晚期糖化终末产物在糖尿病大鼠骨质疏松发病中的作用.doc

晚期糖化终末产物在糖尿病大鼠骨质疏松发病中的作用中国老年学杂志 2000年第5期第20卷 实验研究作者：孔德娟李恩陈永春佟晓旭单位：河北医科大学生化教研室，石家庄050017关键词：晚期糖化终末产物；糖尿病性骨质疏松；骨密度摘要目的探讨晚期糖化终末产物(AGE)在糖尿病骨质疏松发病中的作用。方法用链脲佐菌素制做糖尿病大鼠模型，3个月后测定大鼠腰椎骨密度及骨胶原中AGE的含量及观察血、尿生化指标的变化。结果糖尿病大鼠骨胶原中AGE的含量与正常对照组相比明显升高(P0.001)，而骨密度明显降低(P0.02)。24 h尿钙增加，血钙降低。结论糖尿病大鼠骨胶原中AGE含量的增加所导致的成骨作用降低，可能是糖尿病骨质疏松发病的主要原因。 晚期糖化终末产物(AGE)是糖的醛基或酮基与蛋白质等自由氨基，在非酶促反应中首先形成可逆的希夫氏碱(Schiff-base)，再经一系列脱水、氧化等反应，形成一类具有特征性荧光的化合物1。血糖的增加及富于自由氨基的蛋白质则有助于该物质的形成。糖尿病患者，由于胰岛素相对或绝对不足引起血糖升高，是AGE形成增加的主要原因2。而骨胶原中的大量自由氨基，是AGE的主要形成部位。蛋白质一旦经糖化终末产物修饰，则改变其生物学活性3。而在骨形成过程中，成骨细胞对骨组织中型胶原的吸附是骨形成开始的先决条件。因此，本文通过测定糖尿病大鼠骨胶原中AGE含量及糖尿病大鼠的骨密度，探讨糖尿病骨质疏松的发病机制。1材料和方法1.1实验动物实验选用体重200250 g Wistar大鼠20只。适应环境1 w后，随机分为2组，即正常对照组、病理模型组。病理模型组以60 mg/kg体重链脲佐菌素(溶于柠檬酸缓冲液中pH4.5)经腹腔注射。正常对照组注射等量柠檬酸缓冲液，普通饲料喂养，自由饮用自来水，1 w后，尾静脉取血，测定血糖，血糖浓度15 mmol/L被选入实验。常规喂养80 d后，禁食24 h收集尿液。大鼠经股动脉放血收集血液，离心取血清待测。取大鼠腰椎L1L4做骨密度测定，取右侧股骨和胫骨放-70冰箱，用于测定骨胶原中AGE相对含量。1.2血尿生化指标的测定血钙、血磷、血糖、血碱性磷酸酶、尿钙、尿磷、尿肌酐均采用全自动生化分析仪检测，尿羟脯氨酸采用氯氨T氧化比色法测定。1.3骨密度和骨胶原AGE的测定采用SD1000骨矿物测定仪测定大鼠第三腰锥(L3)骨密度。骨胶原中AGE含量的测定：从-70冰箱取出骨标本后，沿骨纵轴剪开，用冰冷的PBS(pH7.4)冲洗骨髓腔数次直至冲洗液PBS无红色为止。滤纸吸干水份后，放入液氮中，30 min后取出，在研钵中用力研磨，过20目不锈钢筛，称取20目以下的骨颗粒20 mg，在0.5 M EDTA(pH7.4)中，4脱钙72 h，每24 h换液一次。脱钙骨粉经5 ml氯仿甲醇(21VV)脱脂12 h。加入甲醇2 ml、蒸馏水0.5 ml，650 g离心10 min。吸弃上清，沉淀经5 ml甲醇洗2次，去离子水洗3次，再用含0.1 mol/L CaCl2的0.02 mol/L Hepes缓冲液(buffer H pH7.5)洗2次。Buffer H中4过夜。离心，除去Buffer H，骨颗粒沉淀重新悬浮在1.0 ml含280 U胶原酶的Buffer H中，同时加入2 l氯仿和2 l甲苯以防细菌生长，水浴摇床中37消化24 h。10 000 g离心5 min。以激发波长370 nm，发射波长440 nm处测定上清中的荧光强度，含胶原酶的buffer H作空白对照。上清再经6 mol/L盐酸110水解24 h后，用于羟脯氨酸的测定。以胶原中羟脯氨酸的含量为14%，计算出胶原含量。