葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响.doc

KKME-专业医学搜索引擎/葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响作者:李倩,王继红,程梅,王欣 【摘要】 目的：观察高浓度葡萄糖对人肝细胞株（L02）及胰岛素抵抗细胞模型（IRL02）的血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）表达的影响，探讨ANGPTL3与糖尿病（DM）并发高脂血症的关系，在细胞水平分析DM并发高脂血症的分子机制. 方法：以L02为研究对象，并建立胰岛素抵抗模型（IRL02）. L02和IRL02两组细胞分别在含5.6，7.0，11.1，28.0和33.0 mmol/L葡萄糖的培养液中培养，5.6 mmol/L组作为对照组. 用RTPCR方法检测ANGPTL3的mRNA表达量，并用Western Blot方法检测ANGPTL3蛋白质表达水平，分析ANGPTL3与DM并发高脂血症的关系. 结果：高浓度葡萄糖可促进L02和IRL02两组细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达，并呈一定的量效关系，变化差异均有统计学意义（P0.0001）；IRL02细胞对葡萄糖的刺激尤为敏感（P0.0001）. 结论：高浓度葡萄糖可上调ANGPTL3的基因和蛋白质表达，其在DM并发高脂血症中可能起重要作用. 【关键词】 血管生成素样蛋白3；糖尿病；高脂血症；葡萄糖；胰岛素抗药性 0引言 人血管生成素样蛋白3（angiopoientinlike protein 3，ANGPTL3）是Mr约为70 ku的分泌蛋白，由460个氨基酸组成，其氨基端的螺旋样结构域与调节脂质代谢的功能相关，主要在肝脏中表达1. ANGPTL3可通过抑制脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的活性导致以极低密度脂蛋白（very lowdensity lipoprotein，VLDL）三酰甘油升高为主的高脂血症. 脂代谢与糖代谢在多个环节相互作用，共同影响糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发生与发展. 血脂异常是DM的危险因素，而有关ANGPTL3与DM相关性的研究目前国内外都极少报道. 本实验通过研究高糖环境下人肝细胞株（L02）及其胰岛素抵抗细胞模型（insulin resistant L02，IRL02）ANGPTL3的mRNA和蛋白表达量变化，分析葡萄糖对该基因表达的影响，拟从分子水平探讨ANGPTL3在DM并发高脂血症中的病理生理作用. 1材料和方法 1.1材料L02（重庆医科大学基础研究所）；RPMI 1640培养基，1125胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；RTPCR试剂盒（宝生物大连有限公司）；ANGPTL3 基因引物和Actin引物，胰岛素（上海生物工程技术服务有限公司）；ANGPTL3小鼠mAb和Actin小鼠mAb（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠mAb，PVDF膜（北京鼎国生物制品公司）；免疫印迹（Western Blot）试剂盒（Santa Cruz公司）. PCR仪，微型电转移装置，GelDoc 100凝胶成像仪（美国BioRad公司）. 1.2方法 1.2.1细胞培养和胰岛素抵抗模型的建立L02细胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液在50 mL/L CO2, 37条件下培养，选取对数生长期的细胞用于实验. 用含510-7 mol/L胰岛素的培养液培养16 h的L02细胞代替胰岛素抵抗模型，称为IRL02细胞，以在不含胰岛素的培养液中培养16 h的L02细胞为对照. 细胞计数,接种后随机分为L02细胞组和IRL02细胞组. 其中L02细胞组在上述条件培养16 h，更换无血清培养液培养24 h后，又分为G1G5五个亚组，分别用含5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/L的葡萄糖培养液培养24 h，设G1为对照组. IRL02细胞组：除用含510-7 mol/L胰岛素的培养液替换胎牛血清培养L02细胞外，其它培养条件和时间与L02细胞组完全相同，同样分为IRG1G5五个亚组，设IRG1为对照组. 1.2.2RTPCR检测ANGPTL3的mRNA表达量按总RNA抽提试剂盒说明操作提取细胞总RNA，用UV法定量分析RNA得率和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性. cDNA合成（10 L反应体系）：取MgCl2 2 L，10RT缓冲液1 L，无核酸酶蒸馏水3.75 L，dNTP混合液1 L，RNA酶抑制剂0.25 L，AMV逆转录酶0.5 L，随机引物0.5 L，总RNA(300 ng) 1 L. 