03第三章 酶的提取与分离纯化ppt课件

酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来 再与杂质分开 而获得所要求的酶制品的过程 主要包括细胞破碎 提取 离心分离 过滤与膜分离 沉淀分离 层析分析 电泳分离 萃取分离 浓缩 干燥 结晶等 第四章酶的提取与分离纯化 酶的提取 分离纯化技术路线 第一节细胞破碎 细胞破碎是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程 细胞结构 细胞破碎方法及其原理 1 捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法 如 动物内脏 植物叶芽 细菌的细胞破碎 2 研磨法利用研钵 石磨 细菌磨 球磨等研磨器产生的剪切力将组织细胞破碎的方法 是实验室内常用的方法 可以加入小玻璃球 玻璃粉 石英砂或氧化铝作助磨剂 常用于微生物和植物组织细胞破碎 3 匀浆法利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎的方法 通常用于破碎易于分散 比较柔软 颗粒细小的组织细胞 一 机械粉碎法 1 温度差破碎法利用温度的突然变化 热胀冷缩的作用使细胞破碎的方法 如将零下18 冷冻的细胞突然放入高温热水中或将较高温度的热细胞突然冷冻 常用于哪些较为脆弱 易于破碎的细胞 如G 注意操作温度不能过高 以免引起酶的失活 2 压力差破碎法通过压力的突然变化使细胞破碎的方法 常用的有高压冲击法 突然降压法和渗透压变化法 高压冲击法在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂 用活塞或冲击锤加压冲击 以破碎细胞 爆破性减压法将菌体悬浮在N2 CO2高压下平衡 37 振荡数分钟 然后突然减压 使细胞壁 膜破碎 二 物理破碎法 渗透压变化法是利用渗透压的变化使细胞破碎 将对数生长期的细胞悬浮在高渗透压溶液中 20 蔗糖溶液 平衡一段时间 然后离心收集细胞 将其迅速投入4 左右的蒸馏水或其他低渗溶液中 由于细胞内外的渗透压差别而使细胞破碎 适合膜结合蛋白 细胞间质酶等的提取 对革兰氏阳性菌不适用 肽多糖 3 超声波破碎法利用超声波发生器所产生的声波或超声波的作用 通过液体时形成局部减压 叫空化作用 旋涡生成与消失时 产生很大压力 从而使细胞破碎 超声波破碎具有简便 快捷 效果好等特点 特别适合微生物细胞的破碎 三 化学破碎法 通过各种化学试剂对细胞膜的作用 而使细胞破碎的方法 常用有机试剂有甲苯 丙酮 丁醇和氯仿等 表面活性剂 特里顿和吐温 有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏 从而改变细胞膜的通透性 但应当在低温下操作以防酶变性失活 表面活性剂可以和细胞膜的磷脂以及脂蛋白相互作用 使细胞膜的结构破坏 改变细胞膜通过性 四 酶促破碎法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用 使细胞外层结构受到破坏 而达到细胞破碎的方法 自溶法 将细胞在一定的pH和温度条件下保温一段时间 利用细胞本身酶系的作用 使细胞破坏而使细胞内物质释放出来的方法 溶菌酶处理用溶菌酶专一性地分解菌体细胞壁上肽多糖分子的 1 4 糖苷键 从而破坏细胞壁 酵母细胞 葡聚糖酶霉菌 几丁质酶 超声波细胞粉碎机 电动玻璃匀浆机 高压细胞粉碎机 细胞破碎珠 第二节酶的提取 酶的提取是指在一定的条件下 用适当的溶剂或溶液处理含酶原料 使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程 也称为酶的抽提 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质 选择适当的溶剂 一般说来 极性物质易溶于极性溶剂中 非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中 酸性物质易溶于碱性溶剂中 碱性物质易溶于酸性溶剂中 酶都能溶解于水 通常可用水或稀酸 稀碱 稀盐溶液等进行提取 有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团 则可用有机溶剂提取 一酶的主要提取方法 1 温度温度通常控制在0 4 左右 如果酶比较稳定时 可以例外 如胃蛋白酶可在37 保温抽提 2 pH选用pH 首先考虑酶的稳定性 选用pH不应超过酶的pH稳定范围 其次 从抽提效果出发 最好远离待抽提酶的等电点 也就是说 酸性蛋白宜用碱性溶液抽提 碱性蛋白宜用酸性溶液抽提 3 抽提液用量抽提液用量常采用原料量的3 5倍 有时 为了抽提效果好些需要反复抽提时 抽提溶液比例可能大些 二 影响提取的主要因素 第三节沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质 使酶的溶解度降低 而从溶液中沉淀析出 与其它溶质分离的技术过程 盐溶 球蛋白在低浓度盐溶液中 其溶解度随盐离子强度升高而加大的现象 这主要是由于蛋白质分子吸附某种盐离子后 带电表层使蛋白质分子彼此排斥 而与水之间相互作用加强 因而溶解度提高 盐析 