虚泄泻。日本原色日本菌类图鉴则记载桑黄可治偏瘫一类中风病及腹痛、淋病；神农本草经将桑黄描述为“久服轻身不老延年”；还有解毒、提高消化系统机能的作用；民间使用则认为桑黄可以提高肝脏机能，对肝硬化有效。桑黄也因其良好的疗效而被誉为“菌中极品”。 二、桑黄的名称 目前，关于桑黄种质，也就是说到底什么是桑黄，似乎在学术界还是没有定论，说法也没有统一，出现了名称混乱和误用物种等不规范现象。但所述桑黄均属于针层孔菌属(Phellinus spp)，这点是肯定的。针层孔菌属至今为止已发现251种左右，在中国发现62种。据不完全统计，在文献中作为桑黄使用的学名出现7个，在文献中和已经作为产品提供的鉴定标本中当作桑黄使用的物种有l2个。其中主要的有火木层孔菌(Phellinus igniarius)，裂蹄木层孔菌(Phellinus Linteus)，鲍氏层孔菌(Phellinus baumii)等。随着对桑黄的研究，最近又有学者提出，将尤地针层孔(Phellinus yucatanensis)作为真正的桑黄最为恰当，简称尤地桑黄，或称桑树桑黄。由于该属很多种子窦体都具有褐色蹄形的共同点，因此宏观上很多种具有相似之处，关于桑黄种的命名还有待于进一步研究考证。 第二节 桑黄的研究现状自1968年日本国立癌症中心的Ikekawa博士与东京大学柴田实验室合作，以桑黄水提取物进行细胞试验，结果发现其对肿瘤细胞增殖抑制率高达967，而对正常细胞没有毒性以来，人们对桑黄的研究逐渐兴起。现代研究发现桑黄含有多糖、落叶松覃酸、脂肪酸、幽醇类物质、三萜类、芳香酸、氨基酸、酶和黄酮等多种活性成分以及铁、锌、钙、镁等十多种微量元素。这些物质分别对心血管、肝脏、神经系统、肾脏、性器官等人体器官疾病具有预防治疗作用，具有极高的药用价值。实验表明桑黄具有抗癌、抗肝纤维化、抗脂质过氧化、增强免疫力、抗血管生成、降血糖、抗肺炎、预防和治疗关节炎等功效。但是，桑黄由于受到生理特殊性和复杂性的制约，以及对外部生长环境的较高要求，使得其在自然界中形成子实体比较困难，特别是形成可用子实体更是需要多年。加之，近几年随着人们对野生桑黄的大量采集，天然的桑黄资源已经非常稀少。所以，怎么去解决这个问题是我们研究的主要方向。现在，我们可以通过两种现代科技手段解决这个问题，第一就是利用人工栽培技术大量的获得桑黄子实体，第二就是利用液体深层发酵技术大量的获得有效成分含量类似于野生桑黄子实体的菌丝体。这样我们就可以尽快的进行桑黄工业化规模生产，使桑黄能够早日普遍应用于人类的医疗保健事业。桑黄的人工栽培困难，培养条件苛刻，且生长周期长达34年。但是桑黄菌虽是兼性寄生菌，但它以腐生为主，因此对该菌进行人工培养理论上是可行的。日本、韩国已成功开发了桑黄栽培产业，并具有相当规模，取得了巨大的经济效益。我国人工栽培桑黄技术刚刚起步，也获得了阶段性的成功。液体深层发酵技术属于现代生物技术之一，采用液体发酵培养所获得的菌丝体，其各种活性成分均类似于子实体，并具有生产周期短，效率高，成本低等优点，现已普遍应用于食药用菌的相关行业。利用此项技术可以解决桑黄资源缺少的难题，对桑黄的开发利用具有重要作用。目前，韩国、日本都已有利用液体深层发酵技术成功培养桑黄菌丝体的报道。我国虽然近几年才刚刚起步，但有关桑黄菌液体发酵方面的研究报道也逐渐增多。多数处于实验室研究阶段，只有敖宗华申报专利“大规模液体深层发酵生产桑黄水提取物及多糖的方法”(专利号：z12004100138696)，以桑黄真菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，发酵罐体积达10005000升，最终获得桑黄水提取物及桑黄多糖。 第三节 桑黄的应用前景 随着人们对桑黄药用价值的不断研究和报道，使其越来越受到世人的认同和青睐。目前国外，特别是日本和韩国对其进行了广泛深入的研究，由于其抗癌效果显著，已成为国际领域研究的热点，是一种极具有开发价值的珍贵药用真菌。同时桑黄几乎无毒副作用，也是开发保健食品的重要原料。因此说，桑黄具有广阔的市场开发前景。据了解，桑黄提取物干粉在韩国市场的售价高达每克2 300多美元。日本一家专门从事生药加工的医药企业“津村株式会社”将人工培植的桑黄子实体加工成“破壁细胞超微粉末”。由津村生产的“桑黄”超微粉末胶囊每瓶(288粒)售价高达3万日元。据统计，仅韩国、日本两国市场2002年各种桑黄制剂的销售额合计已逾100亿日元。美国在本世纪初开始从日本进口桑黄制剂作为膳食补充剂在本土销售。我国出售的产品以桑黄子实体为主，价格比较混乱，从每公斤几百元到几千元不等，其主要原因还是人们对桑黄的认识不足，真正的桑黄子实体的价格目前在3 000元左右，还有不断上升的趋势。我国现有真菌类功能保健食品种类繁多，品种多样，呈现出欣欣向荣的景象。这些真菌类保健品主要有以下5个系列：1营养口服液类。它是利用功能作用比较明确的真菌类研制成口服液，很受消费者欢迎，市场潜力大。如猴头菇口服液、灵芝口服液、脑心舒口服液(蜜环菌)、得宝营养液(羊肚菌)、东方圣草液(蛹虫草)、金菇露(金针菇)等。