蛋白质化学培训课件

第二章蛋白质化学 ChemistryofProtein 第一节蛋白质的化学组成 一 元素组成C H O N S 少量 特点 大多数蛋白质含氮量较接近且恒定 平均为16 蛋白质含量 蛋白氮 6 25 二 蛋白质组成的基本单位 氨基酸 aminoacids 1 氨基酸的结构特点 碳原子是不对称碳原子 因此氨基酸都具有旋光性 除甘氨酸 从结构通式可知 各种 氨基酸的区别在于侧链R基团的不同 NH2 H R COOH C 2 氨基酸的分类 酸性氨基酸 R基团含羧基 PH 7时 带负电荷 代表氨基酸 谷氨酸 天冬氨酸碱性氨基酸 R基团含碱性基团 PH 7时 带正电荷 代表氨基酸 赖氨酸 精氨酸 组氨酸 非极性或疏水性氨基酸 R基团含疏水性基团 8种 代表氨基酸 丙氨酸 亮氨酸不解离极性氨基酸 R基团为极性基团但不能解离 7种 代表氨基酸 甘氨酸 苏氨酸组成蛋白质的氨基酸共有20种 蛋白质中少见的氨基酸 L 羟脯氨酸L 羟赖氨酸B 丙氨酸r 氨基丁酸 N OH COOH H 1 2 H2N CH2 CH CH2 CH2 CH COOH OH NH2 H2N CH2 CH2 COOH H2N CH2 CH2 CH2 COOH L 羟脯氨酸 L 羟赖氨酸 丙氨酸 氨基丁酸 3 氨基酸的性质 1 氨基酸的物理性质 无色结晶 各有特殊晶形 熔点高 易溶于酸和碱 不溶于有机溶剂 2 氨基酸的两性电离性质 amphotericproperties 和等电点 isoelectricpoint PI C H NH2 R 氨基酸在纯水溶液和结晶状态中都以两性离子 zwitterion 在等电点时 氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动 不同氨基酸所含羧基 氨基的数目不同及各种基团的相对解离程度不一致 故其PI值各异 如谷氨酸3 32 赖氨酸9 14 丙氨酸6 00 丝氨酸5 68 在同一条件下各种氨基酸所带电荷的质和量不一致 利用这一性质可应用离子交换法或电泳法分离这些氨基酸 PI值可用实验方法测定 也可根据其PK值计算 等电点 PI 的计算 氨基酸完全质子化时 可看作是多元酸 等电点 PI 的计算 实验方法测PI值 甘氨酸 可计算出任何一PH条件下一种氨基酸的各种离子比例氨基酸的等电点 是氨基酸所带正负电荷值相等 即净电荷为零时的溶液PH值 用PI isoelectricpoint 表示 PI是氨基酸的一个特性参数 对侧链R基团不解离的中性氨基酸 PI 1 2 pK1 pK2 对有三个可降解基团的氨基酸 如天冬氨酸 pI 1 2 pK1 pK2 pK3可忽略不计 3 氨基酸的吸收光谱 酪氨酸 max 275nm苯丙氨酸 max 257nm色氨酸 max 280nm蛋白质 max 280nm 4 氨基酸的化学性质 NH2的反应 a 与亚硝酸反应是VanSlyke法测定氨基氮的基础 可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定 b 与2 4 二硝基氟苯 DNFB 反应此反应常与多肽的N 端分析 C 与酰氯化合物的反应这是化学合成多肽时的重要的氨基保护反应 羧基的反应 成盐 成酯 成酰氯 成酰胺 及脱羧 叠氮化反应等 氨基和 羧基共同参加的反应 a 与茚三酮反应用茚三酮成色可以定性或定量测定各种氨基酸 b 成肽反应 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽 三 蛋白质的分子结构 一 蛋白质的一级结构 PrimaryStructure 肽链中的氨基酸顺序1 肽键 peptidebond 和肽链肽键是蛋白质分子中基本的化学键 肽键 35 34 肽键中的氨基酸称为氨基酸残基 aminoacidresidue 肽键中的骨架是规则的重复排列而成的 称为多肽链分子的骨架或主链 R基团部分称为侧链各种肽链的主链结构都一样 单侧链R基的顺序不同 多肽链有方向性通常把NH2末端的氨基酸残基放在左边称N 末端COOH末端的氨基酸残基放在右边 称C 末端 肽的命名根据其组成的氨基酸内残基来确定的 