莲藕保鲜.doc

嘉兴学院本科毕业论文（设计） 生物与化学工程学院莲藕保鲜技术的研究 一、选题的背景、意义莲藕，原产中国和印度，我国湖南、湖北、浙江、江苏、福建、广东、山东普遍栽培1 ，其富含淀粉、蛋白质、维生素C等成分，其汁多肉嫩、营养丰富，在我国有着悠久的栽培历史2 。莲藕是多年生宿根性草本植物3，洁白脆嫩，味微甜。生食能凉血散瘀，熟食可补心益胃，是我国传统的出口商品。优质鲜藕外观品质是洁白嫩脆。鲜藕采收后表皮及肉质部极易由白变褐色，进而变成黑色，即所谓的褐变,直接影响其感官品质和内在质量，这已成为影响莲藕出口的主要原因4 。褐变是食品中普遍存在的一种变色现象，尤其是新鲜果蔬原料进行加工时或经贮藏或受机械损伤后，食品原来的色泽变暗，这些变化都属于褐变。褐变是导致果蔬品质下降的主要原因之一, 褐变按其发生的机理分为酶促褐变（生化褐变）和非酶促褐变（非生化褐变）两大类5。在一些食品加工过程中，适当的褐变是有益的，如酱油、咖啡、红茶、啤酒的生产和面包、糕点的烘烤。而在另一些食品加工中，特别是水果蔬菜的加工过程，褐变是有害的，它不仅影响风味，而且降低营养价值，因此了解食品褐变的反应机理，寻找控制褐变的途径有着重要的实际意义。莲藕贮期发生的褐变主要是“酶促褐变”。据研究，莲藕贮期促进褐变的酶类主要是多酚氧化酶。莲藕组织中的大量酚类物质，在完整细胞呼吸作用中质子H传递物质的作用下，酚-醌之间保持着动态平衡，因此，褐变发生微弱。但当组织细胞受损后氧气进入，酚类物质在酚酶作用下氧化为邻醌，进而又快速地通过聚合作用形成褐色素或黑色素。醌物质的形成需要酶和氧气，一旦醌形成，以后的聚合与褐变反应就能自动地进行6。莲藕褐变的主要原因是组织中的多酚氧化酶(polyphenol oxidaseEC1. 10. 3. 1. ppo) 将酚类物质氧化成醌，醌再聚合成有色物质，因此莲藕的护色关键在于抑制酶促褐变反应7。 多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。多酚氧化酶是一种对伤害保护性的酶，在体内与体外条件下活力变化有较大差异。 所以通过研究底物浓度、pH、温度以及抑制剂等对莲藕多酚氧化酶影响的研究, 来为鲜切莲藕的防褐及保鲜提供一个理论依据是十分必要的8。二、相关研究的最新成果及动态 2.1 多酚氧化酶提取的研究进展2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。适合需大量制样时使用）将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至18。C的丙酮(wv为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。称取丙酮粉O5 g，加入02 molL，pH为54的预冷磷酸二氢钠柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000rmin离心10min，所得上层清液即为粗酶液。2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性）在钟萝的研究基础上稍作修改：将莲藕洗净，去皮，切碎，加入005molL，pH54的预冷磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液(含5的PVPP)，料液比为1：22，捣碎，搅拌，抽滤。向滤渣中加入005molL，pH54磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(WV为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000rmin离心10rain，所得上清液即为粗酶液。