当盐浓度继续升高到一定浓度时 蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而降低 结果使蛋白沉淀析出 这种现象称为盐析 盐析作用的理论基础尚不明了 大致是由于高盐离子使水的相对浓度降低 蛋白质失去水化作用 引起分子之间疏水部分吸引力增加 以致沉淀析出 一 盐析沉淀法 式中 S为酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度 g L S0为酶或蛋白质在离子强度为0时的溶解度 g L Ks为盐析系数 I为离子强度 温度和pH一定时 S0为一常数 在一定的温度和pH值条件下 为常数 通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析 而在一定的盐和离子强度的条件下 KsI为常数 通过改变温度和pH值 使不同的酶或蛋白质分离的方法 称为 分段盐析 在蛋白质的盐析中 通常采用的中性盐有硫酸铵 硫酸钠 钾 镁 氯化钠和磷酸钠等 其中以硫酸铵最为常用 这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小 不影响酶的活性 分离效果好 而且价廉易得 各种酶所需硫酸铵的沉淀浓度是不同的 所以可用分级沉淀法将各种酶分级沉淀 硫酸铵盐析时溶液的盐浓度以饱和度表示 饱和盐溶液的饱和度为100 在0 约为4mol 调整盐浓度有两种方法 当蛋白质溶液体积不大 要达到的盐浓度不高 可加入饱和硫酸铵溶液 100m1硫酸铵溶液 由饱和度S1变为S2 应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数 V 为 V Vo S2 S1 1 S2 当蛋白质原有体积较大 要达到的盐浓度又较高 此时加入固体硫酸铵为宜 在0 25 下 硫酸铵浓度由饱和度Sl增至S2 应向1L溶液中添加的固体硫酸铵的克数 可以直接查表 盐析的优点 不会引起蛋白质变性 经透析去盐后 能得到保持生物活性的纯化蛋白质 注意事项 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度 溶液pH值越接近蛋白的等电点 蛋白质越容易沉淀 盐析一般用的硫酸铵 容易吸潮 因而在使用前 一般先磨碎 平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量 这样更准确 在加入盐时应该缓慢均匀 搅拌也要缓慢 越到后来速度应该更注意缓慢 如果出现一些未溶解的盐 应该等其完全溶解后再加盐 以免引起局部的盐浓度过高 导致酶失活 盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理 以免变性 透析较慢 一般可用超滤或者G 25 G 50处理 蛋白质是两性电解质 所带电荷则因pH变化而变化 当蛋白质处于等电点 pI pH时 蛋白质的静电荷为零 相同蛋白质分子间没有了静电排斥作用而趋于聚结沉淀 溶解度达到最低点 不同蛋白质具有不同的pI值 利用蛋白质在pI时溶解度最低的原理 可以把不同的蛋白质分开 二 等电点沉淀法 在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂 可降低溶液的介电常数使酶分子间的静电引力增强而发生沉淀 另外 有机溶剂也可能使酶蛋白脱水而发生沉淀 三 有机溶剂沉淀法 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇 丙酮 异丙醇 甲醇等 有机溶剂的浓度以百分体积 m1 比表示 加入量依下式计算V Vo S2 S1 S S2 式中 V为应加入的有机溶剂体积 Vo为原有的体积 S S1 S2分别为待加的 原溶液中含有的及所达到的有机溶剂百分比浓度 世界酶学史上第一个酶蛋白结晶便是Sumner在刀豆脲酶抽提液中加入32 丙酮得到的脲酶结品 温度因为大多数球蛋白在有机溶剂中不稳定 特别是在温度较高时 更易变性失活 因此 所有操作必须在0 以下进行 有机溶剂必须冷却至 15 20 然后搅拌下缓慢加入 沉淀析出后赶快离心分离 并用预冷缓冲液溶解所得沉淀 以降低有机溶剂浓度 pH一般在进行有机溶剂法时 溶液pH尽可能靠近待纯化酶的pI值 此法分辨率较高 溶剂易除去 但易引起酶的变性失活 影响有机溶剂沉淀法的因素 大分子量的非离子型聚合物 如聚乙二醇 PEG 聚乙烯亚胺 PEI 单宁酸 硫酸链霉素以及离子型表面活性剂 SDS等 用来沉淀蛋白质的方法 它们在一定条件下能与蛋白质直接或间接形成络合物 使蛋白质析出 离心后收集沉淀 再用适当的方法使酶溶解出来 如 PEG常用到的分子量为6000和4000的20 W V 的浓度能将许多蛋白质沉淀出来 四 复合沉淀法 五 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀 而不影响所需的酶的分离方法 如对于热稳定性好的酶如 淀粉酶 可以通过加热处理 使大多数杂蛋白变形沉淀而被除去 第四节离心分离 一 离心原理 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力 使不同大小 不同密度的物质分离的技术过程 根据物质颗粒的沉降系数 质量 