2保健饮料。它是利用真菌类保健功能和特有风味，研制而成的饮料型产品。如神农可乐(茯苓饮料)、猴头露、竹荪露、中国香菇可乐饮料等。3保健茶类。它是以真菌为主，以茶叶作为基质，经加工而成的袋泡茶或速溶茶类。如灵芝乌龙茶、福寿虫草茶、茂灵保健茶、速溶天然银耳等。4保健滋补酒类。它是采用发酵工艺或勾兑技术制成的产品。如中华灵芝神酒、香菇特酿酒、虫草枸杞保元酒、松茸酒、竹荪系列保健酒等。5保健胶囊类。它是把从菌类子实体或菌丝体发酵物中提取精制成的精粉或菌粉装入胶囊内而制成的产品。如中华灵芝宝、中草堂灵芝胶囊等。吉林省延吉市凭借独有的地域优势，现已开发出复合桑黄口服液，主要销往日本及韩国，在当地也有一定的消费市场。随着我国经济的不断发展，人们生活水平不断提高，对保健食品的需求将有较大幅度的增长，菌类保健品的发展将占有突出的地位，桑黄凭借它“菌中极品”的美誉，在第三代保健食品的发展中必将脱颖而出。国外一位生物化学家预言：“在生物化学领域，轰轰烈烈的蛋白质时代即将成为过去，代之而起的将是一个多糖的时代。”菌类多糖开发将成为保健食品开发的一个重要方向。桑黄多糖突出的抗癌功效为其未来的开发前景提供了依据，我们有理由相信，桑黄即将迎来他的辉煌时代。第二章桑黄的生物学特性 第一节 桑黄的生物学特征目前，关于桑黄的名称比较混乱，误用物种的现象时有发生。在文献中和已经作为产品提供的鉴定标本中被当作桑黄使用的物种就有很多。但所述桑黄均属于针层孔菌属(phellinus spp)，这点是肯定的。针层孔菌属至今为止已发现251种左右，在中国发现62种。该属很多种子实体都具有褐色蹄形的共同点，因此宏观上很多种具有相似之处。下面介绍三种当前研究和开发中常被称为桑黄的针层孔菌：火木层孔菌(phellinus igniarius)，裂蹄木层孔菌(Phellinus Linteus)和鲍氏层孔菌(Phellinus baumii)。由于三者均属于针层孔菌属(PheUinus spp)，在宏观和微观上是没有太大差别的。但是，由于来自不同种的基原，它们在宏观和微观形态上也具有各自的特征。下面对三者的子实体及生长树种和生长地、菌落形态、菌丝体形态以及孢子的结构进行比较和总结。 一、子实体 (一)相同点 火木层孔菌(Phellinus igniarius)，裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)，鲍氏层孔菌(phellinus baumii)子实体均为多年生，中等至较大。马蹄形至扁半球形，无柄，木质化，硬而木质化。初期有细行，颜色黄褐色或咖啡色，以后光滑，变暗灰黑或黑色，老熟后龟裂，无皮壳，有同心环棱，管孔多层，与菌肉同色，刚毛基部膨大，顶端渐尖。子实层中通常有大量的锥形刚毛存在。 (二)不同点 1火木层孔菌(Phellinus igniarius)，别名：针层孔菌、桑黄。子实体中等至较大。马蹄形至扁半球形，木质，硬。菌盖宽312厘米，初期有细行，浅褐色，以后光滑，变暗灰黑或黑色，老时龟裂，无皮壳，有同心环棱，边缘钝圆，浅咖啡色，下侧无子实层，菌肉深咖啡色，硬木质，管孔多层，与菌肉同色，老的菌管中充满白色菌丝，管孔面锈褐色，圆形，每毫米约45个。孢子近球形，光滑，无色(456)微米(45)微米，刚毛基部膨大，顶端渐尖。生于柳、桦、杨、花楸、山楂等阔叶树的树桩、树干上或倒木上，多年生。分布全国许多省区。 2裂蹄木层孔菌(Phellinus Linteus)，别名：桑黄、裂蹄针层孔菌、针层孔菌。子实体中等至较大。菌盖半圆形或马蹄形，深烟色至黑色，有同心纹和环棱，初期续的不规则膨大的表皮细胞，念珠状，薄壁，偶尔呈直角分支，内含物丰富，直径5070微米；基内生菌丝像生长新区的菌丝；无刚毛、无厚垣孢子和晶体。 (二)不同点其中鲍氏层孔菌(Phellinus baumii)的骨架菌丝平行于菌管排列是其与其他种区分的特征之一。鲍氏层孔菌(phellinus baumii)的担孢子椭圆形，大小(334.5)微米(2.43.5)微米；裂蹄木层孔菌(Phellinus Linteus)的担孢子近球形，大小为(4355)微米(3948)微米，明显比前者大，是两者的本质区别；火木层孔菌(Phellinus igniarius)有少量厚垣孢子，卵圆形或椭圆形，厚壁，大小为(8591)微米(100117)微米，大量粉孢子，菱形，大小为(2530)微米X(50130)微米。鲍氏层孔菌(Phellinus baumii)子实层中通常有大量的锥形刚毛存在，黑褐色，厚壁，大小为(1424)微米(59)微米。裂蹄木层孔菌(Phellinus Linteus)厚壁菌丝及基内生菌丝中含呈八面体形的晶体，刚毛(1335)微米X(59)微米。火木层孔菌(Phellinus igniarius)有大量表皮细胞，透明，圆形或不规则圆形，(6514.5)微米(6514.5)微米，刚毛顶尖锐，基部膨大，(1025)m X(57)微米。 