逆转录反应条件：30 10 min，42 30 min，99 5 min，5 5 min，所得产物用于PCR扩增. PCR反应：采用Primer Premier 5.0软件设计ANGPTL3引物和Actin引物. ANGPTL3上游引物序列：5 TCC AGA ACA CCC AGA AGT AAC 3，下游引物序列: 5 CCA GCC TCC TGA ATA ACC CT 3；Actin上游引物序列:5 TCC TCC CTG GAGAAG AGC TA 3，下游引物序列：5 TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3. ANGPTL3和Actin反应同管进行，终体积50 L. PCR反应条件：94 2 min，1个循环；94 30 s，55 30 s，72 1 min，共35个循环. 取8 L反应液进行25 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采集图片，Quantity One软件分析，将ANGPTL3与Actin面积灰度值的比值作为ANGPTL 3的mRNA表达量参数. 1.2.3Western Blot检测细胞ANGPTL3的蛋白质表达量提取细胞总蛋白质，Lowry法测定总蛋白浓度. Western Blot：蛋白质提取液（含60 g总蛋白）与5SDS上样缓冲液按体积比41混合，常规处理后进行100 g/L SDS聚丙烯酰胺电泳，电转过夜，将蛋白质转至PVDF膜. 常规Western Blot方法操作，ANGPTL3 mAb 11000稀释，Actin mAb 15000稀释，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠mAb 15000稀释. 凝胶成像系统采集图像，Quantity One软件分析，ANGPTL3与Actin的面积灰度值比值作为ANGPTL3的蛋白质表达参数. 统计学处理：数据用xs表示，用SAS 9.1软件分析，采用析因设计方差分析，P0.05为差异具有统计学意义. 2结果 2.1实验整体统计结果由表1可见，随着葡萄糖浓度增加， L02细胞及IRL02细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达量也随之增加，对mRNA表达影响的析因设计方差分析结果为F=84.14, P0.0001；对蛋白质表达影响分析结果为F=115.93, P0.0001，差异均有统计学意义. 在mRNA水平，葡萄糖浓度的影响：F=178.67，P0.0001；细胞组间比较：F=6.33，P0.05；葡萄糖浓度与细胞组比较：F=9.07，P=0.0002. 即葡萄糖对ANGPTL3的mRNA表达有明显影响，在葡萄糖不同浓度组、不同细胞组和两者的交互作用方面差异均有统计学意义. 在ANGPTL3蛋白质表达方面，葡萄糖浓度变化对ANGPTL3表达影响的F=181.05；细胞组间比较F=194.72；浓度与细胞组间比较F=31.11，三者差异均有统计学意义（P0.05）. 说明ANGPTL3的基因表达对低葡萄糖浓度刺激不太敏感；而G3G5组与G1组比较，差异均有统计学意义（P0.0001）. 5个亚组间任意两组两两比较，差异均有统计学意义（P0.05），即当葡萄糖浓度升至11.133.3 mmol/L时，L02细胞ANGPTL3的mRNA表达升高（表1, 图1）. 在蛋白质表达水平， G2G5组与G1组比较差异均有统计学意义（P0.05）外， 其它各组间差异均有统计学意义（P0.05）， 显示高浓度葡萄糖可促进L02细胞ANGPTL3蛋白质的表达（表1，图2）. 2.3不同浓度葡萄糖对IRL02细胞ANGPTL3表达的影响在IRG1 IRG5五个亚组细胞间ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达量比较（表1，图3），差异均有统计学意义（P0.0001，）. 在mRNA水平，IRG2 IRG5各组与IRG1组间比较，以及各亚组间两两比较，差异均有统计学意义（P0.0001），显示高糖可明显刺激IRL02细胞ANGPTL3的mRNA表达，使其显著升高. 在蛋白质表达水平（表1，图4），IRG2 IRG5各组与IRG1组比较差异均有统计学意义（P0.0001），即随培养液中葡萄糖浓度的增加，ANGPTL3蛋白质的表达明显升高. IRG2，IRG3和IRG5组组间两两比较显示差异有统计学意义（P0.05）. 显示在极高浓度葡萄糖环境中，ANGPTL3蛋白质表达数量的增加已受到限制. 2.4同浓度葡萄糖对L02和IRL02两组细胞ANGPTL3表达的影响两组细胞ANGPTL3的mRNA表达，除葡萄糖浓度5.6 mmol/L组IRL02细胞的表达量低于L02细胞外；其它各组均呈现IRL02细胞表达量明显高于L02细胞(表1). 比较同葡萄糖浓度两组细胞mRNA表达量，结果显示，除7.0 mmol/L和11.1 mmol/L组IRL02细胞的表达虽比L02细胞增高，但差异无统计学意义（P0.05）外；其余三组葡萄糖浓度对任意两组细胞的影响差异均有统计学意义（P0.05）. 在ANGPTL3蛋白质表达水平，IRL02细胞的表达量除葡萄糖5.6 mmol/L组低于L02细胞外，其它各组ANGPTL3的表达均明显高于L02细胞组（表1），且各浓度葡萄糖对两组细胞ANGPTL3 表达的影响除葡萄糖5.6 mmol/L组外，其它组组间差异均有统计学意义（P0.0001）. 3讨论 DM导致患者死亡的最常见原因是心血管并发症，2型DM患者约有58%死于动脉粥样硬化性心血管病，其特征是胰岛素（相对）缺乏和胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗常引起内源性胰岛素过渡分泌，严重的高胰岛素血症因对LPL的激活作用明显减弱可引起三酰甘油水平升高2，并与血糖控制不满意密切相关. 