2.1.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入005molL，pH54的预冷磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液(含5的PVPP)，料液比为1：22，捣碎，搅拌，4。C下静置4h，抽滤，所得滤液即为粗酶液。2.2 PPO的分离纯化的最新进展9 取10 下贮藏到第8 天的鲜切莲藕片组织250 g ,首先采用液氮速冻,按1 2质量比例加入经过预冷(4 ) 的011 mol/ L 、pH6.8 的磷酸缓冲液(内含5 % 的PVP) ,在高速组织捣碎机上捣碎,然后于4 下浸提2 h ,用4 层脱脂纱布过滤, 滤液于10 000 r/ min 、4 下离心15min ,上清液即为多酚氧化酶粗酶液。向粗酶液中边搅拌边加入固体硫酸铵至30 %饱和度,4 下静置2 h ,于10 000 r/ min 、4 下离心10 min ,弃沉淀,继续向上清液中加入硫酸铵至70 % 饱和度,4 下静置过夜,然后于10 000 r/min 、4 下离心15 min ,弃上清液,将沉淀用尽量少的011 mol/ L 、p H 值为618 的磷酸缓冲液溶解,得到酶的提取液。然后将酶提取液用011 mol/ L 、p H 618 的磷酸缓冲液透析过夜,中间换透析液2次,然后用amicon 超滤杯浓缩至10 mL 。DEAE-Sepha-rose 层析柱(215 cm 20 cm) 首先用碱、酸和氯化钠分别清洗以后,用011 mol/ L 、p H 值为6.8 的磷酸缓冲液平衡,将前一步骤所得的多酚氧化酶提取液上柱,首先用011 mol/ L 、p H 值为618 的磷酸缓冲液洗脱至A280保持不变时,然后换用含0015mol/ L NaCl 的上述缓冲液从低浓度到高浓度进行离子强度线形梯度洗脱(315 mL/ 管,70 mL/ h) ,然后收集有活性峰的洗脱液。将收集的洗脱液首先加固体硫酸铵至115 mol/ L 的饱和度,然后于10 000 r/ min 、4 下离心10 min ,弃沉淀,上清液准备过柱。PhenylSep harose 6 Fast Flow 疏水柱(2 cm 15 cm) 首先用含115 mol/ L 硫酸铵的011 mol/ L 、p H 618 的磷酸缓冲液平衡,然后将上述上清液上柱,首先用含115 mol/ L 硫酸铵的011 mol/ L 、p H 618 的磷酸缓冲液洗脱至A280 保持不变时,然后换用含0115mol/ L 硫酸铵的上述缓冲液从高浓度到低浓度进行离子强度线形梯度洗脱(315 mL/ 管,70 mL/ h) ,然后收集有活性峰的洗脱液,得到纯化的酶液。2.3 PPO活性的测定最新进展2.31分光光度法测定PPO活性在l cm比色皿中，加入15 mL pH70的磷酸盐缓冲溶液，再加入O1 molL邻苯二酚溶液10mL，迅速加入PPO粗酶液05mL，混匀。在420nm波长处测吸光度，每10 s记录1次吸光度(0)420)随时间的变化值。最后确定30 s和l min时检测，在室温下测定PPO的活性(27)，测定OD420值。以最初直线段的斜率(ODt，卜时间，min)计算酶 活力。一个相对酶活性单位定义为：该酶液在测定条件下每分钟引起吸光度值改变0001所需的酶量。PPO相对活性=各处理组吸光度值同组最佳处理组吸光度值10010。2.4 各种影响多酚氧化酶活性的因素研究2.41 PH对PPO活性的影响莲藕PPO对pH十分敏感，强酸强碱均不利于莲藕PPO进行催化反应。