第二节 桑黄的指纹图谱介绍基于目前桑黄名称比较混乱的情况，桑黄种属的鉴别工作就显的非常重要，利用传统的性状鉴别法和经典的组织显微鉴别法具有一定的实用价值，但也存在一定的主观性和局限性。当前中药的品种鉴别和品质的评价体系中，现代新设备、新技术的应用，构建中药及其制剂指纹图谱已成为中药鉴定学领域主要的研究方向。以中药的化学成分为指标，用化学的研究方法与传统的形态学和组织学方法相结合对其进行品种鉴别和品质评价研究，则更能反映其内在的品质。因此，我们利用多种现代分析测试技术及分子生物学技术建立桑黄化学和生物学指纹图谱具有重要理论价值和现实意义。下面介绍几种构建指纹图谱的方法： 一、化学指纹图谱薄层色谱(TLC)指纹图谱；高效液相色谱(HPLC)指纹图谱；气相色谱(GC)指纹图谱；高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱；紫外光谱(UV)指纹图谱；红外光谱(IR)指纹图谱；质谱(MS)指纹图谱；X-射线衍射(XRD)指纹图谱。 二、生物指纹图谱DNA指纹图谱；同工酶电泳(Isozyme electroph0resis)指纹图谱。除了以上构建指纹图谱的方法外，还有电化学法、核磁共振法、扫描电镜技术、化学振荡技术等。总之，通过桑黄指纹图谱的构建和解析，不仅可以对桑黄进行品种鉴别和产地鉴定，用于桑黄和其他相近中药材的区别，还可以为将来桑黄产品质量控制提供方法学研究基础，有益于研究数据的积累。解决了目前桑黄名称混乱的问题，为桑黄的开发利用奠定了基础，同时为今后桑黄产业标准化生产提供了保障。第三章桑黄的有效成分 桑黄的主要活性成分是多糖(polysaccharide)，此外，桑黄还含有黄酮类、三萜类、酶类物质及微量元素等。目前发现的有落叶松蕈酸、C22氨基酸、C27氨基酸、柚皮素(4-5，7-三羟基二氢黄酮)、樱花亭(4，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮)、二氯莰非素(4，5-三羟基二氢黄酮醇)、7-甲氧基二氧莰非素(4，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮醇)、北美圣草素(345，7-四羟基二氢黄酮醇)、5，7，4 -三羟基-6-邻羟苄基二氢黄酮、5，7，4-三羟基-8-邻羟苄基二氢黄酮、香豆素(苯并吡喃-2-酮)及莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基苯并毗喃-2-酮)、琥珀酸、p-羟苯肼乙酸、对羟基苯甲醛、2，5-二羟甲基呋喃、2-二羟甲基-4，3，3钝化酶、5-甲氧基甲基呋喃、N-乙酰酪胺、二丁基弃基甲苯、棕榈酸、9，12-十八碳二烯酸甲醋、二十碳烷及二十六碳烷、麦角甾醇、黑色素、酚类色素、草酸、三萜酸、芳香酸、木糖氧化酶、过氧化氢酶、尿酶脲酶、酯酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶、纤维素酶等以及铁、锌、钙、镁等十多种微量元素。以下我们分别介绍桑黄的各个有效成分。第一节 多 糖 一、真菌多糖 提起桑黄多糖，我们必须要先介绍一下真菌多糖。近20年来，国内外从高等担子菌中提取到200余种有生物活性的多糖物质，我国发现有重要经济和药用价值的真菌。多糖有近30种，其中化学结构较清楚的有l5种。真菌多糖是真菌药物的主要活性成分之一。国际上，真菌多糖被称为“生物应答效应物”(Biological Respone Modifier)简称BRM。它是一种能够增强人体免疫机能的生物活性物质。真菌多糖除具有抗肿瘤作用，免疫调节作用，降血压、血脂，抗血栓作用，抗突变作用，健胃保肝作用以外，还具有抗氧化、抗辐射、抗溃疡、抗衰老、抗病毒、降血糖等功能。国内外对真菌多糖主要开发其药用价值，真菌多糖的研究已成为当今新药发展的方向之一。真菌多糖的化学结构是其生物活性的基础。真菌多糖一般具有较高抑瘤活性，与空间结构具有重要关联，所有影响空间结构的因素如侧链、分子量等都会影响抑瘤活性。真菌多糖的分子结构是由三股单糖链构成的一种无序形的螺旋状构形物，螺旋层之间主要以氢键固定定位。真菌多糖的功能活性与其三维空间的立体构型也有密切关系。此外真菌多糖的取代基、溶解度、黏度、给药剂量、给药途径等都会影响其功能活性。 二、桑黄多糖桑黄含有结构极其复杂的多糖物质。不同的学者从桑黄中发现了多种不同的抗癌多糖，其中以p-1，3-葡聚糖在C-6有葡萄糖分支的抗癌效果最好。有学者通过DEAF纤维素阴离子层析从桑黄子实体粗多糖中分离得到一种酸性蛋白多糖，经Sepharose CL-48凝胶过滤后测得该多糖分子量约为150 000。该蛋白多糖由722多糖和223蛋白质组成，其中多糖部分主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、树胶醛糖和木糖构成，蛋白质部分包含了大量的天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。