免疫组化标准操作规程.doc

石蜡切片免疫组化二步法操作规程基于DAKO Real Envision Detection Kit1. 65烤箱中烤片30min；2. 二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸10min，后三缸涮过）；3. 梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、80%、70%各一缸，依次涮过）；4. 自来水振洗；5. 去离子水浸洗1次；6. 抗原修复；7. PBS振洗三次；8. 3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min；9. PBS振洗三次；10. 一抗4孵育过夜；11. PBS振洗三次；12. 滴加二抗聚合物，室温孵育30min；13. PBS振洗三次；14. 滴加DAB，显微镜下控制显色，去离子水终止显色，记录显色时间；15. 自来水冲洗一次；16. 苏木素复染30sec；17. 自来水清洗一次；18. 盐酸酒精分化5sec；19. 自来水冲洗30min返蓝；20. 梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过）；21. 二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸5min）；22. 中性树胶封片。石蜡切片免疫组化三步法操作规程基于DAKO LSAB2 System-HRP Detection Kit1. 65烤箱中烤片30min；2. 二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸10min，后三缸涮过）；3. 梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、80%、70%各一缸，依次涮过）；4. 自来水振洗；5. 去离子水浸洗1次；6. 抗原修复；7. PBS振洗三次；8. 3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min；9. PBS振洗三次；10. 切片置于湿盒中，滴加封闭血清（白色滴瓶装）室温封闭孵育30min；11. 甩去封闭血清（无需PBS清洗），滴加一抗4孵育过夜；12. PBS振洗三次；13. 滴加二抗（黄色滴瓶装），室温孵育30min；14. PBS振洗三次；15. 滴加HRP试剂（粉色滴瓶装），室温孵育30min；16. PBS振洗三次；17. 滴加DAB，显微镜下控制显色，去离子水终止显色，记录显色时间；18. 自来水冲洗一次；19. 苏木素复染30sec；20. 自来水清洗一次；21. 盐酸酒精分化5sec；22. 自来水冲洗30min返蓝；23. 梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过）；24. 二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸5min）；25. 中性树胶封片。抗原修复（1）抗原修复液：1）pH6.0柠檬酸缓冲液：商品化储存液，1:100稀释，200ml/框；2）pH8.0 Tris-EDTA缓冲液：商品化储存液，1:50稀释，200ml/框；3）pH9.0 Tris-EDTA缓冲液：商品化储存液，1:50稀释，200ml/框；4）胰酶（Trypsin）修复液：商品化储存液，1:5稀释。（2）抗原修复法1） 高压修复：电压力锅设定121，5min，将切片置于抗原修复缓冲液中，放置于压力锅内，保持泄气阀开放；启动电压力锅，待泄气孔有大量蒸汽喷出后，关闭泄气阀；达到保温时间后电压力锅会自动停止，待温度降到80后，开盖取出切片，室温自然放凉。2） 微波修复：抗原修复液置于塑料染色缸中，微波加热至沸腾；将切片置入染色缸中，中火加热2分钟，关火保持2min，重复3次，室温自然放凉。3） 酶修复：切片置于湿盒中，每片滴加100ul胰酶修复液，37孵育30min。2. 3%过氧化氢-甲醇溶液配制：取20ml过氧化氢原液（30%），加180ml甲醇，配制成3%过氧化氢-甲醇溶液200ml。3. DAB配制：DAB原液以稀释液按照1:50稀释，每片滴加50ul。4. PBS配制（pH7.2-7.4, 0.01M工作液）：1） 5000ml：NaCl 42.5g, Na2HPO4.12H2O 14.5g, NaH2PO4.2H2O 1.5g，加400ml去离子水搅拌溶解，去离子水补足体积至5000ml；2） 2