AGE的含量以每毫克胶原中相对荧光强度(RF/mg)表示。1.4统计学分析所有数据均以xs表示，数据用计算机统计软件PSI运算处理。2结果2.1血、尿生化指标的变化病理模型组与正常对照组相比血钙明显降低(P0.05)，尿钙明显增加(P0.05)，而血碱性磷酸酶显著升高(P0.001)(表1)。病理模型组与对照组相比血糖显著升高(P0.01)，病理模型组血糖在注射链脲佐菌素(STZ)7 d后和90 d无统计学差异(表2)。表1血、尿生化指标的变化(s)组别n血Ca(mmol/L)血P(mmol/L)血ALP(IU/L)尿Ca(mol/24 h)尿羟脯氨酸(mol/24 h)正常对照组102.460.071.990.4150.813.364.60.291.040.43病理模型组82.210.251)1.600.52205.551.372)24.07.401)1.270.36注：病理组与对照组相比：1)P0.05，2)P0.001表2各组大鼠血糖的变化(s，mmol/L)组别n注射STZ7 d注射STZ90 d正常对照组0.6病理模型组820.21.71)18.01.91)病理模型组与正常对照组相比：1)P0.012.2骨密度及AGE的变化链脲佐菌素所致糖尿病大鼠(即病理模型组)与正常对照组相比，骨密度明显降低(P0.02)，同时骨胶原中AGE的相对含量显著增加(P0.001)(表3)。表3大鼠骨密度与骨胶原中AGE的含量(s，mmol/L)组别nBMD(g/cm)AGE(RF/mg胶原)正常对照组100.2710.02630.964.63病理模型组80.2390.0241)60.119.742)病理组与正常对照组相比：1)P0.02，2)P0.0013讨论血糖升高及蛋白质自由氨基的多少都影响AGE的形成，链脲佐菌素所致的糖尿病大鼠血糖明显升高，而且没有明显的自然恢复，也即出现持续高血糖状态。因此，在各种组织蛋白上极易发生非酶糖化反应，形成AGE，尤其是含自由氨基较多的长寿命蛋白，如骨胶原、鼠尾腱、皮肤及肾小球基底膜等47。由于这些蛋白半寿期较长，AGE一旦形成，则不易清除。骨基质中的型胶原的功能正常是骨重建的先决条件。有研究表明：非酶糖化的细胞外基质对内皮细胞的粘附能力降低8。推测非酶糖化的型胶原对成骨细胞的粘附能力也可能降低，成骨细胞的粘附是成骨作用的开始。而非酶糖化产物AGE修饰的骨基质对成骨细胞分化的抑制则导致成骨作用明显降低9。这与糖尿病患者血清骨钙素降低结果相一致。但在本实验中糖尿病大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)的明显升高，原因可能为链脲佐菌素造成肝损伤而致ALP升高，而非骨形成增加所致，因所测转氨酶明显升高(本资料未显示)。AGE不仅使成骨作用降低，同时相对增加骨吸收。AGE修饰的蛋白对单核巨噬细胞具有趋化作用，而后者细胞膜上存在着AGE受体。AGE在受体介导下与单核巨噬细胞结合，促进后者合成和释放多种细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-等1014。这些细胞因子通过直接或间接途径促进破骨细胞前体细胞转化为成熟的破骨细胞，并增加其骨吸收活性1517。因此，AGE的升高可导致骨吸收相对增加，骨形成作用降低，从而导致骨量丢失。本研究中发现糖尿病大鼠骨胶原中AGE明显升高，骨密度则明显降低。综上所述，糖尿病时的AGE升高可能是导致糖尿病骨质疏松的主要原因。作者简介：孔德娟，女，35岁，讲师，博士，研究方向：糖化终末产物与老年疾病参考文献1，Vlassara 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