红外光谱及IH和13C核磁共振显示，该多糖同时存在d-糖苷键和p-糖苷键，是以p-(1-,3)-D-葡萄糖为主链，p-(1“)-D-葡萄糖为侧链的蛋白杂多糖。另外有人对桑黄菌丝体进行了研究，通过化学分析和HPLC分析，发现所有组分都是杂聚糖蛋白复合物，分子质量从9000到15000不等。糖分析表明为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖为主要成分。糖醛酸和氨基糖在组分中也被检测到。还有一些学者从桑黄中分离得到甘露聚糖，主链是l6甘露糖，侧链为l3连接的葡萄糖。 三、真菌多糖的应用真菌是多糖类物质丰富的来源，已有多种真菌多糖正式批准生产并应用于临床。香菇多糖、茯苓多糖、裂褶菌多糖、云芝多糖、冬虫夏草多糖、银耳多糖和黑木耳多糖等。随着人们对桑黄多糖结构和功能关系的不断研究发现，桑黄多糖具有多种多样的生物活性。专家预测，它将会引发生物学的新领域，导致医学上的高速发展和工农业上新的应用。 第二节 黄 酮 一、黄酮类化合物的分布及来源黄酮类化合物即类黄酮，是一类天然存在于植物当中。的多酚类化合物，广泛存在于植物的叶片、木质、树皮和果实中，使植物叶、花、果实呈现蓝、紫、橙等颜色。属植物的次生代谢产物，因多呈黄色而称类黄酮(flavonoid)。多存在于一些有色植物提取物中，如在松树皮提取物、绿茶提取物、银杏叶提取物、红花提取物等。目前已发现类黄酮8000多种。 我们日常摄取的食物中亦含有黄酮类化合物，如：芹菜、清苋菜、韭菜、洋葱、茶叶、番茄、蜂蜜、苹果、葡萄、红枣、荞麦叶、柑橘、柠檬、樱桃、青椒、可可、红葡萄酒等。值得注意的是大量的黄酮类化合物都是由饮料进入人体，茶、咖啡、可可、果酒(尤其是红葡萄酒)和啤酒，甚至醋都是重要的黄酮类化合物来源二、黄酮类化合物的基本结构与分类黄酮类化合物在植物体内大部分与糖结合成苷，母核15个碳原子组成3个环结构。最常见的糖苷化位点是，其次是C7。葡萄糖是最常见的糖基，其他还有半乳、鼠李糖、木糖等。一部分以游离形式存在。早期黄酮化合物(flavonoids)主要是指基本母核为2一苯基色原(2-phenyl-chromone)类化合物，目前则泛指两个苯环A-环与B-环)通过中央三碳链相互联结而成的一系化合物，其基本骨架可用C6-C3-C6表示。根据类黄酮的化学结构可分为8大类：主要有黄酮flavones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷酮(flavanones)、异黄(isoflavones)、黄烷醇(flavanols)、黄烷酮醇(flavanon-ols)、查耳酮(chalcone)、花色素(anthocyanidim)及它们的生物等。三、黄酮类化合物的药用功效已有报道显示它可以改善心脑血管循环，清除体内自由基，可抗衰老、抑制脂质过氧化、抗血小板凝集、防止毛细管渗透、保护肌肤、抗癌、抗菌、抗病毒，抗肝脏毒、抗过敏和提高自身免疫力。被广泛研究和应用在医疗领域、功能性食品和保健品领域，在欧洲它是用来治疗老年痴呆症(A1zheimers Disease)的首选药物，也是治疗高血压、脑动脉硬化症、糖尿病和心血管疾病的良药。四、桑黄黄酮类化合物的应用前景 大家都知道银杏作为药物使用在中国有很长的历史但是真正意义上开始研究开发银杏的医疗价值则始于个世纪60年代。随着药物提取工艺标准化和银杏叶提物(EGB)对防治心脑血管疾病、老年痴呆症和对抗血小活化因子(PAF)作用的发现，国内外加大了对银杏叶化学成分、药理活性及临床应用等方面研究的力度，并对银叶有效成分的提取工艺做了大量的探索研究，相继研制发了银杏植物药制剂、功能性食品和保健品、化妆品等被广泛研究和应用在医疗领域。EGB含有黄酮苷和内酯等50多种物质，其中就以黄酮类为主。目前人们对桑黄的研究发现，从桑黄中提取并确认的黄酮类化合物就有20余种。因此可以肯定地说，桑黄和银杏一样，作为我国古老传统的中药原料，必将随着现代科学的不断发展，重新得到人们的认同和追捧。 第三节 三 萜一、三萜类化合物及功效三萜(triterpenoids)是由30个碳原子组成的萜类化合物，有的以游离形式存在，有的则与糖结合成苷的形式存在(三萜糖苷)。三萜及三萜糖苷具有广泛的生物活性，通过科学研究发现，三萜类化合物具有溶血、降血脂、降血医、抗肿瘤、抗癌、保肝护肝、抗HIV一1及HIV一1蛋白酶活性、抗炎、抗菌、抗艾滋病毒、抗生育等多种药理作用。二、桑黄三萜研究现状近几年，人们对灵芝中的三萜类化合物研究很多，在各种灵芝中已分离到的灵芝三萜类化合物已达100多种，它是一类具有明显化学结构特征的活性化学成分，主要为四环三萜类化合物，大多具有生理活性。如灵芝酸A-1等和灵芝三萜醇类，灵芝三萜酸在不同灵芝中或同一种不向生长阶段的灵芝子实体中，其含量和化学结构均有所不向，因而其生物活性也有所差异。桑黄和灵芝同属担子菌亚门(Basidiomycotina)，而且我们经过研究发现，在桑黄中也含有大量的三萜类化合物。只是由于人们对桑黄的研究起步较晚，目前还没有桑黄三萜类化合物药用活性的相关研究报道。