密度及浮力等特点进行分离 当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时 由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉 粒子越重 下沉越快 反之密度比液体小的粒子就会上浮 微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小 形态和密度有关 并且又与重力场的强度及液体的粘度有关 在离心分离时 要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小 密度和特性的不同 选择适当的离心机 离心方法和离心条件 1 离心力质量为m的粒子以一定的角速度作圆周运动时受到向外的离心力 颗粒沉降速度决定于应用的离心加速度 ac 它决定于转子的角速度 弧度 秒 与半径 厘米 1 由于转子转一圈等于2 弧度 角速度则为 2 式中n为转子每分钟转数 为转子的角速度 弧度 秒 以 2 带入 1 中 离心加速度即为 3 由此可知离心力大小与转速的平方成正比 与半径成正比 在实际工作中半径是以平均迴转半径计算 即由轴心到离心溶液中心的迴转半径计算 通常 低速离心以每分钟的转数表示 如 4000r min 高速离心 超速 常以相对离心力 RCF 表示 如 65000g 离心力一般用相对离心力RCF 即离心力的大小相当于地球引力 重力常数g 的多少倍 一般用RCF g表示 g为重力加速度 980厘米 秒2 2 沉降速度和沉降系数 沉降系数指单位离心力下颗粒的沉降速度 用S表示 用离心法时 大分子沉降速度的量度 等于每单位离心场的速度 或s v 2r s是沉降系数 是离心转子的角速度 弧度 秒 r是到旋转中心的距离 v是沉降速度 沉降系数以每单位重力的沉降时间表示 由于许多生物大分子的S值很小 所以定义10 13s为一个沉降单位 1S 1 10 13s 常用S表示某些生物大分子 亚细胞及亚细胞器的大小 如16sRNA 蛋白质的沉降系数一般在1 200之间 沉降速度是指在离心力作用下 单位时间内物质运动的距离 常速离心机又称为低速离心机 其最大转速在8000r min以内 相对离心力 RCF 在1 104g以下 在酶的分离纯化过程中 主要用于细胞 细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离 也用于酶的结晶等较大颗粒的分离 高速离心机的最大转速为 1 2 5 104r min 相对离心力达到1 104 1 105g 在酶的分离中主要用于沉淀 细胞碎片和细胞器等的分离 为了防止高速离心过程中 温度升高而造成酶的变性失活 有些高速离心机装设有冷冻装置 谓之高速冷冻离心机 超速离心机的最大转速达 2 5 12 104r min 相对离心力可以高达5 105g甚至更高 超速离心主要用于DNA RNA 蛋白质等生物大分子以及细胞器 病毒等的分离纯化 样品纯度的检测 沉降系数和相对分子质量的测定等 二 离心机的选择 低速离心机 高冷冻速离心机 大容量离心机 三 离心方法的选用 1 差速离心是采用不同的离心速度和离心时间 使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法 在选择离心转速时 应先采用低速离心 使最大颗粒沉于管底 去掉沉淀后 再增加离心力 分离出中等大小的颗粒 最后按照最小颗粒选择离心力 使其形成沉淀 对形成的各级沉淀经过重悬浮 再离心的过程来进一步纯化 特点 用于分离大小和密度差异较大的颗粒 优点 操作简单 缺点 分离效果较差 不能一次得到纯颗粒 2 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心 使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法 常用的梯度介质有蔗糖和甘油 3 等密梯度离心当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时 在离心力的作用下 不同浮力密度的颗粒或向下沉降 或向上漂浮 只要时间足够长 就可以一直移动到与他们各自浮力密度恰好相等的位置 常用的离心介质是铯盐如氯化铯 CsCl 特点 区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度 适宜分离密度相近而大小不同的固相物质 特点 a 介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度 b 适于分离沉降系数相近 但密度不同的物质 总结 1 等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法 关键在于选择氯化铯浓度 使之包括待分离物的密度范围 2 差速离心是一种动力学方法 关键在于选择适合于各分离物的离心力 3 密度梯度离心兼有以上两种方法的特点 关键在于制备优质的密度梯度溶液 三 离心条件的确定 1 离心时间离心时间的概念依据离心方法的不同有所差别 常速离心 高速离心和差速离心 离心时间是指颗粒颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到离心管底的时间 