农杆菌介导法..ppt

农杆菌介导转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位 并诱导产生冠瘿瘤或发状根 农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤 原理 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒 其上有一段T DNA 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后 可将T DNA插入到植物基因组中 因此 农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系 人们将目的基因插入到经过改造的T DNA区 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合 然后通过细胞和组织培养技术 再生出转基因植株 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中 近年来 农杆菌介导转化在一些单子叶植物 尤其是水稻 中也得到了广泛应用 Story冠瘿瘤病 双子叶植物经常发生 因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处 形似帽状而得名 1907年 Smith Townsent农杆菌诱发冠瘿瘤病 1947年 Braunetal 证实俩者的关系 但发现有的菌株不致病 提出了假说 tumour inducingprinciple TIP 肿瘤诱导因子 60 s 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸 octopine nopaline 总称冠瘿碱 opine Petitetal 证实肿瘤组织合成的冠瘿碱取决于菌株 而且菌株能专一地利用冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源 证实了TIP 1974年 Zaenenetal Schell VanLarebekeetal 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 tumorinducingplasmid 称为Ti质粒 Ti TIP1977年 Chiltonetal 分子杂交技术证实肿瘤细胞中存在外源的DNA 与Ti质粒的DNA有同源性 是整合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段 T DNA transferredDNA 其内有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因 1981年 Oomsetal 发现Ti质粒上有致瘤区 virulenceregion Vir区 Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子 长度约200kb 平均周长54 1 75 4um 分子质量为 90 150 106Da 在温度低与30 的条件下 Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内 Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外 还具有以下几种重要功能 1 赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力 2 赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力 3 根癌农杆菌的寄主植物范围 4 决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分 5 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活 1 Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类 章鱼碱 octopine 类胭脂碱 nopaline 类农杆碱 agropine 类 Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因 然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达 它们只有进入植物细胞后才能表达 Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱 为宿主细胞提供能源 氮源和碳源 长度 160 250kb6大功能区 1 致瘤区 这个区主要合成植物生长素和细胞分裂素 2 冠瘿碱合成区 3 冠瘿碱分解区 4 Ti质粒接合转移区 tra 5 毒性区 Vir 6 DNA复制区 Rep 在致瘤区 冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列 由这三部分所构成的DNA区域叫做T DNA 致瘤区 冠瘿碱 左右边界 T DNA插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T DNA T DNA区域中的这些基因只有在T DNA插入到植物基因组后才能激活表达 T DNA T DNA Tms1 Tms2 Tmr这3个基因表达植物生长素和细胞分裂素 可调节植物细胞的生长和发育 它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿 冠瘿碱合成基因在宿主植物体内合并分泌出来 被Ti质粒上的冠瘿碱代谢基因分解成碳源和氮源 供根癌农杆菌生长所须 脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列 构成T DNA的左边界和右边界 在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T DNA是以两个分开的独立片段形式存在 即T DNA左边区段和T DNA右边区段 插入在T DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中 因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体 Vir区 Vir region 即毒性区 其长度约为35kb 控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位 与感染后冠瘿形成有关 Vir区位于T DNA区左侧 包含义个毒性遗传点 virA vir virC vir vir 和virG vir基因控制着 的转移 vir vir virCvirGvir virA 植物细胞受伤后 细胞壁破裂 分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子 它们是一些酚类化合物 如乙酰丁酮 acetosyringone AS 和 羟基酰丁香酮 hydroxacetosyringone OH AS 根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性 在植物细胞表面附着后 受这些创伤诱导分子的刺激 Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达 目前已经发现9种信号因子 均为水溶性酚类化合物 其中乙酰丁香酮 acetosyringone AS 和羟基乙酰丁香酮 OH AS 的作用较强 儿茶酚 原儿茶酚 没食子酸 焦性没食子酸 二羟基苯甲酸 香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用 双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子 而使T DNA可以成功的转入 而单子叶植物需要加入外源酚类物质 才能激活Vir区的基因 达到转基因的目的 最先激活表达的是virA基因 它编码感受蛋白 位于细菌细胞膜的疏水区 可接受环境中的信号分子 在virA蛋白的激活下 virG基因表达 virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态 进而激活vir区其他基因表达 virA基因 virG基因 virD基因产物 virD1蛋白是一种DNA松弛酶 它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态 virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T DNA 2个边界产生缺口 使单链T DNA得以释放 VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T DNA结合蛋白 可使T DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物 T 复合体 以此保护T DNA不被包内外的核酸酶降解 小结 植物细胞受伤后 细胞壁破裂 分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子 它们是一些酚类化合物 如乙酰丁酮 acetosyringone AS 和 羟基酰丁香酮 hydroxacetosyringone OH AS 根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性 在植物细胞表面附着后 受这些创伤诱导分子的刺激 Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达 最先激活表达的是virA基因 它编码感受蛋白 位于细菌细胞膜的疏水区 可接受环境中的信号分子 在virA蛋白的激活下 virG基因表达 virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态 进而激活vir区其他基因表达 其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶 它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态 而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T DNA 2个边界产生缺口 使单链T DNA得以释放 VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T DNA结合蛋白 可使T DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物 T 复合体 以此保护T DNA不被包内外的核酸酶降解 T 复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁 并进入植物细胞核 最终整合进入植物核基因组 T DNA的转移机理比较复杂 依赖于T DNA区和vir区共同参与 涉及多个基因表达及一系列蛋白质和核酸的相互作用 Table1SummaryofvirGeneProducts T DNA加工和转移Vir基因表达调控的问题 知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基因的表达 当VirD操纵元的被诱导表达后 其中的VirD1和VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性 YanofskyM F 1986 能够在T DNA边界重复序列的特异位点切开T DNA单链 因此T DNA往往以单链形式进入植物细胞 但是在植物细胞中也发现双链T DNA分子 切刻位点 nicksite 可作为DNA从5 向3 合成的起始位点 新的DNA链合成后 T DNA单链即被替换 displacement 释放出来 图2 当然这种缺刻也可通过重组系统把T DNA双链从Ti质粒上解离下来 缺失研究也表明 右边界重复序列缺失后 T DNA不能转移 而左边界重复序列的缺失会稍稍降低T DNA转移频率 TimmermanB 1988 这进一步说明T DNA单链是在从右边界到左边界5 向3 替换合成中释放出来的 右边界的缺失 使得DNA合成不能起始 因而T DNA不能释放 所以T DNA不能转移到植物细胞 而左边界的缺失 仅会影响DNA合成过程的终止 可能会降低导致T DNA单链释放 而不会明显影响T DNA单链的形成 可见T DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低 这种不同不是由于左右边界的24bp重复序列核苷酸不同 而是由于靠近右边界位置有一个转移增强子 transferenhancer overdriver PeraltaEG 1986 存在 这个T DNA转移增强序列能极其明显的增加农杆菌中T DNA链形成 并且这种作用与它的位置 方向及距离均无关系 增强子的缺失能够使农杆菌对宿主植物的毒性降低 Toro等人发现VirC1蛋白能特异性的结合这个增强子 VirC操纵元的突变也能导致农杆菌的毒性减弱 当T DNA单链进入植物细胞后 植物细胞如何处理这些单链DNA Paul等人利用电转移法把单链DNA转化到烟草原生质体中 结果表明 在植物细胞中 单链DNA迅速转变成双链DNA分子 此外单链DNA比双链DNA的转化效率更高 然而T DNA分子并非以裸露的单链DNA形式进入植物细胞的 T DNA单链的5 端共价的