因为莲藕PPO是一种含铜蛋白质，在酸性环境中，酶中的Cu2+被解离出来，使酶失活，而在碱性环境中酶蛋白与Cu2+脱离，成为不溶性氢氧化铜，也能使酶失活，中性PH附近为莲藕PPO活力的最佳保存酸度。汪敏等证实，pH值在68附近时，莲藕PPO表现最高活力，而pH升高至80时，其活力只有最高活力的87；pH降到56附近时，其活力仅为最高活力的45。王三虎等的试验得出pH在26时莲藕的护色效果最佳，这也佐证了前面的结论。所以，低pH值环境抑制PPO活性，有利于莲藕护色。例如，在藕汁加工的前处理时，去皮后的莲藕放置于pH34的食用柠檬酸溶液中，可以明显减缓褐变发生。2.42温度对PPO活性的影响温度对莲藕PPO催化反应的影响较大。若将莲藕切片经清水浸渍后，在低温与常温两种温度条件下贮藏30天，观察其褐变情况。结果表明，常温下褐变度增加了42倍，而低温下只增加了33倍，可见，低温有利于抑制莲藕PPO活力。莲藕中PPO活力的最适温度在30左右；60以上PP0变性失活。随温度降低，PPO活力下降，PPO的温度系数Q10=19。因为莲藕PPO在最适温度才处于完全激活状态，即在最适温度以下，随着温度的增加莲藕PPO的活力也增加。直至最适温度时PPO才表现最大的活力。所以，热处理温度不高，处理时间不足，PPO活力不但不会下降，反而会有所升高。但是，也有人认为莲藕PPO是一种热不稳定酶。在40情况下处理1min即表现出钝化，其相对活力只为96。随着温度的上升，热钝化的速度越来越快。在70处理lm血，酶相对活力下降为45；在95下热处理18s或100下热处理lOs，酶即全部失活。而且，当温度大于50时，在同一温度下，随着处理时间的延长，酶的相对活力下降得越快。2.43 金属离子对PPO活性的影响PPO是一种含铜酶。Richard等认为PP0中的铜是以Cu2+的形式存在，离子间距为3610-8cm，氧是通过与Cu2+形成桥式键结合到酶上，儿茶酚上两个氧基与Cu2+对上的两个Cu2+分别键合，因被活化而发生氧化反应，Cu2+对起活化作用。从理论上说，添加Fe2+等还原性金属离子可将Cu2+还原成Cu+，从而降低PPO活性。有试验表明1.3mg/ml的Fe2+即对马铃薯PPO产生抑制。王三虎等采用1mg/ml的CaCl2溶液对莲藕进行浸泡护色，也取得了很好的效果。向莲藕PPO溶液中加入抑制剂，可使酶中的Cu2+失去活化作用，致使莲藕PP0活力下降。当加入半胱氨酸时，它的巯基与PPO中的Cu2+产生电荷转移作用而形成新的配位体，使原来复合物的几何平面变形，阻碍了其它基团进攻Cu2+，从而降低了PPO的活性11。2.44二氧化氯对PPO活性的影响ClO2 具有消毒、杀菌、防腐、漂白、除臭等多种功效，是世界卫生组织（WHO）和世界粮农组织（FAO）向全世界推荐的A1 级广谱、高效、安全化学消毒剂12。用50 mg/L、100 mg/L 浓度的ClO2 处理鲜切藕片5min、10 min、15 min 后，在贮藏期间能抑制PPO 的活性，减轻褐变，保持较好品质。而10 mg/L 则不起抑制PPO 活性作用。100 mg/L ClO2 处理鲜切藕片10min 抑制PPO 的活性效果最好，能使藕片在4 下一周的时间里保持最佳的感官品质和最轻的褐变度13。2.45磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响抑制剂Vc 与磁场对莲藕PPO 抑制作用的机理不同。Vc 能抑制酶活性是因为其具有还原性,可使酶促反应的中间产物醌还原为酚,起到了间接抑制PPO 活性的作用;磁场引起酶活性的变化是因为磁场引起了酶构象的改变。Vc 对莲藕PPO 的抑制表现为滞后时间随Vc 质量浓度的增加呈现S 型趋势;磁场对莲藕PPO 的抑制表现为反应动力学曲线呈S 型,与别构酶正协同效应所表现的动力学曲线相近14。