称为沉降时间或澄清时间 密度梯度离心 离心时间是指形成界限分明的区带的时间 称为区带形成时间 等密度离心 离心时间是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间 称为平衡时间 2 温度和pH离心温度控制在4 第五节过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小 不同形状的物质分离的技术过程 过滤介质多种多样 常用的有滤纸 滤布 纤维 多孔陶瓷 烧结金属和各种高分子膜等 可以根据需要选用 过滤介质不同 非膜过滤 采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤 采用各种高分子膜为过滤介质 过滤的分类及其特性 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 一 非膜过滤 1粗滤常压过滤 以液位差为推动力的过滤方法加压过滤 以压力泵或压缩空气为推动力的过滤方法减压过滤 又称为真空过滤或抽滤 是通过在过滤介质的下方抽真空 以增加过滤介质上下方之间的压力差 推动液体通过过滤介质 而把大颗粒截留的过滤方法 2微滤微孔过滤 微滤介质截留的物质颗粒直径为0 2 2 m 主要用于细菌 灰尘等 物质颗粒的过滤 常用于无菌水 矿泉水 汽水的生产 采用高分子膜以外的材料 如滤纸 滤布 纤维 多孔陶瓷和烧结金属等作为过滤介质的分离技术 包括粗滤和部分微滤 借助于一定孔径的高分子薄膜 将不同大小 不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术 膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈 醋酸纤维素 赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜 有时也可以采用动物膜等 膜分离过程中 薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过 而把大于其孔径的颗粒截留 膜的孔径有多种规格可供使用时选择 膜分离 加压膜分离 微滤超滤反渗透 电场膜分离 电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离 透析 二 膜分离技术 1 加压膜分离 1 微滤 以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术 如空气过滤 2 反渗透 反渗透膜的孔径小于20 截留物质分子量小于1000Da 主要用于分离各种离子和小分子物质 用于无离子水制备 海水淡化等 反渗透装备 超过滤是在加压的条件下 将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜 而酶等大分子物质被截留 从而达到浓缩的目的 如果采用不同孔径的膜 同时又具有分级分离的作用 优点 不需加热 更适用于热敏物浓缩 无相变化 设备简单 操作方便 能在广泛的pH条件下操作等 3 超滤 超滤膜一般有两层组成 表层和基层 表层要面向待超滤的物料溶液 中空纤维超滤 超滤膜主要类型 平面膜将膜平铺在多孔支持板上 加压下 可带有搅拌 酶溶液从膜面流过水及小分子溶质透过膜孔而排比 大分子 如酶 被截留 管式膜将管式膜置于多孔硬管的外侧或内侧 酶溶液在管内或管外流动 水和分子溶质透过越滤膜 而大分子物质被截留而浓缩 中空纤维将聚砜作成中空纤维膜 成束中空纤维装在圆筒真空超滤器中 超滤设备 2电场膜分离 1 电渗析 2 离子交换膜电渗析 在半透膜的两侧分别装上正 负电极 在电场的作用下 小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动 透过半透膜 达到分离的目的 主要用于酶溶液脱盐 用离子交换膜代替一般的半透膜 离子交换膜带有某种基团 只让戴一种电荷的颗粒通过 选择透过性强 应用 脱盐 海水淡化 纯水制备 从发酵液中分离柠檬酸 谷氨酸及凝胶电洗脱 3扩散膜分离 透析膜的使用 透析 Dialysis 是利用蛋白质不能通过半透膜 使蛋白质和其他小分子物质如无机盐 单糖 水等分开 将待提纯的溶液装入半透膜的透析袋中 放入蒸馏水或缓冲液中 小分子物质借扩散进入透析袋外的蒸馏水或缓冲液中 这样通过更换透析袋外液 使透析袋内的小分子物质降至最低 如右图 第六节层析分离 层析技术 亦称色谱技术 是一种物理的分离方法 它是利用混合物中各组分的物理化学性质 分子的大小和形状 分子极性 吸附力 分子亲和力 分配系数等 的差别 使各组分以不同程度分布在两个相中 其中一个相为固定的 称为固定相 另一个相则流过此固定相 称为流动相 并使各组分以不同速度移动 从而达到分离 层析分离方法 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法 吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术 一 吸附层析 1吸附层析原理 吸附 任何两个相之间都可以形成一个界面 其中一个相中的物质在两相界面上密集的现象 吸附剂 凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质 一般是固体或液体 常用的是固体吸附剂 能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物 吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力 其特点是可逆的 吸附层析通常采用柱型装置 将吸附剂装在吸附柱中 装置成吸附层析柱 层析时 欲分离的混合溶液自柱顶加入 当样品液全部进入吸附层析柱后 再加入洗脱剂解吸洗脱 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用 解吸作用 的差异进行分离 在洗脱时 层析柱内不断发生解吸 吸附 再解吸 再吸附的过程 固体表面的吸附理论以郎格茂的吸附理论较为著名 他认为 在固体内部各个原子 或原子团 的吸引力可以平均地分配到周围原子或原子团上去 从而使吸引力场成为饱和平衡的状态 但在表面的各个原子或原子团的吸引力不能得到饱和 还有一面伸向空间 能够吸附住空间中与它邻近的其他分子 这种化合价力的剩余力量就是吸附剂吸附力的本质 2洗脱方法 溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法 溶剂洗脱法 是采用单一或者混合的溶剂进行洗脱的方法 是目前应用最广泛的方法 置换洗脱法 前缘洗脱法 所用的洗脱液是置换洗脱液 置换洗脱液中含有一种吸附力比被吸附组分更强的物质 称为置换剂 当用置换洗脱剂冲洗层析柱时 置换剂取代了原来被吸附组分的位置 使被吸附组分不断下向移动 经过一段时间之后 样品中的各组分按吸附力从强到弱的顺序先后流出 最后流出的是置换剂本身 是连续向吸附层析柱内加入欲分离的混合溶液 即所用的洗脱液为含有各组分的混合液本身 常用来吸附酶的吸附剂有硅藻土 活性氧化铝 磷酸钙胶 羟基磷灰石 活性炭等 常用的洗脱剂有 石油醚 环己烷 四氯化碳 甲苯 乙醚 氯仿 丙酮 乙醇 甲醇等 吸附剂来源丰富 价格低廉 可再生 吸附设备简单 3吸附剂 二分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同 而使各组分分离的方法 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时 该溶质在两项溶剂中的浓度的比值 在层析条件确定后 层析系数是一常数 在分配层析中 通常采用一种多孔性固体支持物 如滤纸 硅藻土 纤维素等 吸着一种溶剂为固定相 另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动 称为流动相 溶质在两相之间进行连续的动态分配 1 纸上层析 以滤纸为支持物的分配层析 组成滤纸的纤维素是亲水物质 能形成水相和展层溶剂的两相系统 被分离物质在两相中的分配保持平衡关系 纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析 2 薄层层析 是将吸附剂 载体或其他活性物质 如纤维素 硅胶 离子交换剂 氧化铝或聚酰胺等 均匀涂铺在平面板 如玻璃板 塑料片 金属片等 上 形成薄层 常用厚度为0 25毫米左右 后 在此薄层上进行层析分离的分析方法 薄层层析较纸层析优越在于分辨高 展层时间短 是利用离子交换剂上的可解离基团 活性基团 对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法 三 离子交换层析 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质 通过在不溶性高分子物质 母体 上引入若干可解离基团 活性基团 而制成 作为不溶性母体的不溶性物质通常有苯乙烯树脂 酚醛树脂 纤维素 葡聚糖 琼脂糖等 按活性基团的性质不同 离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂 酶分子具有两性性质 所以可用阳离子交换剂 也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化 1 离子交换剂的选择与处理 1 离子交换剂的类型 强酸性阳离子树脂这类树脂含有大量的强酸性基团 如磺酸基 SO3H 容易在溶液中离解出H 故呈强酸性 树脂离解后 本体所含的负电基团 如SO3 能吸附结合溶液中的其他阳离子 这两个反应使树脂中的H 与溶液中的阳离子互相交换 弱酸性阳离子树脂这类树脂含弱酸性基团 如羧基COOH 能在水中离解出H 而呈酸性 树脂离解后余下的负电基团 如R COO R为碳氢基团 能与溶液中的其他阳离子吸附结合 从而产生阳离子交换作用 这种树脂的酸性即离解性较弱 在低pH下难以离解和进行离子交换 只能在碱性 中性或微酸性溶液中 如pH5 14 起作用 强碱性阴离子树脂这类树脂含有强碱性基团 如季胺基 亦称四级胺基 NR3OH R为碳氢基团 CH3 能在水中离解出OH 而呈强碱性 这种树脂的正电基团能与溶液中的阴离子吸附结合 从而产生阴离子交换作用 弱碱性阴离子树脂含有弱碱性基团 如伯胺基 亦称一级胺基 NH2 仲胺基 二级胺基 NHCH3 或叔胺基 三级胺基 N CH3 2 它们在水中能离解出OH 