但是，相信不久的将来，随着人们对桑黄的不断研究，桑黄产业的不断扩大，桑黄也可以像灵芝一样迎来它的辉煌时代。 第四节 其他成分在桑黄中除了多糖、黄酮、三萜外，还有一些其他的活生成分需要我们了解。比如从桑黄子实体中得到的落叶松蕈酸(场cic acid，Agaricic acid)，具有抑制汗腺分泌的作用，可用于治盗汗。据报道它还有洋地黄样作用，低浓度能兴奋平滑肌，大剂量则发生抑制作用，中毒量可引起延脑中血管运动中枢、呼吸中枢先兴奋后麻痹。在日本则做利尿剂使用。在桑黄子实体中还提取出一种单体成分麦角甾醇，其虽不能直接用药，但受到紫外线照射后可生成维生素D2，因此麦角甾醇有维生素D2的作用，它还是制造雌性激素的重要原料。还有一些酶和微量元素，都是人体必须或对人体有益的物质。 第四章 桑黄的药用价值关于桑黄的药用价值，我国古代很久以前就有记载。传说“如果得到附着在桑树上的黄色疙瘩(桑黄)，死人也可以复活；神农本草经将桑黄描述为“久服轻身不老延年”；本草纲目记载桑黄能治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、经闭等症；中药大辞典叙述其可治内科多种疾病，其子实体入药，味微苦，能利五脏、宣肠气、软坚、排毒、血、和胃止泻；药性论中记载“治女子崩中带下，月闭。血瘕，产后血凝，男子痃癖，兼疗伏血、下赤血。在我国民间传统中药中，桑黄主要用以治疗淋病、崩漏、带下、疵瘕积聚、癖软、脾虚泄泻等。同时，民间则还认为桑黄可以提离肝脏机能，对肝硬化的治疗也很有效。在日本桑黄则作为利尿剂使用，日本原色日本菌类图鉴则记载桑黄可治偏瘫一类中风病及腹痛、淋病，还有解毒、提高消化系统机能的作用。近年来，国内外学者对桑黄的药理作用作了较为深入的研究。研究发现，桑黄是已知高等真菌中抗癌效果最好的菌类(与巴西蘑菇“姬松茸”疗效相近)，具有突出的抑制初期癌细胞扩散的效果，对高血压的降压作用也十分显著。另外，用于在癌症手术后防止复发的效果也十分显著。一般化学疗法的抗癌剂的毒性强，会导致癌症患者的头发脱落而桑黄几乎无毒性，并且它具有较高的免疫机能，当与一般的抗癌化学疗法并行使用时，可以进一步提高治疗效果。桑黄也因其良好的疗效而被誉为“菌中极品”。第一节 抗癌、抗肿瘤 一、间接抗癌从桑黄中分离的多糖类物质主要为酸性多糖、蛋白结合多糖，大多数没有直接抑癌功效，主要是通过免疫调节、抑制癌细胞转移、抗突变、抗血管生成降低肝线粒体中药物代谢酶(如P450等)活性等而起到肿瘤抑制和预防作用。 1免疫调节实际上，大多数真菌多糖的抗肿瘤作用是作为生物反应调节剂，通过增强宿主免疫调节功能，即宿主介导抗肿瘤活性来实现的，而且对正常细胞几乎没有毒性。真菌多，糖可通过多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用。大量免疫实验证明，真菌多糖不仅能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞(M)和自然杀伤细胞(NK)等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子的生成，对免疫系统发挥多方面的调节作用。有研究人员用桑黄的菌丝体胞外多糖(EPS)进行免疫学实验，发现胞外多糖(EPS)不仅能够使T细胞增殖，而且对不同同类抗原的T细胞也有增殖作用，并且毒性T淋巴细胞的毒性在加入桑黄胞外多糖(EPS)后大大增强。同时韩国学者发现桑黄提取物还可以诱导相Il解毒酶，包括苯醌氧化还原酶(QR)和谷胱甘肽一S转移酶(GST)的活性，并且提高了谷胱甘肽的水平。2抗诱变桑黄的大豆培养提取物的抗诱变研究表明，桑黄菌丝水提取物具有抗诱变活性，它是通过提高醌氧化还原酶和诱变剂的活性以及诱变水平来抑制肿瘤，并起着重要作用的。3抗突变桑黄提取物中含有抗突变成分，可有效的抑制直接诱变剂4一硝基邻苯二胺(NPD)，叠氮钠(NaN3)和间接诱变剂2一氨基芴(2一AF)、苯并a芘(BaP)对沙门氏菌的诱变作用。在抗BaP中，其作用机制是通过阻止一种酶系统或帮助非致癌代谢产物的合成，从而阻碍初级和次级代谢产物的生成。这4种诱变剂的作用模式并非完全一致，而桑黄都表现出抗突变作用，可见桑黄提取物中含有多种抗突变成分。4抗血管生成对癌症病人来说，抗血管治疗是治疗癌症的一个重要组成部分。研究人员通过小鸡胚胎绒毛尿囊膜(CAM)检测，发现桑黄的乙醇提取物包含有效的抗血管生成物质，桑黄的这种抗血管活性可能支持抗肿瘤活性。为了证实这一点，活性成分应该从提取物中分离纯化出来，这有可能是一种新的抗血管物质。我们有理由相信，桑黄的抗血管生成作用将会成为癌症治疗的辅助性治疗。5增强人外周血单个核细胞(PMNCs)产生干扰素(IFN一)的作用我国学者研究了桑黄在体外对PMNCs的作用过程，发现桑黄对PMNCs分泌IFN一有直接诱生作用，而IFN一具有明显的抗肿瘤活性，能抑制前癌基因表达，阻止肿瘤细胞从G0期进人Gl期，抑制肿瘤细胞的增殖。