本研究结果显示，高糖可明显刺激L02细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达，在IRL02细胞高糖对该基因的上调作用更加明显，说明ANGPTL3基因的表达在体内极可能受血糖的调控，提示高血糖可以通过上调ANGPTL3的表达促进高脂血症的发生与发展，ANGPTL3与DM及其相关高脂血症密切相关. 实验结果还显示，当环境葡萄糖浓度升高到7.033.0 mmol/L时，IRL02的ANGPTL3基因和蛋白质表达量都显著增加，并有剂量依赖性，但当细胞处于葡萄糖浓度为5.6 mmol/L时，ANGPTL3的基因和蛋白质表达反而降低，说明良好地控制血糖对预防DM脂代谢紊乱有重要意义. 有关胰岛素抵抗血糖异常状态下，胰岛素信号通路可能通过上调ANGPTL3的表达导致血脂升高的具体机制我们正在进一步研究. ANGPTL3大量表达可引发三酰甘油升高为主的高脂血症3. 而高三酰甘油血症参与了一系列代谢性疾病的发病过程4-5. ANGPTL3的大量表达还可促进脂肪细胞的脂解作用，释放大量FFA6，而FFA是肥胖导致IR的一项重要因素7；摄入高脂饮食和循环中的游离脂肪酸浓度增高可导致外周组织和肝脏的胰岛素抵抗，进而产生2型DM和代谢综合征8. 我们的研究结果提示，胰岛素抵抗引发的高血糖状态可通过上调ANGPTL3的表达，导致循环中三酰甘油和FFA增高，发生高脂血症，而增高的三酰甘油和FFA又加重了肝脏及外周组织的胰岛素抵抗，形成恶性循环，互为因果. 有研究还发现ANGPTL3基因是LXR的直接靶点9-11. 对LXR的研究发现葡萄糖是其内源性配基12，提示葡萄糖上调ANGPTL3的表达机制可能与LXR有关. 综上所述，ANGPTL3可能是DM和高脂血症发生、发展和桥接的关键点，对于ANGPTL3的基础研究有助于DM，高脂血症等代谢性疾病的病因学的发展，而针对ANGPTL3表达的调控和干预有望成为治疗这类疾病的新型治疗手段和途径. 【参考文献】 1 Ono M, Shimizugawa T, Mitsuru S, et al. Protein region important for regulation of lipid metabolism in angiopoietinlike 3(ANGPTL3):Angptl3 is cleaved and activated in vivoJ. Biol Chem, 2003,278(43)：41804-41809. 2 Shimamura M，Matsuda M，Ando Y，et al. Leptin and insulin downregulate angiopoietinlike protein 3, a plasma triglycerideincreasing factorJ. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322:1080-1085. 3 Koster A, Chao YB, Mosior M, et al. Transgenic angiopoietinlike (angptl)4 overexpression and targeted disruption of angptl4 and angptl3: Regulation of triglyceride metabolismJ.Endocrinology，2005，146(11)：4943-4950. 4 Davey RA,Tebbutt NC, et al. Severe combined hyperlipidaemia and retinal lipid infiltration in a patient with Type 2 diabetes mellitusJ.Lipids Health Dis, 2006,5:29. 5 Oike Y, Akao M, Kubota Y, et al. Angiopoietinlike proteins: Potential new targets for metabolic syndrome therapyJ. Trends Mol Med，2005，11(10)：473-479. 6 Shimamura M，Matsuda M，Kobayashi S，et al. Angiopoietinlike protein 3, a hepatic secretory factor, activates lipolysis in adipocytesJ. Biochem Biophys Res Commun, 2003，301:604-609. 7 Gormsen LC, Jessen N, Gjedsted J, et al. Doseresponse effects of free fatty acids on glucose and lipid metabolism during somatostatin blockade of growth hormone and insulin in humansJ. Clin Endocrinol Metab, 2007,92(5):1834-1842. 8 Ye J. 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