规定从肽键的NH2末端氨基酸残基开始 称为某氨基酰某氨基酰某氨基酸一级结构中连接氨基酸残基的共价键除了肽键外 还有一个较常见的二硫键 是由两个半胱氨酸残基的侧链之间形成的二硫键 S S disulfidebond 2 蛋白质一级结构测定的原理 包括蛋白质中氨基酸的组成分析和排列顺序的分析1 氨基酸组成的分析目前常用氨基酸自动分析仪完成蛋白质的氨基酸组成一般用每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示 或用每100克蛋白质中含氨基酸的克数表示 2 氨基酸的顺序分析 1 N末端和C末端氨基酸残基的测定N末端分析的方法 二硝基氟苯法 DNFB法 生成的DNP 氨基酸用有机溶剂 如乙酸乙酯 提取后 可用纸层析 薄层层析或HPLC分离鉴定和定量测定 丹磺酰氯法 DNS法 灵敏度比DNFB法高100倍 氨基酸不需提取 可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定 苯异硫氰酸酯法 PITC法 Edman顺序降解蛋白质氨基酸顺序分析仪即依据该方法原理设计 氨肽酶 aminopeptide 一类肽键外切酶 从肽键N端开始逐个切掉氨基酸 C 末端分析方法 肼解法 hydrazinolysis 羧肽酶 carboxypeptidase 一类肽链外切酶 能特异地水解C 末端氨基酸 羧肽酶A水解脂肪族或芳香族氨基酸构成的C 末端肽键羧肽酶B水解碱性氨基酸构成的C 末端肽键 2 大分子多肽氨基酸顺序确定一般步骤 a 测定蛋白质分子中多肽链的数目 根据蛋白质末端残基 氨基端或羧基端 的摩尔数和蛋白质的分子量可以确定蛋白质分子中的多肽链数目 b 拆分蛋白质分子的多肽链如果蛋白质分子是由几条不同的多肽链构成的 则必须设法把这些多肽链拆开并单独分离出来 然后测定每条多肽链的氨基酸顺序c 测定多肽链的氨基酸组成d 分析多肽链的N末端和C末端残基 e 断裂多肽链内的二硫键 二硫键氧化用甲酸氧化还原用巯基化合物 f 多肽链断裂成肽段 用两种或几种不同的断裂方式 断裂点不同 将多肽链样品降解成两套或几套肽段或称肽碎片 peptidefragment 并将这些肽段分离开来 g 测定各个肽段的氨基酸顺序 目前最常用的是Edman降解法 此外酶法 气 质联用法等 h 确定肽段在多肽链中的次序 利用两套或几套肽段的氨基酸顺序彼此间有交叉重叠 可拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序 I 确定原多肽链中二硫链的位置 例 一条多肽链A法水解得 蛋 苯丙 甘 丝 纈 赖 酪 丙B法水解得 酪 丙 蛋 苯丙 甘 丝 纈 赖重叠顺序 纈 赖 酪 丙 多肽顺序为 甘 丝 纈 赖 酪 丙 蛋 苯丙 1953年Sanger等用上述基本方法确定了牛胰岛素的一级结构 这是生化领域中具有划时代意义的重大突破 因为它第一次表明 一个蛋白质分子具有严格的氨基酸种类 数量和排列顺序 核糖核酸酶 五十年代末 美国学者StanfordMoore等人完成了牛胰核糖核酸酶的全顺序分析 它是测出一级结构的第一个酶分子 还有血红蛋白 肌红蛋白 细胞色素C等 二 蛋白质的构象 conformation 蛋白质的空间结构统称为构象 立体结构 高级结构 三维结构 即蛋白质多肽链的所有原子由于单键的旋转而稳定与一定的空间排布 蛋白质分子的构象可分为蛋白质的二级结构 三级结构和四级结构研究构象方法是X 射线衍射法 X raydiffractionmethod 构型 指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向 构象 是指这些取代基团当单键旋转时可能形成的不同的立体结构 乙烷的构象 不同构象由于绕单键旋转可以迅速互变 C C H COOH H3C H COOH H3C H C C H 构型变化涉及共价键的断裂 乙烷的构象 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H 锯架结构式 纽曼 Newman 透视结构式 交叉型 