还能诱导T细胞辅助抗体产生，增强细胞毒T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤作用。IFN一还作用于巨噬细胞、T细胞、8细胞等调节机体的免疫机能。这一结果加深了对桑黄抗肿瘤作用机理的认识，并且也提示我们桑黄在抑制肿瘤转移中的应用潜力。6阻止磷酸化韩国研究人员将桑黄子实体醇提物(5微克毫升和25微克毫升)加入鼠肝上皮细胞(WBF344)培养体系共培养24小时，再加入双氧水(500微摩尔升)共培养1小时，结果发现双氧水能抑制细胞缝隙连接通讯(GJIC)，引起连接蛋白43重度磷酸化，激活胞外调节蛋白激酶(ERKl2)，p38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和cjunN末端激酶。桑黄粗多糖(PL)预防GJIC被抑制，阻止连接蛋白43重度磷酸化，钝化EBKl2，p38 MAPK，从而抑制癌症的激发，起到抗癌作用。二、肿瘤直接杀伤作用 关于真菌多糖直接诱导瘤细胞凋亡的报道目前很少。其中韩国学者报道来源于裂蹄木层孔菌(Phellinus linteUS)的蛋白结合多糖PL对SW480人结肠瘤细胞有直接诱导凋亡作用。研究发现PL可显著提高亚Gl和G2M期癌细胞数量。PL能够降低Bcl一2水平，增加细胞色素C释放，降低cyclinB l的表达。还有人继而研究了同一多糖对人胃腺癌的生长和腹腔转移的影响。体外实验表明，PL在浓度为75微克毫米时对胃腺癌细胞TMK一1有显著抑制作用，抑制程度呈较好的浓度依赖性。DNA片段检测表明，诱导TMK一1癌细胞呈明显凋亡的PL浓度为375微克毫升。体内实验表明，剂量为l 00毫克毫升的PL能够显著抑制荷瘤裸鼠的胃癌瘤块增长，并降低胃癌向腹膜迁移率达75。同样是韩国学者又对裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)菌丝体进行热水提取、分离出活性组分MEPL，研究其对人神经瘤SKNMC细胞株的凋亡作用。MEPL能够显著抑制癌细胞增殖，并出现凋亡特征，如核固缩、Gl亚期峰的出现等，但所需浓度较大，0.75的浓度(即750微克毫米)才有显著抑制癌细胞活性作用。第二节 其他药用功效一、保肝和抗肝硬化我国研究人员在抗肝纤维化试验过程中发现，桑黄提取物不仅能保护肝细胞，促进肝功能恢复，而且同时抑制肝脏内胶原纤维增生，改善肝组织结构，呈现出明确的抗肝纤维化效果。其作用机理是，在体内可抑制白细胞介素-4(IL-4)介导的炎症反应，同时诱导淋巴细胞产生-干扰素(IFN-)，进而抑制肝星状细胞(HSC)活化、增殖及胶原合成能力，减轻肝脏内ECM过量沉积。二、抗氧化清除自由基的功能韩国学者研究了桑黄乙酸乙酯浸提物的抗氧化作用，结果发现，对超氧阴离子的清除、抗坏血酸引起油脂氧化的抑制、过氧化物和一氧化氮的清除有很好的效果。同时，又有学者分别用甲醇和热水浸提从桑黄中提取了酚类化合物，得率分别为333毫克毫升和207毫克1 00毫升，利用p-胡萝卜素-亚油酸酯模型和活性氧反应产生系统来测抗氧化作用和自由基清除能力，测得羟基自由基、过氧化氢的清除率在80-90。另外，有人在桑黄提取物清除自由基l-(2，6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙氨基)丙烷盐酸盐(DDPH)的试验，和体外抑制脂类过氧1化反应的试验中，发现桑黄提取物有较好的清除自由基DDPH活性。然而，可能是由于桑黄抗癌的效果非常好的原因，人们对于其抗氧化的作用相对就研究的少了些。三、降血糖在用桑黄多糖喂养用链脲霉素导致的糖尿病大鼠实验中，发现桑黄多糖能够降低血糖，同时减少总胆固醇、三酰甘油和天冬氨j酸转氨酶。这个结果让我们相信桑黄多糖在治疗人类糖尿病上也将有所作为。四、抗肺炎、抑菌消炎1抗肺炎在用桑黄提取物预处理大鼠的实验中，发现桑黄提取物能够抑制肺炎，、大鼠炎症细胞，包括嗜中性粒细胞的数量及白介素(IL)一1 的水平。这个结果表明：桑黄提取物在抑制人类急性肺炎方面可能会有很大的作用。2抗菌到目前为止对桑黄抗菌性的研究甚少。采用浸提法提取桑黄子实体，分别试验了甲醇、氯仿、正丁醇和水的提取物，得率分别为：006，0008，00 1 6和0026(ww)，然后分别用二倍稀释法测定对耐甲氧基西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcus aureus)的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。结果表明：正丁醇浸提物抗耐甲氧基西林金黄色葡萄球菌效果最好(MIC：63125毫克毫升)。然而对于其抗菌谱以及抗菌原理我们还需要进一步研究。3消炎研究人员使用高剂量的脂多糖(8毫克千克)诱导小鼠感染性体克(败血症)，血清中的细胞因子升高，用从裂蹄木层孔菌(Phellinus Linteus)子实体中分离出的酸性多糖预处理小鼠(100毫克千克)，发现能有效抑制细胞因子的上升(IFN一1，IL一12，IL一1的上升量分别下降68，45，23)；另外，此多糖能调和细胞因子的释放以及B细胞、巨噬细胞中MHCIl类分子的水平。