2.5 莲藕的保鲜研究进展2.5.1 泥土埋藏先用砖块或木板等封围成埋藏坑, 然后一层莲藕一层泥土地堆起56 层后, 再覆盖深10 厘米左右细软带潮、手捏不成团的细泥, 并去掉碎石等杂物。埋藏时, 莲藕要按顺序一排排放齐, 避免折断。如用水泥地板的房室储藏, 需先用木板或竹片垫起10 厘米高的坑底, 形成一个隔层, 底上铺1 层10 厘米厚的细泥土, 再按上法堆码莲藕和覆土, 储藏室每隔15 天消毒1 次。如利用室外露地埋藏时, 应选择地势高而背阳避光的地方, 将泥、 藕相间分层堆成斜坡式或宝塔形, 最后用泥全部覆没,周围挖好排水沟, 遇雨天应及时遮盖。储藏期间应每隔2030 天翻检1 次。2.5.2 泥浆涂藕储藏选用黄土,打碎并去除砂土等杂物, 加水调制成糊状, 然后将整支藕放入其中浸渍, 待藕身均匀裹上泥浆后取出, 装入箱内或草包内, 捆好即可。若泥浆干燥脱落, 可再依上法浸渍1 次。这种方法适于短期储藏和运输销售。2.5.3清水保鲜用清水将藕洗净,再放进容器内, 加满清水, 使藕浸没于水中, 每隔12 天换1 次凉水, 冬季保持水不结冰。此法可保鲜12 个月15。2.5.4 浓盐水储藏取27 份食盐, 加73 份水, 配制成浓盐溶液。将待储的莲藕洗净泥土, 去除藕节, 放入此盐水中, 使莲藕全部浸没在水面以下, 即可长时间保藏。用此法储藏莲藕时, 可保持莲藕洁白, 具有实用、储藏期长的优点, 但存在运输费用高, 食用前需脱盐等弊端。出口莲藕多采用此法。2.5.5 塑料薄膜袋储藏将莲藕清洗干净, 用特克多防腐剂( 500 毫克/ 千克) 浸泡处理1 分钟后取出, 晾干, 装于长110 厘米、宽30 厘米、厚0.03 毫米的聚乙烯塑料袋内, 扎紧袋口16。2.5.6 塑料薄膜真空包装储藏称取定量的保鲜剂, 用定量的水溶解后, 将清洗干净的节藕放入此溶液中浸渍60分钟, 取出晾干明水之后, 装入膜厚0.08 毫米的聚乙烯真空包装袋中, 每袋15 千克不等, 在常温下储藏。储藏期间, 只要包装袋不松动漏气就不需倒动和换袋。两个月后, 储藏的莲藕色泽似新鲜藕。此法操作方便, 经济实用, 适合于超市和对外出口, 若结合低温储藏, 可保鲜45 个月。2.5.7保鲜剂储藏使用的保鲜剂为60 毫克/ 升的焦亚硫酸钠溶液+ 0.15%柠檬酸溶液+ 0.06%氯化钙溶液+ 0.03%明矾液的混合液。储藏时, 将洗净的藕装于有盖的聚乙烯桶内, 加入合液, 将藕淹没, 排气密封, 可保鲜两个月17。2.5.8气调气调包装被认为是当前国际上最有效最先进的果蔬保鲜方法之一4-5，多年来国内外一些学者对鲜切果蔬产品的气调保鲜包装进行研究18。气调是通过调节控制气调贮藏环境中的气体浓度，抑制乙烯等有害气体的积累，有效地抑制呼吸、蒸发、激素作用及微生物的活动延缓生理代谢，推迟后熟、衰老进程和防止腐败变质，从而减少贮藏损失，延长保鲜期，使果蔬更长久地保持新鲜和优质的食用状态19。这就是气调贮藏的原理。这种保鲜技术在国外使用比较多，在其他的蔬菜保鲜技术中，商业气调已经达到40到50，在莲藕保鲜中大部分使用于鲜切藕片中，气调不仅与气体的比例有一定的关系，而且与包装材料也有一定的关系(王清章和李洁，2002)。大部分使用的都是02、C02、N2三种气体。目前不仅有气调包装，还有气调室，这种方法成本比较高，比较难以控制气体的比例，因为在贮藏过程中气体的比例会由于莲藕的呼吸左右而产生变化20。2.5.9沙藏法选择地势高、背风、避雨处, 用细沙铺衬底面, 湿度以手捏成团松开即散为宜, 并在四周挖好排水沟, 码放一层莲藕铺上一层细沙。如此沙、藕相间, 叠放5层6层, 最上面盖厚约10厘米的湿沙即可。此法一般可保鲜60天左右。