第二章 试管苗快速繁殖

第2章植物快速繁殖技术 2 1试管苗快速繁殖意义和一般程序 2 1 1试管苗快速繁殖意义试管苗快速繁殖 是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养 使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法 试管苗快速繁殖是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛 产生经济效益最大的研究领域 涉及的植物种类繁多 技术日益成熟并程序化 2 1 2试管苗快速繁殖的一般程序 一般选择根 茎 叶器官为培养材料进行培养 壮苗与生根培养 试管苗驯化与移栽几个环节 研究根系生理代谢的优良实验体系 研究营养吸收 生长和代谢的变化规律 建立快速生长的根无性系 进行诱变育种 2 2器官培养 2 2 1根的培养 2 2 1 1根无性繁殖性的建立 根无性繁殖系 1 2cm 接后1周 侧根 反复转接 无菌种子 2 2 1 2培养 多为无机离子浓度低的怀特培养基 也可用2 3MS或1 2MS B5培养基注 离体根生长要求提供全部必需元素 蔗糖 硝态氮效果好 加入B1 B6最重要 生长素对离体根影响不一致 培养温度25 27 暗光培养 概念 切取茎的先端或茎尖分生组织进行无菌培养 意义 微茎尖培养可获得脱毒苗 茎尖培养技术简单 操作方便 易成活 成苗时间短 加快繁殖 2 2 2茎尖培养 类型 根据培养目的和取材大小分为 微茎尖培养 普通茎尖培养 茎尖培养的类型 普通茎尖指几毫米到几十毫米的芽尖及侧芽 微茎尖为0 3 0 5mm 茎尖培养的方法 接种 直接取材 在生长旺盛 枝条健壮 无病的母株上选生长不久 杂菌污染少的顶梢 1 2cm 取前可喷杀菌药 可顶芽或侧芽 从试管苗获取 2 2 2 1取材 取1 2 顶梢 顶梢切割成0 5 1 0cm的茎尖 除叶 剥去休眠芽的鳞片 茎尖流水冲洗2 4h 75 酒精迅速漂洗30s 0 1 升汞或稀释20倍的次氯酸钠液消毒5 8min 取自老枝条上的可适当延长时间 2 2 2 2材料处理及消毒 接前可再剥去一些叶片 然后随切随接 动作迅速 亦可将切下茎尖材料在1 5 VC液中浸一下 2 2 2 3接种 培养基 基本培养基 MS White B5 Heller 蔗糖作碳源效果好 浓度2 3 激素和有机添加物有明显影响 但激素浓度以0 1mg L为宜 不要太高 2 2 2 4培养 培养条件 光强 1000 3000lx 光照时间 16h 温度 25 左右 昼夜温差有或无 以植物或培养过程来定 干燥季节注意保湿 2 2 3茎段的培养 2 2 3 1材料选择与处理 嫩枝去叶 剪3 4cm长水冲洗1 3h 75 酒精30 60s 0 1 升汞3 8min 饱和漂白粉液10 20min 无菌水冲洗数次 2 2 3 2接种与培养 培养基 MS腋芽增殖效果 BAKT ZT 生长素改善苗生长 GA促芽伸长 注意激素配比 继代增殖途径 促腋芽快速生长 诱导形成不定芽 1 成苗途径与意义2 材料选择与消毒3 接种4 培养 2 2 3叶的培养 幼嫩叶片流水冲洗70 75 酒精漂洗10s饱和漂白粉液浸3 15min 或在0 1 升汞液5 8min 无菌水冲洗多次后 用无菌滤纸吸干水分 2 2 3 1材料选择与灭菌 上表皮朝上接种培养基 最好带叶脉 注意极性 2 2 3 2接种 外植体大小 5 5mm薄片 培养基 MS B5 White N6 蔗糖3 2 4 D利于愈伤组织形成 NAA抑制芽形成 利于根发生 KT 6BA利于芽形成 培养条件 25 28 10 14h光照 1500 3000lx 不定芽分化和生长再强些 2 2 3 3培养 2 2 4 4植株再生途径 直接产生不定芽形成愈伤组织形成胚状体其他途径 2 3壮苗和生根培养 2 3 1试管苗的壮苗培养较高浓度的生长素与较低浓度的细胞分裂素组合有利于形成壮苗 在生产实际中 增殖系数控制在3 0 5 0时可实现增殖和壮苗的双重目的 另外 改善培养室环境条件 如增加光照强度 降低湿度等对培养壮苗也有一定帮助 2 3 2试管苗的生根培养 生根培养基 1 2或1 4MS基本培养基 不加或少加CTK 适量添加NAA 糖浓度1 1 5 培养条件 增加光强 达3000 10000lx 2 3 2 1生根方法与途径 将新梢基部浸入50ppm或100ppmIBA溶液中处理4 8h 在含有生长素的培养基中培养4 6d直接移入含有生长素的生根培养基中 容易生根的植物 延长在增殖培养基中的培养时间即可生根 适当降低增殖倍率 减少细胞分裂素的用量 即可增殖又可生根 对易生根植物 切割粗壮的嫩枝用生长素溶液浸醮处理后在营养钵中直接生根 此方法省去了生根阶段 但只适于一些容易生根的植物 2 3 2 2影响试管苗生根的因素 植物材料基本培养基植物生长调节剂培养条件其它物质 2 4试管苗的驯化与移载 试管苗生态环境与自然环境的差异试管苗的特点试管苗的驯化试管苗的移栽 2 4 1试管苗的特点 2 4 1 1试管苗的生态环境 1 高温且恒温 2 高湿 3 弱光 4 无菌 2 4 1 2试管苗的特点 1 生长细弱 角质层不发达 2 光合作用差 3 