而呈弱碱性 这种树脂的正电基团能与溶液中的阴离子吸附结合 从而产生阴离子交换作用 离子交换纤维素 在交换纤维素中 最常用的是DEAE纤维素和CM纤维素 离子交换交联葡聚糖 2 离子交换剂的选择a 强 弱离子交换剂的选择 强型 适用的pH范围广 制备无离子水弱型 适用的pH范围窄 分离生物大分子物质b 阴 阳离子交换剂的选择 酶的稳定性若pI稳定 蛋白质带负电荷 用阴离子交换剂 3 离子交换剂的处理 阳离子交换树脂的预处理步骤首先用清水对树脂进行冲洗 最好为反洗 洗至出水清澈无混浊 无杂质为止 而后用4 5 的HCl和NaOH在交换柱中依次交替浸泡2 4小时 在酸碱之间用大量清水淋洗 最好用混合床高纯度去离子水进行淋洗 至出水接近中性 如此重复2 3次 每次酸碱用量为树脂体积的2倍 最后一次处理应用4 5 的HCl溶液进行 用量加倍效果更好 放尽酸液 用清水淋洗至中性即可待用 阴离子交换树脂的预处理步骤首先用清水对树脂进行冲洗 最好为反洗 洗至出水清澈无混浊 无杂质为止 而后用4 5 的NaOH和HCl在交换柱中依次交替浸泡2 4小时 在碱酸之间用大量清水淋洗 最好用混合床高纯度去离子水进行淋洗 至出水接近中性 如此重复2 3次 每次酸碱用量为树脂体积的2倍 最后一次处理应用4 5 的NaOH溶液进行 用量加倍效果更好 放尽碱液 用清水淋洗至中性即可待用 2离子交换层析的基本操作 1 层析柱和装柱离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱 离子交换用的层析柱一般粗而短 不宜过长 直径和柱长比一般为1 10到1 50之间 层析柱安装要垂直 装柱时要均匀平整 不能有气泡 装柱方法有干法和湿法装柱两种 2 平衡缓冲液 3 上样 平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定 其次是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合 而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定 上样量也不宜过大 一般为柱床体积的1 5 为宜 以使样品能吸附在层析柱的上层 得到较好的分离效果 树脂交换容量 4 洗脱缓冲液 常用梯度洗脱 通常有改变离子强度和改变pH两种方式 改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度 从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来 而改变pH的洗脱 对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱 阴离子交换剂一般是pH从高到低 由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响 故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱 有线性梯度 凹形梯度 凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式 一般线性梯度洗脱分离效果较好 故通常采用线性梯度进行洗脱 5 洗脱速度 洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果 洗脱速度通常要保持恒定 一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好 但洗脱速度过慢会造成分离时间长 样品扩散 谱峰变宽 分辨率降低等副作用 所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度 如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠 则应适当降低洗脱速度来提高分辨率 如果分辨率较好 但洗脱峰过宽 则可适当提高洗脱速度 6 再生 酸碱交替浸泡处理和转型 又称为凝胶过滤 分子排阻层析 分子筛层析等 是指以各种多孔凝胶为固定相 利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术 四凝胶层析 凝胶层析柱中装有多孔凝胶 当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时 大分子物质由于分子直径大 不能进入凝胶的微孔 只能分布于凝胶颗粒的间隙中 以较快的速度流过凝胶柱 较小的分子能进入凝胶的微孔内 不断地进出于一个个颗粒的微孔内外 这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢 从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱 而达到分离的目的 1 凝胶层析的基本原理 凝胶层析的基本概念 外水体积 V0 指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积 也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积 