此多糖的体内给药还能降低血清中IL-2，IFN一和TNF的含量，并加强由体外脂多糖激活的巨噬细胞和T细胞的自发凋亡，缓和败血症，起到抗发炎的作用。五、治疗痛风韩国学者在黄嘌呤氧化酶抑制试验中，发现裂蹄木层孔菌(PhellinUS linteus)提取物能够完全抑制尿酸(尿酸盐微结晶沉积于关节而引起局部粒细胞浸润及炎症反应)的生成，有效的抑制黄嘌呤氧化酶的活性，此项研究对痛风病的治疗很有意义。第五章 桑黄的人工栽培目前，由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，桑黄在自然界中形成子实体困难，造成天然的桑黄数量非常稀少，自然界中可供药用的资源有限，难以成为稳定的工业产品来源，对桑黄产业的发展十分不利，因此通过人工培植来弥补野生资源的不足显得尤为重要。桑黄人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达34年，但由于桑黄是一类白腐真菌，以腐生为主兼性寄生，因而对该菌进行人工培养在理论上是可行的。据报道，韩国已成功地培养出桑黄菌的子实体。现今，日本和韩国的桑黄栽培产业，已具相当规模；国内部分地方也了有了桑黄人工栽培成功的报道，但由于种种原因至今没有相关的详细资料发布。天津市林业果树研究所食用菌研究中心长年从事食药用菌的研究工作，做了大量的摸索性试验，收获了人工栽培子实体桑黄。但由于技术尚不成熟，此方面的研究有待深入，以下内容仅供参考。提前老化，甚至萎缩。 第二节 菌种生产的主要条件 一、温室 桑黄菌种生产和室内子实体培养一般需要温室，温室的构造应根据当地的情况，因地制宜。温室的温度控制方式有多种，一般有红外线加温法，红外灯加温法，电炉加温法，暖气加温法，有条件的还可以采用空调设备加温。 二、接种室接种室是菌种接种的场所，要求严格地控制杂菌污染，既要有玻璃门窗通风，又要能够控制空气进入。接种室面积不宜过大，9平方米为宜。接种室内要求有水泥地面，石灰粉刷墙壁及上顶，室内装有紫外灯。接种室必要时还应有一个缓冲间，以减少空气直接进入接种室。 三、高压灭菌设备 可以根据培养量的大小自行选择。 四、其他设备及材料 超净工作台1个(图6)、玻璃瓶若干、酒精灯3盏、镊子2把、小口瓶2个、三角瓶2个、接种针各种形状2支、解剖刀l把、小剪刀1把、小称l把、温湿度计5个、天平l 台、试管若干、量杯2个、脱脂棉、纱布、酒精、高锰酸钾、升等。第三节 母种生产过程一、培养基的配制及其灭菌马铃薯(去皮)200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁15克，琼脂20克，pH自然，维生素B1 1 0豪克，水1000毫升。 先将马铃薯洗净去皮，称取200克，切成小薄片，放入瓷缸中，加水l000毫升，加热煮沸，待马铃薯片软熟后，将澄清液倒人另一烧杯，弃掉马铃薯片，然后，将称好的琼脂，加人马铃薯澄清液中，加热熔化，待琼脂全部熔化后，再放人其他几种称量好的物质，不断搅拌，全部溶解后补充所蒸发的水分，稍加搅拌使之均匀，趁热分装试管，装量为试管长度的五分之一左右，装完后塞好棉塞，然后，扎成捆，上端用报纸(内层)和硫酸纸(外层)包好。竖立放人高压灭菌锅内在112千克平方厘米的压力下，灭菌30分钟，然后取出试管，待温度降至50一60时，摆成斜面冷凝备用。在一般情况下，第一次使用高压灭菌锅时，应将冷却后的斜面试管抽取l/4，置放在27-30的恒温箱中，保温培养3天后检查，若未发现斜面长出任何细菌或真菌，则证明灭菌彻底，以后则不必每次抽取保温培养检查。高压灭菌锅在压力1.1千克平方厘米时，锅内温度可达l 2 1，在这样高的温度下保持2030分钟，完全可以杀灭培养基或其他液体所带的细菌、真菌。有人不了解这一情况，随意加大灭菌锅压力和延长保压灭菌时间，会使培养基中营养成分遭到破坏，酸度增高，直至不能凝固。灭菌好的斜面试管要尽快使用，一时用不完的可放在0-5的冰箱中保存一定时间，也可放在室温下保持一段时间。一般将试管放在20以上或30以下的恒温条件下培养57天，观察试管内培养基表面是否有异常现象出现，若有黄、绿、黑、青或黏液出现即是杂菌，证明灭菌未彻底，就不能使用，若没有其他异常现象就可使用。 二、桑黄菌种的分离 1子实体的消毒 先将新鲜的桑黄子实体表面用清水冲洗干净去掉泥沙和污物，用纱布擦于水分，后移到无菌室内，用01的升汞液中浸泡3分钟，再用无菌水冲洗数次进行表面消毒。 2组织分离 将消毒好的桑黄子实体用解剖刀从子实体中部纵切一刀，将中间部分切取一小块组织，迅速移接到斜面培养基上，加上棉塞，置恒温培养箱内，25 -28 培养，5天后可见组织块上长出绒毛状菌丝。经过71 0天的培养观察，菌丝已基本长满培养基表面，从中可选择菌丝生长快、生长健壮、旺盛的菌丝试管作为转管提纯使用。 