重叠型 1 蛋白质的二级结构 指多肽链的主链骨架中一些肽单位借助氢键的维系而形成的沿一个方向具有周期性的构象 肽单位 peptideunit 或称肽平面 肽键与相邻的两个 碳原子所组成的基团 55 蛋白质的二级结构 螺旋 helix 多个肽键平面通过氨基酸 碳原子的旋转 使多肽链的主骨架沿中心轴盘曲成稳定的 螺旋构象 片层 pleatedsheetstructure 一种肽链相当伸展的结构 折角 bend 无规线团 螺旋特征 1 螺旋的方向为右手螺旋 每3 6个氨基酸旋转一周 螺距为0 54nm每个氨基酸残基的高度为0 15nm 肽键平面与螺旋长轴平行 2 氢键是 螺旋稳定的主要次级键 相邻的螺旋之间形成链内氢键 一个肽单位的N原子与第四个肽单位羰基上的氧原子生成氢键 螺旋靠氢键维持是相当稳定的 若破坏氢键 则 螺旋构象破坏 3 肽链中氨基酸残基的R基侧链分布在螺旋的外侧 其形状 大小及电荷等均影响 螺旋的形成和稳定性 蛋白质分子中氨基酸的组成和排列顺序对 螺旋的形成和稳定性具有决定性的影响 片层结构特点 1 肽键的伸展使肽键平面之间折叠成锯齿状 2 肽键平行排列 相邻肽键之间的肽键相互交替形成许多氢键 是维持该结构的主要次级键 3 肽键平行的走向有顺式和反式两种 肽键的N 端在同侧为顺式 不同侧为反式 4 肽链中氨基酸残基的R侧链分布在片层的上下 2 蛋白质的三级结构 Tertiarystructure 指一条多肽链所有原子或基团的空间排布 多肽链借助各种次级键盘绕成特定的不规则构象 维持蛋白质三级结构的作用力有 氢键 范德华力 疏水键 盐键 二硫键 结构域 分子量较大的蛋白质 多肽链往往以超二级结构为单元组成两个或两个以上相对独立的区域 再形成三级结构 这些相对独立的区域称为结构域 稳定三级结构的化学键 氢键 hydrogenbond 多肽链上的羰基氧和酰胺键之间 侧链与侧链 侧链疏水键与介质水之间范德华力 包括三种较强的作用力定向效应 极性 极性 诱导效应 极性 非极性 分散效应 非极性分子或基团间 疏水键 hydrophobidinteraction 在介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋葬在分子的内部 这一现象被称为疏水相互作用 盐键 正电荷与负电荷之间静电相互作用 二硫键 S S 蛋白质的一级结构决定三级结构的构象 即氨基酸顺序控制着肽链本身折叠盘绕而成特定的天然构象的方式 并由此确定了Cys残基两两相互接近的正确位置 3 蛋白质的四级结构 quarternarystructure 两个或两个以上的亚基形成的聚集体即是四级结构 四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基或亚单位 subunit 四级结构涉及亚基在整个分子中的空间排列以及亚基之间的接触位点和作用力 亚基间的结合力 疏水键 蛋白质分子结构小结蛋白质分子结构的一个显著特征是其结构的层次性 一般用一级结构 二级结构 三级结构和四级结构表示蛋白质分子的不同结构层次 一级结构指的是一条多肽链中氨基酸残基的排列顺序 二级结构指的是多肽主链骨架中的某些肽段借助氢键的维系而形成的沿一个方向具有周期性的构象 主要包括 螺旋 折叠 二级结构不涉及氨基酸残基侧链基团的构象 三级结构指的是一条多肽链在二级结构的基础上 由于蛋白质分子中顺序上相隔较远的氨基酸残基侧链基团之间以及它们与溶剂的相互作用而形成的特定的结构 四级结构是指寡聚蛋白质各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式 第三节蛋白质的结构与功能 一 蛋白质一级结构与功能的关系1 一级结构不同 生物功能不同 一般对小肽而言 2 一级结构中 关键 部分相同 功能也相同 例1 不同动物来源的胰岛素决定功能部分 24个氨基残基恒定不变 其中多数是带有疏水侧链的非极性氨基酸 6个半胱氨酸残基数量和排列位置不变这些不变的结构是维持胰岛素分子空间构象的 关键 部分 例2ACTH与MSHACTHNH2 丝酪丝蛋谷组苯精色甘赖脯苯 COOH