叶片气孔数少 活性差 4 根吸收功能弱 2 4 2试管苗的驯化 目的 提高试管苗的适应性 促其健壮 最终提高移栽成活率原则 从温 光 湿度及有无杂菌等环境因素考虑 驯化开始数天内 与培养环境条件相似 后期与预计栽培条件相似 逐步适应 方法 即炼苗 不开口自然光下2 3天 然后开口1 2天 2 4 3移栽基质的选配 河砂 河砂分为粗砂 细砂两种类型 粗砂即平常所说的河砂 其颗粒直径为1 2mm 草炭土 草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成 其保水性好 蓄肥能力强腐殖土 腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成 2 4 4试管苗的移栽 移栽方法 取出试管苗 全部轻洗去培养基栽入基质 事先浇透水 后 栽后轻浇薄水 移入高湿环境 90 以上 移栽场所 日光温室塑料大棚驯化室 2 5移栽后管理 2 5 1保持小苗水分供需平衡1周内 环境高湿 遮光 1周后 揭膜 控水 增加光强 半个月后 小苗生长后逐渐降湿 拱棚两端通风 2 5 2防止菌类滋生 基质高压灭菌或3h烘烤灭菌或太阳能灭菌 适当使用杀菌剂 消毒剂 移栽时少伤苗 喷水加0 1 尿素或1 2MS大量元素液追肥 加快苗生长 2 5 3温度 光照条件的控制 适宜生根温度 18 20 移栽初期弱光 后逐渐加强光照 过渡到自然光照 2 5 4保持基质适当的通气性 基质配比 珍 蛭 草 腐殖土 1 1 0 5 珍 草 腐殖土 1 1保持基质通气性 选颗粒状基质 浇水勿多 2 6组培中三大难题 污染的原因及预防褐变的原因及预防玻璃化的原因及预防 2 6 1污染 污染是指在组织培养过程中 由于真菌 细菌等微生物的侵染 在培养容器内滋生大量菌斑 导致培养材料不能正常生长和发育的现象 2 6 1 1污染的类型与症状 引起污染的微生物主要有芽孢杆菌 大肠杆菌等细菌和毛霉 根霉 青霉等真菌 细菌性污染的症状 培养基或培养材料表面出现黏液状或浑浊的水迹状菌落 颜色多为白色 与培养基表面界限清楚 真菌性污染的症状 培养基或培养材料表面出现不同颜色的菌落 继而很快形成黑 白 黄 绿等孢子 与培养基界限不清 2 6 1 2造成污染的因素 培养基及各种使用器具灭菌不彻底 外植体灭菌不彻底 有菌残存在细胞组织中 操作时人为因素带入 环境不清洁 超净工作区域不清洁 2 6 1 3控制污染的措施 1 培养基和接种器具彻底灭菌 2 防止外植体带菌 3 严格遵守无菌操作规程 4 保持环境清洁 5 超净工作台 2 6 2褐变 褐变是指在组培过程中 培养材料向培养基中释放褐色物质 致使培养基逐渐变褐 培养材料也随之变褐而死亡的现象 2 6 2 1褐变的原因褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系 2 6 2 2影响褐变的因素 1 植物材料 植物基因型 材料年龄 取材部位 外植体大小及受伤程度 2 培养基成分 无机盐浓度过高 CTK水平过高 3 培养条件 光照过强 温度过高 加速褐变 4 材料转移时间 2 6 2 3褐变的预防措施 1 选择适宜的外植体 2 选择合适的培养条件 3 连续培养 4 加抗氧化剂 5 加0 1 0 5 活性炭 2 6 3玻璃化 玻璃化 离体培养物的嫩茎或叶呈半透明水渍状 为生理失调症 2 6 3 1玻璃化发生的原因 1 激素浓度 尤其CTK 增加或CTK IAA高 2 琼脂浓度低 3 光照时间大于15h 4 温度低 5 通风条件不好 6 培养基离子种类及比例不适宜 2 6 3 2预防玻璃化的措施 1 适当控制培养基中无机盐成分 2 适当提高蔗糖和琼脂浓度 3 适当降低CTK和GA的浓度 4 增加自然光照 控制光照时间 5 适宜的培养温度 6 改善培养器皿的气体交换状况 6 培养基中添加其它物质 2 7植物无糖培养 植物无糖培养快繁技术又称为光自养微繁殖技术 是指在植物组织培养中改变碳源的种类 以CO2代替糖作为植物体的碳源 通过输入CO2气体作为碳源 并控制影响试管苗生长发育的环境因子 促进植株光合作用 使试管苗由兼养型转变为自养型 进而生产优质种苗的一种新的植物微繁殖技术 2 7 1无糖组培技术与常规组培技术的区别 CO2代替了糖类作为植物体的碳源环境控制促进植株的光合速率使用多功能大型培养容器多孔的无机材料作为培养基质封闭型培养室 2 7 2无糖培养微繁殖技术的优势 极大地促进了植株的生长和发育污染率大幅度减少提高试管苗移植的成活率消除了小植株生理和形态方面的紊乱工程方面的优越 2 7 3无糖培养与有糖培养相结合 实践证明 无糖培养与有糖培养相结合 可以进行二者之间的优势互补 既能降低成本 又可在短期内培养育出大量合格的组培苗木 是当前组培工作中一项可行的技术措施 2 7 4植物无糖组培快繁技术的限制因素 需要相对复杂的微环境控制的知识和技巧实际应用还是受到一定的限制 原因就是需要应用微环境控制方面专业的技术培养的植物材料受到限制与一般的微繁殖相比 光自养微繁殖需要较高质量的芽和茎 外植体需具有一定的叶面积 带绿色子叶的体细胞胚也可进行光自养生长 2 7 5无糖组培技术国内外研究进展 2 7 6植物无糖组培快繁技术应用前