3转管提纯 经过分离出来的桑黄菌丝，都必须要经过23次的转管提纯，进一步观察菌丝生长变化情况以及菌丝的纯度情况和稳定性。选取优良旺盛的菌丝，去掉老化、退化、变化的菌丝。 桑黄菌丝生长情况有各种各样，若在琼脂培养基上表现生长缓慢、纤细、稀薄、弱乱，或者不长，甚至出现一凸一凹等症状。这类菌丝都不能使用，否则就会影响菌种质量，降低产量。所以为了提高菌种质量，必须从试管母种选育开始，选择菌丝生长旺盛、健壮的作为接种的母种使用。第四节 原种生产过程原种是繁殖栽培中用的菌种，原种是由母种繁殖出来的。经过子实体组织分离获得的试管母种，生长再好也必须经过原种培养、观察、鉴定才能进一步作为扩大生产种的再生产，确定菌种的优良性和稳定性。一、原种培养基下面介绍几种原种培养基的不同配方，供参考选用。1木屑培养基配方：锯木屑78，石膏l，麦麸20，白糖l。锯木屑一般采用阔叶树之类的锯木屑肩较好，其中以青岗树锯木屑为最好(松、柏、樟树和含芳香油的锯木屑不宜使用)，要求新鲜，无霉变。2棉籽壳44，木屑44，麦麸l 0，石膏粉1，尿素05：，过磷酸钙05。3棉籽壳7879，玉米粉20，石膏粉12，含水量65。4木屑73，麸皮25，糖1，石膏粉1。制作过程：将上述原料配方混合均匀，白糖用清水溶化后，加人培养料中充分拌匀，再加清水，使培养料含水量达5565之间含水量过高培养料不透气，菌丝生长缓慢或不长，含水量过低，培养料湿度不够，菌丝也难生长，并且各种营养成分的转化必须要有一定的湿度才能进行。 为了掌握好准确的含水量，最好边拌料，边喷水，边测定，以防用水过多。方法很简单，用手捏一把培养料，手指缝间见水不滴为宜(即含水量为65)。二、灭菌原种培养基灭菌可采用高压灭菌或常压灭菌两种方法。一般原料最好采用高压灭菌，由于它数量不多，质量要求较高，首先灭菌必须严格彻底。高压灭菌将原料放入高压锅内，上紧锅盖螺丝，加足水位，然后升火加温，待压力表指针上升到05磅(1磅=0453592千克)时，即开始打开放气阀，排除锅内的冷空气，使压力表指针自动退回原位时即关闭(一般高压锅压力针上升到05磅时会自动排冷气，自动关闭)，随后继续加温，使压力针上升到15磅时，保持15小时为宜，然后让它自动冷却后取出接种。三、接种桑黄接种可根据原种数量多少决定，数量多可采用接种室接种，数量少可采用接种箱接种。原种一般数量都不太多，最好用接种箱接，因为接种箱虽然操作困难，接种速度慢，但不易被杂菌感染，成活率高。接种箱消毒，接种前预先将接种箱打扫干净，用75的酒精或高锰酸钾溶液擦洗一遍，再把菌种瓶，及其他用具都擦洗一遍放人接种箱。消毒方法可采用两种方法同时进行。紫外灯照射、高锰酸钾和甲醛混合进行气化消毒30分钟接种。接种时，双手先用75的酒精消毒后，再伸入接种箱，点燃酒精灯，把接种针放在火焰上烧红晾凉后使用。母种试管的棉塞表皮可在酒精火焰上烧一下，再拔掉棉塞，用接种钩把试管内的母种培养基挑取蚕豆大的一块，放在原种瓶内的培养基上，长有菌丝的那面培养基应朝上，有利于菌丝发育接触木屑培养基，接种后塞上棉塞，再进行第二瓶操作。每支试管母种可接原种58瓶。四、培养接种后的原种放在2528左右的恒温条件下培养57天后，就可看到培养基的表面白母种块上长出白色的绒毛菌丝，向培养基深部或四周扩散发展。此时应随时检查是否感染杂菌，若出现杂菌应及时淘汰，直到菌丝布满培养基表面为止。原种接种后，在正常的温度下，一般在25天左右可长满瓶底，l 71 8天左右菌丝长到培养基的一半时，表面会出现子实体原基。作为原种的菌种不管子实体如何生长都不能拔掉瓶塞，以免杂菌进入瓶口内。菌丝在生长过程中，因呼吸作用要散发一定的热量，往往瓶温高于室温或自然温度23，因此，菌种瓶在发菌时不宜堆叠过高或过挤，以免温度过高，而使菌种质量F降。五、原种的保存桑黄原种菌丝长满瓶后，应及时使用，不宜存放过久，在常温下可保存一个月左右，只要子实体未停止生长。没有枯干的都可作扩种使用，总之菌龄尽量缩短为好。原种的保存方法一般采用低温下避光保存较好，温度控制在5 7保存为宜，有条件的地方可用电冰箱保存。第五节 栽培种生产过程栽培种是用原种扩制直接用于栽培的菌种。栽培种有两种制作方法，一种是锯木屑之类的菌种，另一种是木块菌种。锯木屑的菌种用于瓶栽和塑料袋栽比较适宜，木块菌种用于段木栽培，栽培种的选料和操作方法与原种制作基本相似。 一、木块、玉米芯培养基由于桑黄的栽培基本采用段木栽培，因此，以下介绍木块栽培种的原料配方供参考。木块、玉米芯培养基配方：木块l 000千克，过磷酸钙2千克，玉米芯1 8千克，pH6065，麦麸10千克，水适量，石膏2千克。这种培养基配方含糖量较高，不需另加白糖，以防偏酸，后期子实体发育不良。具体操作：将原料按选择的配方比例混合均匀后，再加入用清水溶化的白糖拌匀，保持培养料含水量为65。含水量的测定方法同原种测定相同，然后再用氢氧化钠或稀盐酸调至所需要的pH范围。二、装瓶方法把拌好的料装入瓶中，边装边将菌种瓶上下抖动，使培养料逐步紧实，但不能太紧。不能用其他东西将培养料往瓶内挤压以免造成松紧不匀，要求整个瓶中的培养料松紧适合，上下一致。一般来说培养料装得过松，