MSHCH3CO丝酪丝蛋谷组苯精色甘赖脯 CONH2 人 MSHNH2 丙谷赖天谷甘酪脯酪精蛋谷组苯精色甘丝脯赖天 COO 11 17 4 10 4 10 相同序列39肽ACTH第4 10位氨基酸残基13肽 人 MSH第4 10位氨基酸残基18肽 动物 MSH第11 17位氨基酸残基 功能 ACTH有弱的MSH作用所以用ACTH时间长可使皮肤变黑 MSH也有些ACTH作用 3 一级结构中 关键 部分变化 生物活性也改变或丧失 例一 ACTH 活性决定于N端1 24肽 改变 将N段第一个氨基酸 丝氨酸除去 则活力丧失 若用 丙氨酸或D 丝氨酸代替 所得ACTH类似物活力高于天然ACTH 例2LRH 促黄体生成释放激素 10肽LRH24610相对活性组丝甘甘1 0LRH衍生物 D 丙 3 7 D 丙NH C2H514 0 D 色NH C2H5144 0LRH是中科院研制的一类新药 4 蛋白质一级结构改变可引起疾病例 镰刀形贫血 地中海贫血 一种由血红蛋白 HbA 一级结构变化引起的遗传性疾病HbAH2NVal His Leu Thr Pro Glu Glu Lys COOH 链HbSH2NVal His Leu Thr Pro Val Glu Lys COOH 链 HbA HbS 二 蛋白质空间构象与功能的关系 1 酶原激活酶原 体内一些酶刚刚合成出来时无生物活性的蛋白质 激活酶原酶 无活性 有活性 例 胰蛋白酶原 2 蛋白质的变构现象 别构现象 当某种小分子物质在不同的生理过程中与蛋白质某一亚基或某一部位特异性结合 引起该蛋白质的构象改变 从而导致其功能改变 增强或消弱 的现象称为变构现象或别构作用 allosteryorallosterism 具有变构现象的蛋白质或酶称为变构蛋白 allostericprotein 或变构酶 allostericenzyme 引起变构的物质 称为变构剂 allostericmodulator 使功能增强的物质称为变构激活剂 allostericactivator 使功能减弱的物质 称为变构抑制剂 allostericinhibitor 具有四级结构的蛋白质一个亚基的构象改变 相继引起其他亚基乃至整个分子构象改变的现象 称为亚基 间 协同效应 cooperasivety 例 血红蛋白1 血红蛋白的结构氧合引起的血红蛋白构象变化2 血红蛋白的氧合曲线3 H CO2和DPG对血红蛋白结合氧的影响 1 H CO2促进O2的释放 波尔效应 Bohreffect 生理意义 2 DPG降低氧亲和力 98 四个亚基由盐桥相连接 血红蛋白的每个亚基都能结合一个O2 而每个亚基与O2结合后能提高其余亚基对氧的亲和力 这种现象称为协同作用 血红蛋白第四个O2的亲和力为第一个O2的300倍 血红蛋白氧合的协同效应使得它更有效地起着输送氧气的作用 97 1914年C Bohr发现CO2能改变血红蛋白的氧和曲线 增加CO2的压力能显著地提高血红蛋白亚基的协同效应 降低血红蛋白对氧的亲和力并发现降低PH也能增加亚基的协同效应 促使血红蛋白释放氧 这些相互有关的现象称为波尔效应 Bohreffect 可概括为下列过程 HbO2 H CO2Hb O2Bohreffect以及DPG效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效力 同时由于能在较窄分压范围内完成输氧功能 因此使机体内的O2水平不致有很大的起伏 此外血红蛋白使机体内的PH也维持在一个较稳定的水平 H CO2 肌肉 PH7 2 肺部 PH7 6 血红蛋白的别构效应充分地反映了它的生物学适应性 结构与功能的高度统一性 第四节蛋白质的性质 1 蛋白质的变性与复性是蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏 导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变 这过程称为变性作用 denaturation 蛋白质变性过程中出现的现象 1 生物活性的丧失 是蛋白质变性的主要特征 2 一些侧链基团的暴露3 一些物理化学的改变4 生