另外, 也可在室内用砖或木板围成埋藏坑, 坑内铺上5厘米厚的湿沙, 将挖出带泥的莲藕按顺序排放, 然后层藕层沙, 码5层6层高, 最上面盖厚约5厘米的湿沙即可21。3、 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标3.1 研究内容及其目标由于莲藕中富含酚类、碳水化合物、蛋白质等物质，其制品在加工过程中容易褐变，造成品质变化，贮藏期缩短，严重影响莲藕产品的感官质量，因而，开展莲藕的护色保鲜开发是储存、加工和销售等环节的核心问题。 本课题拟从抑制多酚氧化酶活性着手，对莲藕保鲜技术进行开发研究，找出较好的莲藕保鲜技术。3.2 采取的研究方法通过各种因素如温度、PH等对PPO活性的影响的实验，来确定能抑制PPO活性的一些方法，从而找出较好的莲藕保鲜技术。3.3 课题的研究难点影响多酚氧化酶活性的因素有很多，能抑制多酚氧化酶活性的方法也很多，要通过实验找出最好的既能最大程度抑制多酚氧化酶活性，又能保证最经济且无害健康的方法是本课题难点所在。3.4 实验方案3.4.1 材料 莲藕3.4.2 提取溶剂 交联聚维酮3.4.3 提取方法匀浆浸提法称取莲藕 切碎 加入005molL、pH54的预冷磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液(含5的PVPP) 在高速组织捣碎机上捣碎 4下浸提2 h 用4层脱脂纱布过滤 滤液于10 000 rmin、4下离心15rain 上清液即为多酚氧化酶粗酶液3.4.4 PPO活性的测定分光光度法测定PPO活性依次向试管中加入005molL，pH70磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲溶液15ml和0030molL邻苯三酚10ml，50。C水浴3min，立刻加入05ml PPO粗酶液，摇匀，在420nm波长下进行比色测定，酶液加入后开始计时，每30s记录一次吸光度A值，共记录3min(鲍金勇等，2005)。1个活力单位)定义为在测定条件下lmin引起吸光值改变0001所需的酶量。3.4.5 各因素对PPO活性的影响 通过不同的温度、PH等条件来测PPO的活性，然后得出能抑制PPO活性的条件，从而找出较好的莲藕保鲜技术。3.5 实验试剂及相关仪器高速组织捣碎机，722型分光光度计，高速离心机，01 molL、pH68的磷酸缓冲液，聚维酮等。四、论文详细工作进度和安排五、主要参考文献1徐莉,王庆国.莲藕采后生理生化特性研究J.FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES,2007;33(5):1662 蓝碧锋,张金云. 莲藕采后生理及保鲜技术研究进展A;中国园艺学会第五届学术研讨会C;2002年3 王向阳,姜丽佳,王忠英. 莲藕的酶促褐变及其贮藏中褐变的控制J.农业工程学报，2009,25（4）：2764闫瑞香,张华云,高海燕等. 莲藕保鲜技术研究J.STORAGE&PROCESS,2001;1(6):85 罗金国,李洁,王清章. 鲜切莲藕片的防褐变研究J. 食品研究与开发,2006,27(6):75-766张有林,朱芬.莲藕贮期褐变机理与防褐变技术研究J. 食品工业科技,2003,24(1):87-897 黄建韶,田宏现. 莲藕中多酚氧化酶的性质J. 吉首大学学报,2002,23(2):82-848 高愿军,郝亚勤,南海娟等. 莲藕多酚氧化酶酶学性质的研究J. 食品研究与开发,2006,27(7):17-199 潘永贵,陈维信. 鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化J. 食品与生物技术学报,2008,27(3):55-6010 王清章,彭光华,金悠等. 莲藕中酚类物质