内水体积 Vi 是指凝胶颗粒中孔穴的体积 洗脱体积 Ve 是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 分配系数分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比 对于凝胶层析 分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系 在凝胶层析中 分配系数通常表示为 Ka Ve V0 Vi 当Ka 0 即Ve Vo 说明该组分不能进入凝胶颗粒内部 而只存在于流动相中 完全排阻的大分子 洗脱时最先流出当Ka 1 即Ve Vo Vi 对于 由于它可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部所有微孔 完全渗透的小分子 洗脱时最后流出 分子量介于二者之间的分子 它们的洗脱体积也介于二者之间 排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量 所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部 直接从凝胶颗粒外流出 所以它们同时被最先洗脱出来 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量 大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离 例如SephadexG 50的排阻极限为30000 它表示分子量大于30000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来 2 凝胶的选择和处理 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是指由天然高分子 葡聚糖与交联剂交联而成的凝胶 常见的有两大类 商品名分别为Sephadex和Sephacryl 葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列 Sephadex的主要型号是G 10 G 200 后面的数字是凝胶的吸水率 单位是ml g干胶 乘以10 如SephadexG 50 表示吸水率是5ml g干胶 数字越大的 排阻极限越大 分离范围也越大 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺交联而成 改变丙烯酰胺的浓度 就可以得到不同交联度的产物 聚丙烯酰胺凝胶商品名为Bio GelP 主要型号有Bio GelP 2 Bio GelP 300等10种 后面的数字基本代表它们的排阻极限的10 3 所以数字越大 可分离的分子量也就越大 排阻极限最大的Bio GelP 300为4 105 琼脂糖与琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖 它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的 琼脂糖在100 C时呈液态 当温度降至45 C以下时 多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖 经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶的排阻极限很大 分离范围很广 适合于分离大分子物质 但分辨率较低 凝胶的选择首先要根据分离组分的分子量大小确定一个合适的分离范围 另外一个方面就是凝胶颗粒的大小 颗粒小 分辨率高 但相对流速慢 实验时间长 有时会造成扩散现象严重 颗粒大 流速快 分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果 3 凝胶层析的基本操作 1 层析柱的选择层析柱的长度对分辨率影响较大 长的层析柱分辨率要比短的高 但层析柱长度不能过长 否则会引起柱子不均一 流速过慢等实验上的一些困难 一般柱长度不超过100cm 为得到高分辨率 可以将柱子串联使用 层析柱的直径和长度比一般在1 25 1 100之间 脱盐柱由于对分辨率要求较低 所以一般比较短 2 凝胶柱的鉴定凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀 无纹路 无气泡 另外通常可以采用一种有色的物质 如蓝色葡聚糖 2000 血红蛋白等上柱 观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度 如果色带狭窄 平整 均匀下降 则表明柱中的凝胶填装情况较好 可以使用 如果色带弥散 歪曲 则需重新装柱 3 洗脱液的选择由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用 它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离 所以凝胶层析洗脱液的选择不那么严格 洗脱液的选择主要取决于待分离样品 一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可